大孔吸附树脂分离纯化红小豆多酚工艺及效果.pdf

第 29 卷 第 23 期 农 业 工 程 学 报 Vol.29 No.23 276 2013年 12月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Dec.2013 大孔吸附树脂分离纯化红小豆多酚工艺及效果 陶 莎1，黄 英1，康玉凡2，辰巳英三3，张 惠1，薛文通1（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100083；3.日本国际农林水产业研究中心，筑波 305-8686）摘 要：为开发利用红小豆加工副产物中的生理活性物质，该研究采用大孔树脂吸附法对煮制红小豆水的多酚类物质进行分离纯化，比较了 5 种不同型号大孔树脂对红小豆多酚的吸附分离效果，从中筛选出 HPD 600 型树脂作为理想的吸附剂；研究了 HPD 600 树脂对红小豆多酚的吸附等温线，结果表明，该吸附等温线与 Langmuir、Freundlich 函数曲线的拟合程度非常高，且采用 Langmuir 模型的拟合效果略优于 Freundlich 模型。静态和动态吸附、洗脱试验结果表明：样品液浓度、温度、pH 值、乙醇浓度、上样流速及洗脱流速等因素均对 HPD 600 树脂吸附分离红小豆多酚有影响。较理想的工艺参数为：30是较适宜的静态吸附温度；保持煮制红小豆水本身的多酚浓度 0.96 mg/mL 和 pH 值 6.8，上样体积 200 mL，上样流速 1.0 mL/min 进行动态吸附；吸附饱和平衡后，采用50 mL 60%乙醇溶液，以 1.5 mL/min 的流速进行动态洗脱。依此得到的红小豆多酚纯化液，其总酚含量和总抗氧化能力均有显著提高，约为纯化前的 2.2 倍。关键词：树脂，吸附，工艺，红小豆水，多酚，抗氧化作用 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2013.23.038 中图分类号：TS201.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6819(2013)-23-0276-10 陶 莎，黄 英，康玉凡，等.大孔吸附树脂分离纯化红小豆多酚工艺及效果J.农业工程学报，2013，29(23)：276285.Tao Sha,Huang Ying,Kang Yufan,et al.Technology of separation and purification and its efficiency of adzuki bean polyphenols with macroporous adsorption resinsJ.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2013,29(23):276285.(in Chinese with English abstract)0 引 言 红小豆是一种高蛋白、低脂肪、营养价值很高的杂粮类食物1，同时又具有清热解毒、消肿排脓、健脾止泻等功效2，素有“粮食中红珍珠”的美誉，在中国得到广泛种植。据国家粮食局发布的中国粮食年鉴记载，2005 年中国红小豆播种面积达2 366 km2，总产量 353 000 t3，居世界首位。目前中国红小豆最主要的用途是作为豆沙、豆馅加工原料，用于制作各种糕点及冷饮4-6。但在工业生产红豆沙、红豆馅的过程中无论是加水蒸煮，还是破碎制沙、洗沙工序，都会产生大量的洗沙水。绝大多数生产企业对此多采取厌氧好氧法进行处理7，虽可在一定程度上减轻对环境的污染，但是煮制红小豆水中所含的没食子酸、儿茶素、单宁等多酚类物 收稿日期：2013-01-23 修订日期：2013-10-23 基金项目：国家现代农业产业技术体系（CARS-09-G15）作者简介：陶 莎（1985），女，北京，博士生，农产品加工与贮藏专业。北京 中国农业大学食品科学与营养工程学院，100083。Email： 通信作者：薛文通（1962），男，教授，博士，博士生导师，农产品加工与贮藏专业。北京 中国农业大学食品科学与营养工程学院，100083。Email： 质并没有得到充分利用，同时对企业污水处理的能力提出很高要求。因此研究红豆沙加工副产物的综合利用方法不仅可以使原料资源得到充分利用，同时可以提高企业的经济效益。经大量查阅资料发现，迄今为止，关于红小豆加工副产物开发利用的报道多为日本的专利文献，中国及世界上其他国家关于这方面的研究报道极少。