超高压液相色谱-串联质谱法测定虾中硝基呋喃代谢物.pdf

第 4 卷 第 1 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.4 No.1 2013 年 2 月 Journal of Food Safety and Quality Feb.,2013 基金项目:国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(2010AA023001)、北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划项目 Fund:Supported by the National High Technology Research and Development Program of China(2010AA023001)and Beijing Municipal Senior Technical Training Plan in Health System*通讯作者:邵兵,研究员,主要研究方向为食品安全保障技术。E-mail:*Corresponding author:SHAO Bing,Professor,Beijing Center for Disease Control and Prevention,No.16,Hepingli Middle Street,Dongcheng District,Beijing 100013,China.E-mail: 超高压液相色谱-串联质谱法测定 虾中硝基呋喃代谢物 杨 奕,邵 兵*(北京市疾病预防控制中心,食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室,北京 100013)摘摘 要要:目的目的 建立虾中四种硝基呋喃代谢物的超高压液相色谱-串联四极杆质谱(UPLC-MS/MS)分析方法。方法方法 样品经 2-NB 衍生,HLB 固相萃取柱净化、富集;以乙腈5 mmol/L 乙酸铵(含 0.1%乙酸)为流动相,在正离子模式下,采用多反应监测(MRM)方式进行检测。结果结果 四种硝基呋喃代谢物的定量限(LOQ)均为 1.0 g/kg,三个添加水平(1.0、5.0、20.0 g/kg)的平均回收率在 81.6%95.1%之间,相对标准偏差均小于 13.6%。结论结论 本方法适用于虾中污染物残留检测。关键词关键词:硝基呋喃;代谢物;超高压液相色谱-串联质谱;虾 Determination of metabolites of nitrofuran in shrimp using ultra pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry YANG Yi,SHAO Bing*(Beijing Key Laboratory of Diagnostic and Traceability Technologies for Food Poisoning,Beijing Center for Disease Prevention and Control,Beijing 100013,China)ABSTRACT:Objective An analytical method for the detection of four metabolites of nitrofuran in shrimp by ultra-perssure liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry(UPLC-MS/MS)was estab-lished.Methods After derived by 2-NB,the sample extraction was purified by HLB cartridge.The objective compounds were separated using Waters Acquity BEH C18 column with acetonitrile 5 mmol/L ammonium acetate(0.1%acetic acid)as mobile phase and analyzed by UPLC-MS/MS under multiple reaction monitoring mode(MRM).Results The LOQ for four target compounds were 1.0 g/kg.The average recoveries were 81.6%95.1%at the level of 1.0,5.0 g/kg and 20.0 g/kg with the relative standard deviation lower than 13.6%.Conclusion The method is suitable for the detection of residual pollutant in shrimp.KEY WORDS:nitrofuran;metabolite;ultra pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);shrimp 硝基呋喃类药物自 1944 年 5-硝基呋喃被发现并用于抗菌以来,由于其具有抗菌谱广,不易产生耐药性且价格廉价等优点,已经成为一类广泛使用的广谱抗菌药物,除了被用于临床治疗外还被用于家畜及禽类的饲养。