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人正常食管黏膜上皮细胞的纯化分离和传代培养【摘要】 目的： 探讨新的食管黏膜细胞的培养方法，以便能够获得大量细胞. 方法： 采用中性蛋白酶和胰酶先后消化从食管黏膜上分离上皮细胞，比较细胞在无血清培养基和含100 ml/L胎牛血清的培养基中的细胞生长曲线和贴壁性；采用细胞角蛋白14、13 (CK14, CK13)和波形丝蛋白抗体三者共同鉴定细胞. 结果： 细胞倍增时间在KSFM中为h (n=3)，而在含100 ml/L血清培养基中不能计算；在KSFM中，贴壁细胞明显为高；CK14阳性细胞百分率KSFM组在不同时段均高，但两组内均随生长时间增加而减少；CK13阳性细胞则恰与其相反；两组中均未见波形丝蛋白阳性表达. 结论： Dispase消化分离细胞， KSFM作为培养基是食管鳞状上皮可靠的新培养方法.【关键词】 食管；上皮细胞；细胞培养0引言目前食管黏膜的传代培养，就报道的极少的几种方法还存在着很多问题，比如大量的成纤维细胞污染1，不能传代扩增或传代次数较少2，细胞数量较少. 我们通过改善原代取材时消化方法，进行含血清及不含血清培养基比较研究，探讨出能获得大量细胞的新的正常食管黏膜细胞的培养方法.1材料和方法1材料人角朊细胞培养液， 胰酶, DMEM(Hyclone), Dispase (Gibco)，胎牛血清. SP免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，单可隆抗体细胞角蛋白14、13和波形丝蛋白(vimentin)抗体购自上海长岛生物有限公司. 从3例新鲜食管手术标本上选取正常黏膜标本，浸入4 PBS中，当日即进行原代培养. 标本获取均经患者同意，并签订同意书.方法将食管黏膜组织放入添加20万u/L青霉素、200 mg/L 链霉素和 g/L庆大霉素的PBS中充分洗涤到无血迹后，洗必泰消毒，后依次采用如下方法消化分离获取黏膜细胞. 4条件下标本在 g/L 中性蛋白酶中消化1824 h后，用眼科镊将黏膜层撕下，放入 g/L胰酶中，37 消化510 min. 其后加入等量的含100 mL/L胎牛血清的DMEM终止消化，吹打，成单细胞液，离心，PBS清洗后接种. 静置于37，50 mL/L CO2培养箱中，2448 h后观察细胞贴壁情况，弃取原培养基，其中含未贴壁细胞，加入新鲜培养基后继续培养. 上皮细胞铺满培养皿底的75%，加EDTA的 g/L胰酶消化后可传代. 设无血清培和含血清两种培养基进行对照观察3,4. 无血清者成分为：KSFM，每500 mL含 mL牛垂体提取物,g L谷氨酰胺, 3 L 生长因子; 含血清者在前者的基础上加入100 mL/L胎牛血清，其余成分相同. 余实验方法和实验条件相同. 为结果有可比性，本实验中接种细胞均为在KSFM中生长的细胞. 选取第2代细胞，24孔板接种，观察7 d，绘制两种培养基中细胞的生长曲线. 按最适密度接种，计算两组原代接种后48 h，第1代接种后24 h贴壁细胞数. 选取KSFM中为计算生长曲线而消化下的细胞，以1104个/cm2重新接种，培养基为KSFM，24 h后将已经贴壁的细胞胰酶消化，并计数. 计算贴壁细胞百分比，观察不同生长时段细胞的贴壁能力. 细胞生长在载玻片上, 用650 mL/L冷丙酮固定20 min, 细胞免疫组化法检测两不同培养基组第2代接种后1, 3, 5, 7 d的细胞CK14, CK13及波形丝蛋白的表达情况. 实验步骤中不加一抗改加PBS为空白对照. 采用如下方法进行半定量比较：在显微镜下，计算相邻20个视野内的阳性细胞，计算阳性细胞百分率.统计学处理： 运用t检验、方差分析对结果进行统计学分析.2结果食管黏膜上皮细胞的特性食管黏膜细胞原代接种于培养瓶中，均从46 h开始出现细胞贴壁生长，此过程多持续48 h以上. 贴壁细胞变成卵圆形，有突起形成，边界不清楚,并且细胞胞质透亮. 其后即出现分裂增殖. 原代培养的上皮细胞最适接种密度104个/cm2，传代培养的最低接种密度5大于1103个/cm2才能形成克隆，最适接种密度为104个/cm2. 选择最适的接种密度，细胞于45 d进入生长平坦期，生长至培养瓶的70%80 %，需要传代. 无血清培养基组，细胞呈卵圆形，单层生长，呈铺路石样；第15代，细胞大小均一，呈卵原形，第56代以后，出现巨型细胞及长梭形细胞，占3%5%，后随传代数增加巨型细胞增加. 本实验已传代达15代，细胞仍具有较好状态，80%细胞胞质透亮，形态呈卵圆形，后未再继续传代培养. 血清培养基组，细胞成多角形，出现复层上皮. 消化后的细胞成团块状及细胞片较多，并且不易吹打散开. 血清培养基组仅培养3代，由于传代后贴壁细胞数迅速递减，而不能继续增殖传代. 两组从原代培养到以后的各代均未发现有成纤维细胞生长.细胞生长曲线接种密度为104个/cm2时，KSFM中细胞群体倍增时间(PDT)为() h (n=3). 但含血清组细胞增殖缓慢，由于传代后帖壁细胞数迅速递减而不能计算PDT. 生长曲线见Fig 1.