早在 1987 年，Honten8将加工红豆沙产生的废弃物与无机氮源、水混合，用酵母进行发酵和自动代谢反应，制备出一种液态调味料，创造了甜食加工废弃物的应用新方法。李春阳9于 1991 年对某豆沙厂生产豆沙后所剩的废水进行了分析，并对其利用做了初步探索和研究。豆沙水经加压蒸煮，去除豆腥味和胀气因子后，加入甜味剂、酸味剂，再经高压均质使悬浮微粒均匀分散在水中不沉淀，调节酸度后，灌装，高温短时灭菌，得到具有独特风味和外观的小豆汤饮料。Shokken10于1994年将红豆馅制备过程中产生的副产物混合加入饼干或蛋糕等甜食中，从而使其得到了有效的利用。Ken11以豆沙废弃物为原材料，与米糠等调和制成人工栽培蘑菇品种的培养基，用这种含有豆沙废弃物的培养基质栽培出的蘑菇品第 23 期 陶 莎等：大孔吸附树脂分离纯化红小豆多酚工艺及效果 277 质好、产量高、价格便宜。Nakano 等12从红豆沙或红小豆加工过程产生的废液中，经去除不溶性物质和减压浓缩，得到一种含有用物质的浓缩液，该有用物质具有出色的自由基清除能力、抗氧化功能，并能提高食物的营养价值，可用于食品和药品中，用于高血脂、癌症、过敏、糖尿病、脂肪肝和代谢综合征的预防和治疗。目前常用的多酚类物质分离纯化方法主要包括大孔树脂吸附法、膜分离技术及逆流色谱技术等。其中大孔树脂吸附法因其具有选择性好、吸附容量大、吸附速度快、生产效率高、解吸容易、溶剂用量少、成本低且操作简便易行，树脂可再生重复利用等优点，已在工业化制备天然产物中得到广泛应用13。虽然采用大孔树脂分离纯化多酚类物质的研究已有大量报道，但以苹果14、葡萄15、枣类等16的研究居多，鲜见红小豆或煮制红小豆水中多酚类物质分离纯化的报道。张铁英等17采用大孔吸附树脂进行红豆多酚的提取，取得了较理想效果。徐忠等18证实红豆皮色素在 AB-8 大孔树脂上的吸附为多分子层吸附，吸附平衡时间约为120 min，吸附效率随色素溶液浓度的提高而增加。本文采用大孔树脂吸附法对工业生产红豆沙洗沙过程中产生的废水进行处理，以期分离纯化得到多酚类物质。文章分别比较了 5 种大孔树脂对红小豆多酚的吸附分离效果，从中筛选出最佳吸附树脂类型；并通过静态、动态吸附和解吸试验，研究了红小豆多酚在最佳大孔吸附树脂上的吸附特性，得到其吸附动力学曲线、吸附等温线以及动态吸附、解吸曲线等；同时研究了温度、浓度、pH 值、流速等因素对大孔树脂吸附分离红小豆多酚的影响，确定了红小豆多酚分离纯化的工艺参数。本研究为从工业生产红豆沙过程中产生的废水中回收红小豆多酚提供了一种新的生产工艺，为进一步提高红小豆的附加价值、工业化生产红小豆多酚提供新的解决途径。1 材料与方法 1.1 材料与仪器 1.1.1 材料 红小豆：北京美廉美超市（学清路店）。大孔树脂：HPD 600 型，沧州宝恩吸附材料科技有限公司；NKA-9 型、D4020 型、AB-8 型、S-8型，天津市海光化工有限公司。1.1.2 仪器与试剂 T6 新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；MA 150 水分测定仪（德国赛多利斯集团）；MS2 旋涡混合器（江苏金坛市科通实验仪器厂）；层析柱（10 mm110 mm，上海锦华层析设备厂）。福林酚试剂（北京索莱宝科技有限公司）；没食子酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；总抗氧化能力测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；其他试剂均为国产分析纯。表 1 大孔吸附树脂的物理参数 Table 1 Physical properties of resins 树脂类型 Resin type外观特征 Appearance characteristic 极性Polarity 粒径范围 Range of particle size/mm 比表面积Specific surface area/(m2 g-1)平均孔径Average pore diameter/S-8 黄色不透明球状极性0.3151.25 100120280300HPD 600 白色不透明球状极性0.31.2 55060080 D4020白色不透明球状非极性 0.31.25 540580100105AB-8白色不透明球状弱极性 0.31.25 480520130140NKA-9白色不透明球状极性0.31.25 250290155165注：以上信息由大孔树脂生产厂家提供。