呋喃唑酮(furazolidone),呋喃它酮(furmtadone),呋喃西林(nitrofurazone)及呋喃妥因 136 食品安全质量检测学报 第 4 卷 (nitrofurantoin)为硝基呋喃类药物中最常用的药物。它们的代谢产物分别为 3-氨基-2-恶唑烷基酮(3-amino-2-oxazolidinone,AOZ)、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶 唑 烷 基 酮(3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxa-zolidinone,AMOZ)、氨基脲(semicarbazide,SEM)和1-氨基-2-内酰脲(1-aminohydantoin,AHD)。研究表明,硝基呋喃类药物及其代谢产物能使动物组织产生癌变或基因突变,欧盟、美国等国家已规定禁止将该类药物用于动物饲养1。我国于 2002 年开始禁止硝基呋喃类抗生素在动物饲养中使用。由于硝基呋喃在生物体内能迅速被代谢,而它的代谢产物能稳定存在于生物体内,因此可以将硝基呋喃代谢物的残留量作为判定是否使用硝基呋喃的依据。硝基呋喃代谢产物残留检测方法主要有液相色谱法2-4,液相色谱-质谱法5和液相色谱串联质谱法6-8。由于液相色谱法和液相色谱-质谱法的选择性和灵敏度都较液相色谱-串联质谱法差,因此近年来液相色谱-串联质谱法已成为硝基呋喃代谢产物残留检测的主要方法。1 材料与方法 1.1 仪器、试剂和材料 Acquity UPLC 超高压液相色谱仪、Micromass-Quattro Premier XE 质谱仪(美国 Waters 公司);NVEP-116 型氮吹仪;Allegra X-22R 冷冻离心机(美国 Beckman 公司);Milli-Q 超纯水机(美国 Millipore 公司);SA8 涡漩式混合器(英国 Bibby Sterilin 公司);BS110S 电子天平(德国 Sartorius 公司);50 mL 具塞聚乙烯离心管。Oasis HLB 固相萃取(SPE)小柱(3 mL,200 mg,美国 Waters 公司)。标准品 3-氨基-2-恶唑烷基酮(AOZ)、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、1-氨基-2-内酰脲(AHD)、2-NB-AOZ、2-NB-AMOZ、2-NB-SEM、2-NB-AHD 均购自德国 Dr.Ehrenstoffer 公司;同位素内标AOZ-d4、AMOZ-d5、AHD-13C、SEM-13C、2-NB-AOZ-d4、2-NB-AMOZ-d5、2-NB-AHD-13C、2-NB-SEM-13C 均购自 Dr.Ehrenstoffer 公司;2-硝基苯甲醛(2-NBA,纯度99%)购自 sigma 公司;甲醇、乙腈(LC-MS 级,美国 Fisher 公司);纯水(LC-MS 级,美国 J.T.Baker 公司);其他试剂均为分析纯(国药集团北京化学试剂公司)。四种硝基呋喃代谢产物标准储备液:称取适量的四种硝基呋喃代谢产物标准物质,分别用甲醇稀释成1.0 mg/mL的标准储备液,避光保存于20冰箱,可使用六个月。吸取适量四种硝基呋喃代谢物标准储备溶液,用甲醇稀释成不同浓度的混合标准溶液,现用现配。四种硝基呋喃代谢物内标标准储备溶液:称取适量的四种硝基呋喃代谢物内标标准物质,分别用甲醇稀释成 1.0 mg/mL 的标准储备液。避光保存于20冰箱,可使用六个月。吸取适量四种硝基呋喃代谢物内标标准储备溶液,用甲醇稀释成 0.1 g/mL混合标准溶液,现用现配。四种硝基呋喃代谢物衍生物标准储备溶液:称取适量的四种硝基呋喃代谢物衍生物标准物质,分别用甲醇稀释成 1.0 mg/mL 的标准储备液。避光保存于20冰箱,可使用六个月。吸取适量四种硝基呋喃代谢物衍生物标准储备溶液,用甲醇稀释成不同浓度的混合标准溶液,现用现配。四种硝基呋喃代谢物衍生物内标标准储备溶液:称取适量的四种硝基呋喃代谢物衍生物内标标准物质,分别用甲醇稀释成 1.0 mg/mL 的标准储备液。避光保存于20冰箱,可使用六个月。