细胞贴壁性在KSFM中原代和第1代细胞种植24 h后贴壁细胞数与接种细胞数之比分别为(758)%和(1054)%， 在含血清培养基组中分别为(3715)% 和(568)% (n=3), 两组对照，有显着性差异. 接种1 d, 胰酶消化时间约为 min, 后随着接种生长时间的延长消化时间即延长，接种7 d，消化时间为(1015) min. 无血清组不同生长天数细胞经消化后，重新接种，其贴壁情况见Fig 2，不同时段贴壁细胞百分数之间存在显着差异，以d 3, 4消化后重新接种后贴壁细胞百分数较高.免疫细胞化学染色细胞爬片染色后，两不同培养基组爬片中均见到CK14和CK13阳性细胞，而未见到波形丝蛋白阳性细胞. 无血清培养基组于d 1, 3, 5, 7的CK14阳性细胞百分率均较同时间对照的含血清培养基组为高，(其中d 3, 5, 7有统计学差异，)；并两组内阳性细胞百分率随生长时间增加而减少；而CK13阳性细胞百分率的波动恰于其相反(Fig 4).3讨论我们通过改变原代取材时的消化酶，通过不同培养基间的比较，从而使食管黏膜上皮的原代及传代培养均获成功，并克服成纤维细胞污染，不能传代扩增或传代次数较少，细胞数量较少等问题. 黏膜上皮细胞培养关键的一步是上皮细胞与成纤维细胞的分离，有效的分离可避免成纤维细胞的污染. Dispase是一种中性蛋白酶，用于人皮肤表皮细胞的培养中，其作用于表皮与真皮结合处，破坏半桥粒结构，使基底细胞层底部完整分离5. 从本实验可见，dispase亦可成功地将食管黏膜层中的上皮层和固有层分离开，所获的上皮层再经胰酶消化后，就得到了不含成纤维细胞的黏膜上皮细胞，达到了细胞的纯化. 抗波形丝蛋白mAb组化反应阴性，也说明了分离培养的食管黏膜细胞中无其他类型细胞的掺杂污染.食管黏膜上皮细胞在添加了100 mL/L FBS的KSFM中贴壁和扩增能力均较在单纯KSFM为低. 角蛋白是上皮细胞的骨架蛋白，CK14仅表达于基底层细胞6，CK13是食管上皮复层分化相关标记，仅表达于基底层上细胞的胞质中. 结果见含血清培养基组中基底层细胞比例明显较低，基底层上细胞数量增加，并可改变上皮细胞单层生长的状态，促进部分细胞呈复层生长，说明血清明显促进细胞分化. 正因此，血清影响了细胞大量扩增，不利于食管黏膜上皮多次传代培养. 在KSFM中，由于接触抑制，接种后5 d，细胞即进入生长停滞期，分化细胞亦突然明显增加，细胞趋于老化. 不同生长时期的细胞消化后再接种，其贴壁性能亦不同. 在传代接种中，基底层细胞具有较强贴壁性，分化细胞贴壁性较低, 分化细胞不能传代, 我们探讨出一种培养食管黏膜鳞状复层上皮的新方法. 分化细胞如何培养，如何诱导或控制细胞分化等尚需要进一步研究.【参考文献】1 Corinna PW, Michael TB, Patricia CG, et al. Genetic analysis of longterm Barretts esophagus epithelia culture exhibiting cytogenetic and ploidy abnormalities J. Gastroenterology, 1998; 114(2): 295-304.2 Garewal HS, Leibovitz A, Sampliner RE, et al. Tissue culture of epithelial cells from esophageal specialized columnar epithelium (Barretts esophagus) J. Digestive Diseases and Sciences, 1992; 37(4): 532-536.3 Rebacca CF, Michael JG, George T. Novel adaptation of brush cytology technique for shortterm primary culture of squamous and Barretts esophageal cells J. Gastrointestinal Endoscopy, 2001; 54(2): 186-189.4 Harvima IT, Lappalainen K, Hirvonen MR, et al. Heparin modulates the growth and adherence and augments the growthinhibitory action of TNFalpha on cultured human keratinocytes J. J Cell Biochem, 2004; 92(2): 372-386.5 Germain L, Rouabhia M, Guignard R, et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin J. Burns, 1993; 19(1): 99-104.6 David AJ, Paul JB, Darrin DB. Culture of human keratinocytes in defined serumfree mudium J. FOCUS, 1997; 19(1): 2-5.