Note:Above information is provided by macroporous resin manufacturers.1.2 试验方法 1.2.1 煮制红小豆水的制备 称取 200 g 红小豆，洗净、沥干，加入 1 200 mL自来水，大火煮沸后，保持沸腾 30 min，收集汤液；重新加入 800 mL 水，大火煮沸后，改小火煮制30 min。收集、合并 2 次煮豆水，混匀。静置冷却后，取上清液备用（红豆沙煮制工艺由廊坊占祥粮油食品有限公司提供，在实验室中制备得到）。1.2.2 样品液的制备 将制备好的煮制红小豆水置于离心管中，3 500 r/min 离心 10 min；将上清液用布氏漏斗抽滤两次，取滤液备用。根据试验需要，用蒸馏水稀释配制成不同多酚浓度的样品溶液；用 0.01 mol/L NaOH 及 0.01 mol/L HCl 调至所需 pH 值。1.2.3 树脂的预处理 将适量大孔树脂用 95%乙醇浸泡 24 h，对其进行初步除杂，并使其充分溶胀；之后用 95乙醇淋洗，直至洗出液加适量水后无白色浑浊现象出现时止；再用去离子水洗至中性无醇，滤出树脂，滤纸吸干多余水分，即可使用。1.2.4 最佳树脂类型的选择 1）吸附量的计算 准确称取预处理后的湿树脂 0.50 g，置于250 mL 具塞三角瓶中，加入煮制红小豆水（多酚浓度为 C0）的 10 倍稀释液 50 mL，置恒温水浴振荡器上，30、120 r/min 振荡 24 h，期间每隔一定时间从上清液中取样，测定溶液中剩余多酚浓度 C1。根据公式（1）计算吸附量19 01()sCCVQM=（1）农业工程学报 2013 年 278 式中，QS 为吸附量，mg/g；C0为吸附前溶液初始多酚质量浓度，mg/mL；C1为吸附后溶液剩余多酚质量浓度，mg/mL；V为溶液体积，mL；M为树脂质量，g。2）解析率的计算 将充分吸附24 h后的树脂取出，过滤，滤出的树脂置于250 mL具塞三角瓶中，加入体积分数为70%的乙醇50 mL，置恒温水浴振荡器上，30、120 r/min振荡，每隔一定时间取少量解吸液，测定其多酚浓度C2。根据公式（2）计算解吸率20 2100%CVDW=（2）式中，D为解吸率，%；C2为解吸液多酚质量浓度，mg/mL；V为解吸液体积，mL；W为多酚吸附总质量，mg。1.2.5 静态吸附、解吸试验 1）吸附等温线 准确称取6份预处理过的湿树脂各0.50 g，分别置于250 mL具塞三角瓶中，加入不同浓度的煮制红小豆水样品液，30、120 r/min下恒温水浴振荡24 h后，从上清液中取样测定溶液中剩余多酚含量，计算不同浓度下树脂对多酚的吸附量。并以平衡浓度为横坐标，吸附量为纵坐标，绘制吸附等温线。2）温度、样品液浓度对吸附量的影响 准确称取6份预处理过的湿树脂各0.50 g，分别置于250 mL具塞三角瓶中，加入不同浓度和体积（多酚总量相同）的煮制红小豆水样品液，于25、120 r/min下恒温水浴振荡吸附24 h后，测定样品液剩余多酚含量，计算树脂吸附量。其余操作完全相同，分别于30、35温度下恒温水浴振荡吸附，研究不同温度对树脂吸附量的影响。3）pH值对吸附量的影响 煮制红小豆水样品原液（pH值=6.8）用0.01 mol/L NaOH和0.01 mol/L HCl分别调节pH值至2.5、4.5、8.5、10.5。准确称取5份预处理后的湿树脂各0.50 g，分别置于250 mL具塞三角瓶中，加入不同pH值（包括样品液原始pH值6.8）的煮制红小豆水15 mL，于30、120 r/min下恒温水浴振荡吸附24 h后，测定剩余多酚含量，计算树脂吸附量。研究不同pH值对树脂吸附量的影响。4）乙醇体积分数对静态解吸率的影响 准确称取7份预处理后的湿树脂各0.50 g，分别置于250 mL具塞三角瓶中，加入已知多酚浓度的煮制红小豆水样品液25 mL，于30、120 r/min下恒温水浴振荡吸附24 h后，测定样品液剩余多酚浓度，计算树脂多酚吸附量。将吸附平衡的树脂取出，过滤，滤出的树脂置于250 mL具塞三角瓶中，分别加入体积分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液50 mL，于30、120 r/min恒温水浴振荡解吸24 h后，测定解吸液中多酚浓度，计算解吸率。比较不同体积分数乙醇溶液的静态解吸效果。