亚铁离子荧光探针研究进展_李佳佳.pdf

，.，.基金项目：国家自然科学基金（；）（，）：.亚铁离子荧光探针研究进展李佳佳，张瑞龙，张忠平 安徽大学化学化工学院，合肥 安徽大学物质科学与信息技术研究院，合肥 铁作为生物体内最丰富的过渡金属元素，与生命体的新陈代谢息息相关，而且铁元素主要以亚铁离子（）的形式存在于细胞内。体内 含量的失调与贫血症、癌症和心血管疾病等多种病症的发生和发展有着直接的联系。因此，监测生命体内 的浓度是评估人体健康状况的重要手段。在诸多 的检测方法中，荧光检测法因操作快速、简便并可用于体内 体外实时监测等最具发展前景。然而，在荧光检测法中探针的设计与筛选至关重要。传统的荧光探针面临的最大问题是特异性，即对 的响应常常会受到其他金属离子（如钙离子、镁离子和钾离子等）的干扰。因此，为了适用于监测生物系统中 浓度，设计出特异性强、光稳定性好、灵敏度高、检测限低和生物相容性优良的荧光探针具有重要的意义。现阶段，荧光探针主要分为两大类：有机小分子和纳米材料，其机理主要可分为三种：（）还原 类化合物；（）与 螯合；（）利用 与荧光探针发生特异性反应（如 反应、选择性断裂酰胺或羟胺键等）。本文主要归纳总结了近十几年 荧光探针的研究进展，包括制备方法、作用机理和在生命系统中检测 的应用进展。最后，对如何进一步优化 荧光探针的发光性质、检测限和特异性提出了展望。关键词 亚铁离子 荧光探针 识别 生物成像中图分类号：文献标识码：，（），（，），：（）；（）；（）（：，），引言铁元素作为人体内最丰富的过渡金属元素之一，密切参与细胞内各种生物化学反应，以不同存在形式在人体细胞内维持着一定的动态平衡，起着必不可少的作用。几乎人体内所有的细胞中都有铁的存在，其中有超过 的铁以亚铁离子形式存在于红细胞血红蛋白反应中心，参与人体内氧气的运输；剩余大部分以铁蛋白或一些酶的形式存在，作为反应活性中心，参与并调控着细胞内重要的氧化、水解和转化等过程；还有不到 的铁以游离形式存在于细胞中，参与维持细胞内其他生命活动的稳态。铁具有在氧化还原过程中多种氧化态之间循环的能力，因此对维持人体内细胞正常工作起着至关重要的作用。如果细胞中的铁没有适当的调节，其氧化还原能力可能会导致相关氧化应激反应，从而引发人的癌症、肝炎、间皮瘤和心血管等疾病。因此监测生物系统中 的动态水平对研究与铁相关的生物学过程和疾病，以及剖析 的生理和病理生理功能至关重要。但是由于 的荧光猝灭能力很强，用于监视和检测与细胞内配体弱结合的游离铁（不稳定的铁池）的保留时间和空间信息的响应方法仍然受到限制。本文将近十几年所报道的亚铁离子荧光探针分为两大类，即有机小分子和纳米材料，说明了各个荧光探针的特点，综述了探针在检测生命系统中 方面的应用进展，还讨论了这些探针的设计策略和传感机制。有机小分子 利用 被还原，荧光打开基于 氧化物的荧光探针，由于 单元的存在往往会影响探针的电子传输能力或破坏探针的共轭体系，从而导致探针的荧光减弱甚至猝灭。然而，在 检测中，正是利用 可以选择性还原 的原理，通过 与探针上的单元结合并将其选择性还原为胺基，消除了荧光猝灭的效应，设计了一系列具有荧光打开性质的 探针。年，等将间氯过氧苯甲酸罗丹明改良成探针 （见图），使罗丹明 因扭曲的内部电荷转移（，）过程和光诱导电子转移（，）效应而淬灭。当该探针与 反应时，将探针 还原成罗丹明 而重新发出荧光。探针 与细胞共孵育 ，可定位于细胞中高尔基体，不仅可以检测外源性 ，还可以检测人肝癌细胞（）和人乳腺癌细胞（）中的内源性。图 探针 的结构式（红色部分为探针与 反应位点）（电子版为彩图）（）年，等在其课题组之前研究的基础上又开发出一类探针，四个螺环化的氮氧化物作为 探针，分别为探针、和 （见表）。