吸取适量四种硝基呋喃代谢物衍生物内标标准储备溶液,用甲醇稀释成 0.1 g/mL 的混合标准溶液,现用现配。2-NB 衍生试剂：称取 0.075 g 2-硝基苯甲醛(2-NB）溶于 10 mL 二甲亚砜中配制成 0.05 mol/L 的2-NB 衍生试剂，现用现配。1.2 样品前处理方法 将虾去皮,充分绞碎,匀质。20以下避光保存。称取已匀浆的样品 1 g(精确到 0.01 g),置于 50 mL 离心管中,加入 10 mL 0.2 mol/L 盐酸溶液和 0.3 mL 2-NB 衍生试剂,涡旋混匀,置于 37 水浴避光振荡衍生 16 h(过夜)。衍生完后,向溶液中加入约 1.0 mL 1 mol/L 氢氧化钠溶液,调 pH 值至 7.27.5。室温10000 r/min 离心 10 min,上清液转入 15 mL 离心管中,通过预先用 3 mL 甲醇和 3 mL 水活化的 HLB 固相萃取柱,3 mL 水淋洗,5 mL 甲醇洗脱,洗脱液用氮气吹干。用 1.0 mL 50%甲醇-水定容,通过 0.22 m滤膜,供液相色谱质谱测定。第 1 期 杨 奕,等:超高压液相色谱-串联质谱法测定虾中硝基呋喃代谢物 137 1.3 LC-MS/MS 方法 分析柱采用 Waters Acquity BEH C18柱(2.1 mm50 mm;1.7 m);柱温:40;流动相:A 液为乙腈,B液为水(含5 mmol/L 乙酸铵和0.1%乙酸);流速:0.2 mL/min;进样量:5 L;梯度洗脱见表 1,标准色谱图见图 1。表 1 梯度洗脱条件 Table 1 Gradient elution condition 时间(min)流动相 A%流动相 B%0.0 10 90 4.0 90 10 5.0 90 10 5.1 10 90 7.0 10 90 质谱检测器采用电喷雾离子源,正离子模式;毛细管电压为 3.0 kV;离子源温度为 100;脱溶剂温度为 400;锥孔气流速和脱溶剂气流速分别为50 L/h 和 800 L/h;多反应监测(MRM)模式下采集数据,具体参数见表 2。1.4 方法学确证 1.4.1 标准曲线 配制系列混合标准溶液,2-NB-AOZ,2-NB-AMOZ,2-NB-SEM 和 2-NB-AHD 的质量浓度分别为 0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100 g/L,内标 浓 度 均 为10.0 g/L。进 样 量 为 5 L,经 LC-MS/MS 测定,以目标化合物的定量离子峰面积与内标峰面积之比Y为纵坐标,待测组分的质量浓度 图 1 标准溶液 MRM 色谱图(10 g/L)Fig.2 MRM chromatograms of standard solution(10 g/L)138 食品安全质量检测学报 第 4 卷 表 2 目标化合物 LC-MS/MS 参数 Table 2 MS/MS parameters for the analysis of target compounds 化合物 母离子 子离子 碰撞能量(eV)锥孔电压(V)2-NB-AMOZ 334.8 290.9*(10)261.9(15)25 D5-2-NB-AMOZ 340.1 296(12)25 2-NB-SEM 209 165.8*(10)192(13)25 C13-2-NB-SEM 211.8 196.4(12)25 2-NB-AHD 249 133.8*(10)103.5(20)25 C13-2-NB-AHD 251.8 133.6(13)25 2-NB-AOZ 236 133.6*(10)103.3(20)25 D4-2-NB-AOZ 239.7 103.5(13)25 注：*为定量离子(the quantitative ion)X 为横坐标,绘制工作曲线,内标法定量。1.4.2 方法的回收率及精密度 在均质的空白鱼肉样品中加入适量的混合标准溶液,使得样品中 AOZ,AMOZ,SEM,AHD 加标浓度分别为 1.0、5.0、20 g/kg,内标 AOZ-d4,AMOZ-d5,SEM-13C,AHD-13C 质量浓度均为 10 g/kg。每个水平设6个平行,计算四种硝基呋喃代谢产物的回收率和相对标准偏差(RSD)。1.4.3 定性和定量 样品中目标化合物色谱峰的保留时间须与相应标准色谱峰的保留时间一致,各目标化合物的质谱定性离子必须出现,应同时包括 1 个母离子和 2 个子离子(见表 2)。待测目标化合物定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于 3(S/N3),定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于 10(S/N10)。