1.2.6 动态吸附、洗脱试验 1）动态吸附曲线 称取筛选出的预处理后的湿树脂5.0 g，湿法装入10 mm110 mm的层析柱中，平衡一段时间后，煮制红小豆水以1.0 mL/min的流速进行上样吸附，收集流出液，测定不同体积流出液中的多酚浓度。以流出液体积为横坐标，流出液多酚浓度为纵坐标，绘制动态吸附曲线。2）动态洗脱曲线 树脂吸附饱和后，用少量蒸馏水洗去树脂表面的杂质，然后用60%乙醇溶液以1.0 mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，测定不同体积洗脱流出液中的多酚浓度。以流出液体积为横坐标，流出液多酚浓度为纵坐标，绘制动态洗脱曲线。3）上样流速对吸附量的影响 称取预处理后的湿树脂5.0 g，湿法装柱，平衡后，将多酚浓度为0.96 mg/mL的煮制红小豆水，分别以0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min的流速进行上样吸附，收集流出液，测量流出液的体积及其多酚浓度，计算不同上样流速条件下树脂对多酚的吸附量。4）乙醇洗脱流速对解吸率的影响 5.0 g湿树脂置于烧杯中，加入多酚浓度为0.96 mg/mL的煮制红小豆水样品液200 mL，室温静置吸附24 h后，测定样品液中剩余多酚含量，计算吸附量。湿法装柱，用少量蒸馏水洗去树脂表面杂质，然后用60%乙醇溶液分别以0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，测量洗脱液的体积及其多酚浓度，计算不同洗脱流速条件下的动态解吸率。1.2.7 大孔树脂对红小豆多酚的纯化效果 将纯化前的煮制红小豆水原液、纯化后的红小豆多酚乙醇洗脱液，均用体积分数60%的乙醇溶液稀释10倍。取稀释液上清液于200600 nm波长范围内进行光谱扫描。同时，采用Folin-Ciocalteu（FC）法测定二者的总酚含量，即1 mL样品稀释液，加入20%FC试剂5 mL，15%Na2CO3溶液2 mL，混匀，蒸馏水定容至10 mL，室温反应50 min后，于770 nm波长处测定吸光度，依据没食子酸标准曲线计算出红小豆多酚含量。之后使用总抗氧化能力（total antioxidative capacity，T-AOC）测定试剂盒对纯化前后红小豆液体进行测定，研究纯化对总抗氧化能力的影响，确定大孔吸附树脂的纯化效果。第 23 期 陶 莎等：大孔吸附树脂分离纯化红小豆多酚工艺及效果 279 2 结果与分析 2.1 最佳树脂类型的筛选 2.1.1 不同树脂对红小豆多酚的吸附性能 5种不同型号的大孔树脂，加入煮制红小豆水稀释液进行静态吸附，于不同时间取样测定剩余多酚浓度，并计算树脂多酚吸附量。以时间为横坐标，吸附量为纵坐标，绘制不同树脂的静态吸附动力学曲线，如图1所示。注：不同型号树脂于30、120 r/min 恒温水浴振荡吸附24 h 后测定吸附量。Note:The different type of resin has been put in constant temperature water bath at 30,120r/min for 24h,and then adsorption capacity was determinated.图 1 不同型号树脂的静态吸附动力学曲线 Fig.1 Static absorptive dynamics curves of different types of resins 由图1可知，5种树脂均能在短时间内吸附较多的红小豆多酚类物质，随着时间的增加，吸附速率变得缓慢，吸附量逐渐达到饱和，12 h左右基本达到吸附平衡。不同型号树脂对红小豆多酚的吸附量有所差异。其中，S-8树脂的吸附量最大，达12.6 mg/g；其次为HPD 600，其吸附量为9.4 mg/g；D4020、AB-8的吸附量分别为8.9、8.1 mg/g；而NKA-9树脂的吸附量最低，仅为7.5 mg/g。这一现象说明，大孔树脂对红小豆多酚类物质的吸附存在一定的选择性。结合5种树脂的物理性质（表1），不难发现多酚吸附量与树脂极性关系不大，可能与树脂的比表面积及平均孔径有关。说明大孔树脂对红小豆多酚的吸附主要是利用多孔网状结构及高比表面积形成的分子筛作用，而不是树脂与多酚物质之间的范德华力或氢键13,21。一般认为，树脂的吸附量随着比表面积的增大而增大，而除S-8以外，其余4种型号树脂也的确呈现此种趋势，但是S-8的比表面积是5种树脂中最小的，吸附量却是最大的，说明吸附还与树脂的孔径有关，S-8树脂的孔径更有利于多酚物质进入到树脂中去。