与第一代基于氧化物的 探针相比，通过抑制探针本身信号，螺环化策略显著提高了荧光打开效率，并且使 氧化物基团的取代基变小，从而提高了探针分子与 的反应速率。年，等受到探针 检测 的原理启发，通过将探针 中的罗丹明 分别更换成香豆素衍生物（）、罗丹明衍生物（）、罗丹明 （），成功开发出具有多种颜色发射的 选择性荧光探针系列，分别为探针、。在缺氧条件下，这类探针能够捕获 细胞氧化还原平衡对不稳定的 产生的轻微影响。其中，探针 和探针 可定位于 细胞的内质网，而探针 则存在于整个 细胞中。年，等将罗丹明衍生物与季四哌嗪结合，并通过接有长链烷烃来定位膜结构，合成出探针。在有 的溶液中，通过将探针发光主体中的 还原，用 的光激发，探针可以在 处发射荧光，而在无 的溶液中无荧光发射。进一步以 细胞为模型，用探针 进行细胞成像，结果表明，不稳定的 主要是在铁吸收途径过程（细胞吞噬和直接转运）中短暂生成的。此外，该探针还能够监测内吞摄取过程中，原代培养神经元的内源性 。随后，等利用相同的检测 的原理，在罗丹明衍生物与季四哌嗪结合的基础上再接上三苯基膦基团，合成了探针。在有 的溶液中，用 的光激发，探针可以在 处发射荧光。而三苯基膦基团可靶向线粒体，于是此探针可用于特异性检测活细胞线粒体中不稳定的 ，此外，以人胚胎肾细胞（）为模型，该探针还可以检测到细胞中多余的不稳定 的积累。表 基于探针 设计的探针 年，等利用 可以选择性将 还原成胺基的原理，设计并合成了氨基香豆素衍生物（探针），该探针发射波长为（），可用于检测 。将探针 置于 溶液中，溶液由无荧光到橙色荧光发射，与其他研究不同的是 等不仅将探针 应用于细胞成像，还将该探针应用于化妆品中 的定量检测，检测限低至 。同年，等开发出基于 选择性亚铁离子荧光探针研究进展 李佳佳等 还原氮氧化物胺基的近红外探针，与其他探针不同的是，探针 具有非常大的斯托克位移（），光激发下，处发射出近红外荧光。探针 对 的选择性高，且可以在 内快速反应，将探针 应用于癌细胞（细胞和 细胞）和正常细胞（细胞和 细胞）脂滴中的 检测。年，等基于 选择性将 还原成胺基的反应，设计并合成出一种近红外探针，该探针对 具有出色的选择性和灵敏度，检测限低至 ，而且可以与 在 内快速响应，可作为监测 的“裸眼比色传感器”。在单光子模式下，可在 处激发，在 处发射荧光，而在双光子模式下只需要 就可激发探针。在近红外附近探针 的双光子成像有利于在生物样品中对 进行深层成像。早在 年，等设计并合成出探针，利用 选择性还原 为，使得探针荧光打开。将该探针放入含 的溶液中反应 ，即可通过检测荧光强度对 浓度进行定量，线性检测范围为 。但该探针必须在酸性条件下使用，因此尚未应用于生物成像。年，等开发出一种 荧光探针。该探针基于 可选择性地将氮氧化物还原为羟胺，致使荧光打开。该探针对 的选择性高且检测限低至 ，可以在 内检测到 。探针 不仅可以用于检测水溶液中的 ，还可以检测生物系统中的 。在活细胞中的探针 可追踪细胞内 ，且该探针是首次用于监测斑马鱼中的 的荧光探针（见图）。与 螯合配位该类探针是利用 较强的螯合 配位作用，通过 与探针分子的、等原子进行配位，使得探针的状态或构效发生一定的变化，进而影响发光性质以达到检测 的目的。年，等设计并合成了一种新型的比例荧光探针（见图），该探针对 具有良好的选择性和高灵敏度，并且检测限低至 。当 与受体 结合时，从 复合物到 基团发生了有效的光诱导电子转移（）过程。可以立即猝灭 基团在 处的荧光，而 基团在 的荧光强度基本不变。荧光强度的比率（）与 的浓度呈线性关系。通过其在 和 的荧光强度比率来反映 浓度的波动。因探针 具有良好的细胞膜穿透能力和低毒性，可应用于细胞成像。