1.5 质量控制 实验过程中必须做好严格的质量控制,所有塑料制品均为一次性的,所有玻璃器皿经马弗炉 400 烘烤 4 h。每批样品均应作过程空白,并且每 5 个实际样品之间设定一个溶剂空白样品,用以评价背景污染。2 结果与讨论 2.1 提取净化条件的优化 本实验中样品前处理方法在 GB/T 20752-2006猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 样品前处理方法的基础上作了改进。在 GB/T 20752 中,加入内标以前,用 15 mL 甲醇-水(2:1,v/v)溶液脱脂,在本实验中考虑到后续会有固相萃取小柱的净化过程,因此可以省略脱脂的过程。在固相萃取小柱净化的过程中,根据 GB/T 20752 的方法样品经 2-NB 衍生化后,调 pH 值至 7.4,离心取上清液通过预先用甲醇和水活化的 HLB 固相萃取小柱,将固相萃取小柱抽干,用 5 mL 乙酸乙酯洗脱,收集洗脱液,氮气吹干后用 1 mL 10%乙腈-水溶液定容,上机测定。本研究发现,在上述过程中由于乙酸乙酯与水是不互溶的,在洗脱样品之前 HLB固相萃取小柱是否抽干会直接影响方法的回收率。而在实际操作的过程中,抽干这个步骤非常耗时,同时样品脂肪含量较高时,固相萃取小柱很难彻底抽干,造成回收率降低,同时也会由于每个样品抽干的程度并不完全一致,从而使方法的 RSD 较大。因此,在本研究中,将 HLB 的洗脱溶剂改为甲醇,提高了方法的回收率,同时也降低了方法的 RSD,改善了方法的重复性。2.2 方法的线性及最低定量限 四种硝基呋喃代谢产物衍生物的线性范围为0.5100 g/L,相关系数均大于 0.99,该实验方法测定虾中四种硝基呋喃代谢产物的定量限(LOQ)为 1.0 g/kg,检出限(LOD)均为 0.3 g/kg。GB/T 20752 的方法检出限为 0.5 g/kg,因此与国标方法相比本方法的检出限略低于国标方法的检出限。2.3 方法的回收率及精密度 测定结果见表 3,可以看出,本法测定鱼肉样品中四种硝基呋喃代谢产物的精密度 RSD 13.6%。四种硝基呋喃代谢产物在三个添加水平上的回收率为81.6%95.1%。第 1 期 杨 奕,等:超高压液相色谱-串联质谱法测定虾中硝基呋喃代谢物 139 2.4 实际样品分析 本实验中所用的 30 份虾样品均采自山东济南水产市场,按已建立的方法检测样品中的硝基呋喃代谢产物含量,检测结果见表 4。在所有样品中 AOZ,AMOZ 和 AHD 均未检出,只有 SEM 在部分样品中有检出,含量为 02.14 g/kg。但是由于 SEM 不仅可以由呋喃西林代谢产生,还可以来源于其他的环境污染。例如,SEM 可来源于食品包装材料,面粉改良 表 3 AOZ,AMOZ,SEM 和 AHD 的回收率及精密度 Table 3 Recoveries and the relative standard deviation of AOZ,AMOZ,SEM and AHD 加标浓度(g/kg)1.0 5.0 20 目标化合物 回收率(%)RSD(%)回收率(%)RSD(%)回收率(%)RSD(%)AOZ 89.1 8.67 92.0 10.3 93.2 7.66 AMOZ 90.3 10.5 93.9 6.54 95.1 4.65 SEM 92.8 9.09 94.6 8.04 93.8 7.03 AHD 81.6 4.82 88.7 13.6 90.7 8.05 表 4 实际样品检测结果 Table 4 Results of target drugs in real samples 样品 目标物 检出率%平均值SD(g/kg)最大值(g/kg)最小值(g/kg)AOZ 0%ND ND ND AMOZ 0%ND ND ND SEM 27%0.600.57 2.14 ND 虾(n=30)AHD 0%ND ND ND 剂以及食品加工过程。有文献报道在山东东营潮河入海口邻近海域海水中 SEM 的浓度为 0.1870.6 g/L,沉积物中浓度为 0.2618.9 g/L,生物体内含量为0.826.46 g/L9。因此,对于水产品中 SEM 来源是由于人工饲养时使用了硝基呋喃类药物,还是由于环境污染造成的,有待进一步研究。3 结 论 本研究建立了虾中四种硝基呋喃代谢物的超高压液相色谱-串联质谱检测方法,样品经过衍生、提取、固相萃取净化后,以 LC-MS/MS 方法进行分析。本方法可有效用于虾中硝基呋喃残留的监测。参考文献 1 陈威风,陈敬鑫.肉制品中硝基呋喃类药物残留的研究进展J.