2.1.2 不同树脂对红小豆多酚的解吸性能 吸附饱和的5种树脂，加入70%乙醇溶液于30、120 r/min转速进行振荡解吸，在不同时间取样测定解吸液中多酚浓度，计算解吸率。以时间为横坐标，解吸率为纵坐标，绘制不同树脂的静态解吸曲线（图2）。注：加入体积分数70%的乙醇50 mL，于30恒温水浴、120 r/min振荡解吸。Note:Resin with the volume fraction of 70%ethanol 50 mL was desorbed in the 30,120 r/min constant temperature water bath.图 2 不同型号树脂的静态解吸曲线 Fig.2 Static desorption curves of different types of resins 由图2可知，不同型号树脂对红小豆多酚的解吸性能存在一定差异，主要表现在解吸速率以及红小豆多酚解吸率等方面。HPD 600树脂解吸速率最快，1 h内的解吸率即可高达72.34%，其最大解吸率为79.98%；其次是AB-8和NKA-9，最大解吸率分别为77.38%、67.74%，解吸平衡时间均为4 h左右；D4020树脂对红小豆多酚的解吸率随时间呈现明显的上升趋势，约6 h后达到解吸平衡，最大解吸率为64.59%；S-8大孔树脂的极性最强，因而解吸效果最差，即使解吸8 h后，多酚解吸率仍仅为20.17%。说明除S-8以外，其余4种型号的大孔树脂均具有较好的解吸性能，能在较短时间内将大部分红小豆多酚物质洗脱下来。综合考虑吸附量和解吸率2个参数，5种不同型号的大孔树脂中，HPD 600型大孔树脂对煮制红小豆水中的多酚类物质不仅具有较强的吸附能力，而且解吸率高、洗脱容易，是吸附分离红小豆多酚类物质的最佳树脂类型，故以下试验选取HPD 600大孔树脂作为吸附剂，进一步研究其对红小豆多酚的分离纯化效果。2.2 静态吸附、解吸试验 2.2.1 红小豆多酚在 HPD 600 大孔树脂上的吸附等温线 红小豆多酚在HPD600大孔树脂上的吸附等温线如图3所示，由图可知随着样品溶液中多酚浓度的增加，树脂对多酚类物质的吸附量也在逐渐增大，当多酚浓度增加到一定程度后，吸附量增长曲线渐趋平缓。农业工程学报 2013 年 280 注：于 30、120 r/min 恒温水浴振荡吸附 24 h 后测定吸附量 Note:HPD 600 resins have been put in constant temperature water bath at 30,120r/min for 24 h,and then adsorption capacity was determinated.图 3 HPD 600 大孔树脂对红小豆多酚的吸附等温线 Fig.3 Adsorption isotherm of HPD 600 resin for polyphenols from adzuki beans 采用Langmuir和Freundlich模型22方程式对上述吸附等温线进行非线性曲线拟合（图4）。结果HPD 600树脂对红小豆多酚的吸附等温线与Langmuir、Freundlich函数的曲线均较一致，且采用Langmuir模型的拟合效果（R2=0.9986）略优于 Freundlich模型（R2=0.9943）（表2）。此外，根据Langmuir模 型 计 算 出 的 最 大 饱 和 吸 附 量80.9 mg/g略高于图3吸附等温线中的实际最大吸附量77.8 mg/g，这可能是因为Langmuir属于单分子层吸附模型，而实际吸附系统中并非理想的单分子层吸附，可能同时具有部分的多分子层吸附23。注：于 30、120 r/min 恒温水浴振荡吸附 24 h 后测定吸附量 Note:HPD 600 resins have been put in constant temperature water bath at 30,120r/min for 24h,and then adsorption capacity was determinated.图 4 吸附等温线的非线性回归拟合曲线 Fig.4 Non-linear regression curves of experimental data for sorption isotherm 表 2 红小豆多酚吸附模型 Langmuir 和 Freundlich 函数中各参数估算值 Table 2 Estimated parameters of Langmuir and Freundlich models for adsorption of polyphenols from adzuki beans 参数 Parameter 方程模型 Equation model 函数关系式 Functional relation KL aL Qm KF bF Correlation coefficient(R2)Langmuir qs=1189.84Cs/(1+14.707Cs)1189.84 14.7072 80.9018-0.9986 Freundlich qs=75.5791Cs0.1375-75.5791 0.1375 0.9943 注：qs 为单位质量树脂所吸附的溶质浓度；Cs 为平衡时溶液中溶质的浓度；KL为液相传质系数；aL为吸附解吸速率常数的比值；Qm为完全被单分子层覆盖时树脂的最大吸附能力；KF为吸附能力；bF为吸附强度。Note:qs is the solute concentration of unit quality resin;Cs is the concentration of solutes in balance;KL is liquid-phase mass transfer coefficient;aL is the ratio of adsorption rate constant and desorption rate constant;Qm is the maximum adsorption capacity of resin;KF is adsorption capacity;bF is adsorption strength.2.2.2 温度、样品液浓度对吸附量的影响 预处理后的湿树脂，加入不同多酚浓度的煮制红小豆水样品液，分别于25、30、35温度下进行恒温水浴振荡吸附，研究不同温度、不同样品液浓度对树脂吸附量的影响。结果见图5。由图5中可以看出，不同温度下，树脂吸附量表现出相同的变化趋势，即随样品液中多酚浓度的增加而增大，这种现象可能是由于样品液中较高的多酚浓度，增加了多酚类物质分子与树脂接触的机会，从而导致树脂对多酚的吸附增多。此外图5还说明，温度对HPD 600大孔树脂的吸附也有一定影响。在试验所选的3个温度水平中，30时的吸附量最大，其次是35，25时的吸附量最小。这可能是因为大孔树脂的吸附原理主要是物理吸附作用，低温不利于吸附，并且吸附过程会释放一定热量，随着温度的升高，多酚分子动能增加，不易滞留在大孔树脂表面，反而降低了吸附量。因此，30是较适宜的静态吸附温度。注：于 120 r/min 恒温水浴振荡吸附 24 h 后测定吸附量 Note:HPD 600 resins have been put in constant temperature water bath at 120 r/min for 24 h,and then adsorption capacity was determinated.图 5 温度、样品液浓度对吸附量的影响 Fig.5 Influence of sample solution concentration and temperature on absorption capacity 2.2.3 pH 值对吸附量的影响 pH值对吸附量的影响如图6所示。图中过低、第 23 期 陶 莎等：大孔吸附树脂分离纯化红小豆多酚工艺及效果 281 过高的pH环境均不利于HPD 600树脂对红小豆多酚的吸附。在pH值较低的情况下，HPD 600树脂对红小豆多酚的吸附量随pH值的增大而增加，pH值=6.8时，吸附量最大，达到118.4 mg/g；pH值6.8以后，随着pH值的增加，HPD 600树脂对红小豆多酚的吸附能力急剧下降。注：将HRP600树脂于30、120 r/min恒温水浴振荡吸附24 h后测定吸附量。Note:HPD 600 resins have been put in constant temperature water bath at 120 r/min for 24h,and then adsorption capacity was determinated.图 6 样品液 pH 值对吸附量的影响 Fig.6 Influence of pH value of sample solution on absorption capacity 出现这种变化趋势的原因可能是因为煮制红小豆水中除含有少量没食子酸、原儿茶酸等有机酸以外，更多的是煮制过程中豆皮溶解出的花青素类多酚物质，该类物质稳定性不高，易受pH值的影响而变性。