共聚焦荧光比成像实验证明了该探针用于人肝细胞（）内 成像的可行性。这是第一例用于检测 的荧光比率度量探针，并可成功检测出活细胞中细胞内和吸附性 浓度的波动情况。年，等设计并合成了一种与 螯合淬灭的荧光探针。在无细胞系统中，探针 的荧光被 强烈淬灭。将该探针应用于大鼠肝细胞中，其选择性积聚在线粒体中。当铁以膜渗透性形式加入细胞时，体内线粒体中探针 的荧光被淬灭。该探针能够选择性确定完整细胞中螯合铁的高度生理和病理生理学意义的线粒体库，并记录该库变化的时间过程。随后，等在探针的基础上图 斑马鱼中 的荧光成像：（）对照斑马鱼；（）用探针（）孵育的斑马鱼；（）用 （）预处理，然后用探针 （）处理的斑马鱼；（）用 （）和 （）共同处理，然后用探针 （）处理的斑马鱼；（）（）的明场图像；（）（）的合并图像；（）图像（）的相对荧光强度 ：（）；（）（）；（）（）（）；（）（）（），（）；（）（）；（）（）；（）（）又开发了另外两种线粒体铁结合亲和力不同的探针，并将其应用于分离大鼠肝细胞线粒体中游离铁库的研究。新型罗丹明 改良的探针 仍测定出与探针 基本相同的 浓度，结合亲和力的强弱也基本相同。这证明了该实验的可靠性，即这些探针对 的络合作用不会从铁存储蛋白中诱导显著的 释放。相反，由罗丹明 改良的另一种探针 不能与内源性配体竞争，比可螯合亚铁离子的内源性化合物的总浓度低大约三个数量级。据估计，可螯合的线粒体 被内源性配体结合，表观稳定常数在 之间。材料导报，（）：年，等将丹磺酰与苯乙烯基喹啉结合，设计出一种新型“”探针。该探针对 的选择性优于其他过渡金属离子，包括 。在背景中常见干扰金属离子的存在下，添加 可以增强该探针在 处的荧光发射，荧光强度可提高 倍。且探针 检测极限低，可以对亚毫摩尔浓度的 进行荧光检测，但其水溶性和荧光强度有待进一步提高。年，等设计并合成出一种基于香豆素的“”型荧光探针。该探针对 具有高度选择性，并且可以在水性介质中可逆地检测到它们。基于探针 的良好水溶性，将其应用于人神经母细胞瘤细胞（）中，其定位在细胞膜上，可以检测到细胞膜上 浓度的变化。分子动力学模拟表明该探针可与脂质双层相互作用。年，等成功合成了一种基于萘醌的 的探针。探针 与 螯合后，分子内电荷转移效应（）明显增强，从而“打开”探针的荧光响应，该反应机理已通过傅里叶变换红外分析，滴定和量子化学计算证实。探针 对 的检出限低至 ，其最显著特征的是它能够通过肉眼直接观察，而且已成功应用于人类癌细胞和斑马鱼中的 生物标记物。年，等设计并合成了一种萘吡啶席夫碱探针，该探针通过与 配位，利用 效应，在 处发射荧光，可检测 溶液中的 。该探针对水性介质中 具有高选择性和灵敏度，其检测下限为 。该探针可检测市售片剂、番茄汁、黑巧克力和自来水中的 浓度。目前该探针还未应用于其他领域，但可以作为生物和环境监测工作中检测 的潜在探针。年，等以高产量合成了一种基于罗丹明的 荧光“打开”探针。该探针以 的比例对 进行高选择性配合反应，且在 的浓度范围内对 表现出线性响应，且探针几乎不受其他过渡金属离子的干扰。由于螺环的开环相互作用，在 存在下观察到它们的荧光增强。通过共聚焦激光扫描显微镜实验，已证明该探针可用于监测活 巨噬细胞中的 。年，等通过将苯并噻唑基团引入到罗丹明酚羟基的邻位上，设计并合成了一种发光探针。该探针具有长达 的斯托克斯位移，并具有聚集诱导发射（）和激发态分子内质子转移（）功能的协同效应。此外，探针 对 表现出敏感的荧光响应，检测限低至 ，且选择性高。其检测机理的研究表明，与探针分子的配位作用破环了探针分子原有的 过程，诱导淬灭蓝绿色荧光（）。该工作中 荧光团的开发将为生物传感器提供可行的设计策略。以上，笔者总结了基于有机小分子与 螯合配位的特性而设计的荧光探针，其具体结构式如图 所示。