肉类研究,2011,25(12):5357.Chen WF,Chen JX.Recent advances in research on nitrofuran residues in meat products J.Meat Res,2011,25(12):5357.2 Conneely A,Nugent A,Keeffe MO.Isolation of bound residues of nitrofuran drugs from tissue by solid-phase extraction with determination by liquid chromatography with UV and tandem mass spectrometric detection J.Anal Ohm Acta,2003,483:91.3 王媛,蔡友琼,贾东芬,等.高效液相色谱法检测水产品中硝基呋喃类代谢物残留量J.分析试验室,2009,28(12):86 90.Wang Y,Cai YQ,Jia DF,et al.Determination of nitrofuran me-tabolite residues in aquatic products by high performance liquid chromatography J.Chin J Anal Lab,2009,28(12):8690.4 葛宝坤,王云凤,常春艳,等.测定鸡肉、水产品中四种硝基呋喃类药物残留量的固相萃取-液相色谱法J.分析测试学报,2003,22(5):9193.Ge BK,Wang YF,Chang CY,et al.Determination of pesticide residues of furaltadon,furacilin,titrofurantoine and furazoli-donum in chicken,fish,shrimp by SPE-HPLC J.J Instrum Anal,2003,22(5):9193.5 林黎明,林回春,刘心同,等.固相萃取高效液相色谱-质谱法测定动物组织中硝基呋喃代谢产物J.分析化学研究简报,2005,33(5):707710.Lin LM,Lin HC,Liu XT,et al.Determination of nitrofuran me-tablolites in animal tissues by high perfprmence liquid chroma-tography-mass spestrometry and study of their residual discipline J.Chin J Anal Chem,2005,33(5):707-710.6 璟王,杨楠,赵晶,等.液相色谱-串联质谱法检测水产品中硝基呋喃类代谢物J.中国卫生检验杂志,2008,18(6):978980.140 食品安全质量检测学报 第 4 卷 Wang J,Yang N,Zhao J,et al.Determination of metabolites of nifuran antibiotics in aqutic products by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry J.Chin J Health Lab Technol,2008,18(6):978980.7 王荣艳,贾丽,贾东芬,等.UPLC-MS/MS 法快速测定水产品中硝基呋喃类代谢物残留J.分析实验室,2010,29(增刊):368370.Wang RY,Jia L,Jia DF,et al.Rapid determination of metabolites of nitrofuran in aquatic product by UPLC-MS/MS J.Chin J Anal Lab,2010,29(Suppl):368370.8 李耀平,林永辉,贾东芬,等.水产品中硝基呋喃代谢物残留快速检测新方法的研究J.分析测试学报,2008,27(7):712717.Li YP,Lin YH,Jia DF,et al.A reserch to establish a new quick determination of nitrofuran metabolite residues in aquatic prod-ucts J.J Instrum Anal,2008,27(7):712717.9 徐英江,孙玉增,宋秀凯,等.潮河口邻近海域氨基脲污染现 状调查研究J.海洋与湖沼,2010,41(4):538542.Xu YJ,Sun YZ,Song XK,et al.Survey of semicarbazide con-tamination in coastal waters adjacent to the chaohe river estuary J.Ocean Limnol Sin,2010,41(4):538542.(责任编辑:赵静)作者简介 杨奕,硕士,助理研究员,主要研究方向为食品检验。E-mail: 邵兵,研究员,主要研究方向为食品安全保障技术。E-mail: