流式细胞分选技术.pdf

流式细胞分选技术流式细胞分选技术一、定义一、定义流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选，能复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离，单次可同时对其中一种到四种特定细胞进行超高速分选纯化、高通量单克隆分选或细胞芯片制备。分选后的细胞能直接用于培养、移植、核酸提取、单细胞PCR 扩增或原位杂交等，可进一步进行细胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同细胞之间的差异化研究。硬件中样本细胞丢弃的比例低于 5%，保证样本中目标细胞的高回收率。【晶莱生物】二、实验原理二、实验原理当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。三、实验流程（以分选有核红细胞为例）三、实验流程（以分选有核红细胞为例）1.采抗凝血 10 ml。2.密度梯度分离单个核细胞层（1）在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。（2）取肝素抗凝静脉血与等量Hanks 液或 RPMI1640 充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000 rpm20 分钟。（3）离心后管内分为三层，上层为血浆和Hanks 液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。（4）用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入倍以上体积的Hanks 液或 RPMI1640，1500 rpm10 分钟，洗涤细胞两次。3.免疫荧光染色将上一步得到的单个核细胞层按110/1 的比例加入异硫氰酸(FITC)标记的 CD71 单克隆抗体(鼠 IgM)，孵育 30 min 后重悬于 0.5 ml PBS 液中进行荧光染色。4.FACS 分选 CD71 阳性细胞。晶莱生物