因此，近中性的样品原液调节为酸性或碱性溶液后，花青素类物质的性质发生改变而不易被大孔树脂吸附，表现为树脂吸附量的降低。因此，HPD 600树脂在分离纯化煮制红小豆水中的多酚类物质时，保持其本身的pH值（约7.0）为宜，无需进行pH值的调节。2.2.4 乙醇体积分数对静态解吸率的影响 通常来说，丙酮、甲醇、乙醇等极性溶剂对多酚类物质均有较高的解吸率24-25，洗脱效果较好的，但考虑到红小豆多酚将主要应用于食品及医药行业，因此本试验选用价廉易得、安全无毒性的乙醇作为解吸剂。而不同体积分数乙醇对静态解吸效果的影响如图7所示。由图可以看出乙醇体积分数对红小豆多酚解吸率具有较大影响，随着乙醇体积分数的增加，解吸率逐渐升高，当乙醇体积分数为60%时，解吸率达到最大，为77.8%；但继续增加乙醇体积分数，解吸率反而明显下降。这可能是由于煮制红小豆水中的多酚均为水溶性物质，其解吸需要一定的含水环境；当乙醇体积分数过低时因极性溶剂含量不足，从而导致较低的解吸率；而当乙醇体积分数过高时，解吸剂中的含水量较少，红小豆多酚同样难以溶出，因此解吸率也较低。此外，乙醇体积分数过高，不仅增加成本，挥发性也增大，生产操作上较难控制。所以，综合考虑成本及解吸效果，宜选用60%乙醇溶液作为红小豆多酚的解吸剂。注：将树脂于 30、120 r/min 下恒温水浴振荡解吸 24 h。Note:Resins were absorbed in the 30,120 r/min constant temperature water bath for 24 h.图 7 乙醇体积分数对静态解吸率的影响 Fig.7 Influence of ethanol volume fraction on static desorption percentage 2.3 动态吸附、洗脱试验 2.3.1 动态吸附曲线 HPD 600树脂对红小豆多酚的动态吸附曲线如图8所示。由图可知，10 mL流出液时即有少量的多酚泄露，随着流出液体积的继续增大，流出液中多酚浓度呈现匀速、平缓的递增趋势，当流出液体积为200 mL时，基本达到吸附平衡。因此，选用200 mL作为该柱型号条件下的上样体积。注：煮制红小豆水以 0.1 mL/min 的流速进行动态吸附 Note:Hot water extracts of adzuki beans for dynamic adsorption in the flow velocity of 1.0 mL/min.图 8 HPD 600 树脂对红小豆多酚的动态吸附曲线 Fig.8 Dynamic adsorption curve of HPD 600 resin for polyphenols from adzuki beans 该曲线为非理想的“S”形动态吸附曲线；实际上，因吸附树脂及样品溶液各不相同，同时受pH农业工程学报 2013 年 282 值、流速、温度、柱型号等众多因素的影响，动态吸附曲线一般很难呈现理想的对称“S”形曲线。本试验多酚物质发生泄露现象的时间比大多数试验的结果早26，分析原因可能是由于上样速度较快引起的，当流速较快时，料液中部分多酚物质会来不及扩散到树脂内表面就被冲出柱子，导致流出液中过早出现多酚物质。之所以将上样速度定为1 mL/min，是因为此时的HPD 600树脂对红小豆多酚的动态吸附量最高，可以达到95.58 mg/g；降低流速（0.5 mL/min）虽然会使多酚的泄露时间延后，但此时树脂对多酚的吸附量也较低，为74.85 mg/g；相反，如果进一步提高流速，达到1.5 mL/min，此时不仅多酚的溢出时间会更提前，此时树脂对红小豆多酚的吸附量也会下降，综合考虑确定中等上样流速1.0 mL/min为宜（图9）。注：多酚浓度为 0.96 mg/mL 的煮制红小豆水 200 mL，以不同流速进行动态吸附。Note:200 mL hot water extracts of adzuki beans with the polyphenols concentration of 0.96mg/mL for dynamic adsorption in different flow velocity.图 9 上样流速对吸附量的影响 Fig.9 Influence of sample flow on adsorption capacity 2.3.2 动态洗脱曲线 红小豆多酚的动态洗脱曲线，如图10所示。由图可知，流出液体积仅为5 mL时即有少量红小豆多酚被洗脱出，随后，洗脱液中的多酚浓度急剧上升，15 mL左右达到最大值，为5.9 mg/mL；以后 多 酚 浓 度 逐 渐 降 低，25 mL左 右 已 低 于1.0 mg/mL，当洗脱液体积达50 mL时，流出液中的红小豆多酚浓度极低，红小豆多酚基本洗脱完全。因此选用50 mL作为洗脱剂使用体积。该曲线证明，动态条件下HPD 600树脂上吸附的红小豆多酚物质极易被洗脱，且洗脱剂用量少，洗脱峰相对集中、对称，无拖尾现象。2.3.3 乙醇洗脱流速对解吸率的影响 吸附饱和的HPD 600大孔树脂，用少量蒸馏水洗去树脂表面杂质，然后用60%乙醇溶液分别以0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min的流速进行洗脱，结果见图11。从图中可知，各洗脱流速下的解吸率均较高（82.1%89.3%），说明60%乙醇对红小豆多酚的动态洗脱效果也非常好；同时可看出，在一定流速范围内，动态解吸率随乙醇洗脱流速的增大而逐渐升高，1.5 mL/min流速时，解吸率达到最高（89.3%）；进一步增大洗脱流速，导致洗脱剂与多酚没有充分接触、作用的时间即流出柱子，解吸率反而有所下降。因此，乙醇动态洗脱的流速以1.5 mL/min为宜。注：采用体积分数 60%的乙醇溶液，以 1.0 mL/min 流速进行动态洗脱。Note:Using volume fraction of 60%ethanol solution for dynamic desorption in the flow velocity of 1.0 mL/min.图 10 红小豆多酚的动态洗脱曲线 Fig.10 Dynamic desorption curve of polyphenols from adzuki beans 注：采用体积分数 60%的乙醇溶液，以不同流速进行动态洗脱。Note:Using the volume fraction of 60%ethanol solution for dynamic desorption in different flow velocity.图 11 乙醇洗脱流速对动态解吸率的影响 Fig.11 Influence of ethanol flow on dynamic desorption percentage 2.4 HPD 600 大孔树脂对红小豆多酚的纯化效果 将煮制红小豆水原液、红小豆多酚乙醇洗脱液，均用体积分数60%的乙醇溶液稀释10倍，于200600 nm波长范围内进行光谱扫描，二者的吸收曲线如图12所示。同时，采用FC法和T-AOC测定试剂盒，研究纯化前后总酚含量及总抗氧化能力的变化，结果见表3。第 23 期 陶 莎等：大孔吸附树脂分离纯化红小豆多酚工艺及效果 283 注：样品液均用 60%乙醇溶液稀释 10 倍，于 200600 nm 进行光谱扫描。Note:All of the sample solution was diluted 10 times with the volume fraction of 60%ethanol solution,and then was scanned from 200 nm to 600 nm.图 12 红小豆多酚溶液纯化前后的吸收曲线 Fig.12 Absorption curve of adzuki bean polyphenols solution before and after purification 由图12可知，煮制红小豆水原液和红小豆多酚纯化液在200600 nm波长范围内具有几乎完全相同的吸收曲线；并且吸光度峰值均出现在小于400 nm的紫外波长范围内，即280 nm左右，该波长是多酚类物质的特征吸收波长。在该波长下，红小豆多酚纯化液的吸光度约为煮制红小豆水的2.3倍；说明HPD 600大孔吸附树脂对红小豆多酚类物质具有较好的吸附、富集作用。表 3 纯化前后总酚含量和总抗氧化能力的比较 Table 3 Comparison of total phenolics content and total antioxidant activity before and after purification 评价指标 Evaluation index 纯化前 Before purify 纯化后 After