图 探针 的结构式（红色部分为探针与 反应位点）（电子版为彩图）（）基于其他化学反应的 传感策略除了上述提到的两种构建 荧光探针的设计思路，还可以利用 与其他化学基团（例如酰胺键、和芬顿反应等）进行化学反应，从而影响探针的荧光发射性质，来设计探针的分子结构，以实现对 的特异性检测。年，等通过将酰化羟胺部分结合到萘二甲酰亚胺荧光团中，开发了一种新的“”选择性荧光探针。可以选择性断裂羟胺键，探针荧光打开。该探针可在 内对 做出响应，且对 的选择性好，与 反应后荧光强度增强了 倍以上，灵敏度低至 。由于该探针以上优良性能，将其应用于检测活细胞中内源性游离 水平。它可以响应 诱导的 通量，这是中风病症的重要现象，因此可以方便地检测到在缺血部位发生缺血性中风的大鼠脑组织中 的水平升高。年，等开发出一种生物发光探针，该探针能够纵向监测活体动物中的游离铁库。探针 基于 亚铁离子荧光探针研究进展 李佳佳等 选择性断裂酰胺键而释放出 氨基荧光素，该探针可以检测出铁缺乏或超负荷的活细胞和小鼠中不稳定的 水平的生理变化。该探针应用在感染系统性细菌的模型中时，铁的积累在感染组织中伴随着转录变化而增加。年，等设计并合成出一种基于香豆素的 探针。由于 键的异构化和旋转，探针 几乎不发出荧光。然而，在用 处理时，键通过 介导的环化反应被氧原子桥接。因此，探针 显示出荧光开启响应。该探针具有对 的高度选择性和灵敏响应，检测极限低至 。值得注意的是，该探针可在 内对 快速响应，这对实时监测很有帮助。该探针成功地应用于检测 活细胞中不同浓度的不稳定 。此外，该探针还成功地应用于对生命系统中不稳定 的基础性和内源性水平的监测。年，等基于 的芬顿反应设计并合成出一种 高选择荧光探针。该探针与细胞内不稳定的 进行芬顿反应，使 键断裂，导致氨基核苷嘌呤霉素的暴露，利用 效应，荧光打开。嘌呤霉素在处理过的细胞上留下永久的剂量依赖性标记，可以使用所述的高通量免疫荧光测定法进行高灵敏度和精密度检测。使用这种新的探针和筛选方法，检测到细胞中游离的 对细胞外铁的调节、铁存储和输出蛋白的过表达以及铁输出的翻译后调节中的改变。最后，该探针还证明了与非瘤细胞与癌细胞中游离 水平的差别。年，等设计出一种基于 效应检测 的探针（见图），该探针能够对活体系统中不稳定的铁池进行比例荧光成像。受抗疟疾天然产物和相关疗法的启发，探针 通过可被 裂解的过氧化物，桥连接两个荧光团（荧光素和），触发的过氧化物裂解，导致荧光共振能量转移的减少，从而是实现荧光信号的改变。探针 对水性缓冲液中的 有高选择性，并且能够通过补充铁来检测活细胞中不稳定铁库的变化。图 为将 细胞暴露于 中 ，用探针 处理 ，然后进行荧光比例成像，显示 比率比对照组细胞增加。相比之下，分别用 邻菲咯啉二磺酸盐（）、亚铁螯合剂或 去铁胺（）、铁螯合剂预处理 ，然后用该探针染色 ，荧光比例成像显示 细胞的 比率降低。此外，将探针 成功地应用于肥大症细胞模型，揭示了不稳定铁池的变化，为生命系统中铁信号的研究提供了新思路。图 探针 在 细胞的成像：（）邻菲咯啉二磺酸二磺酸盐和（）去铁胺（）处理组，（）无处理对照，（）硫酸亚铁铵处理组；（）对应的染色图像；（）用（）和螯合剂处理的细胞的平均 比值（图中标尺为 ）（）；（），（），（）；（）；（）（）；（）年，等受 和 依赖性氧化 键裂解反应启发，设计并合成出荧光探针，并将其应用于监测水溶液和活细胞中不稳定的 库。该探针对 具有高灵敏性，可以检测活细胞中的内源性基础不稳定 库，并且可以在用铁调素或维生素 刺激后，监测并可视化这些不稳定 库的产生，为进一步研究细胞内动态铁平衡提供了平台。最后，图 展示了上述报道的探针 的分子结构式。纳米材料近年来，以一系列具有荧光性质的纳米材料为基础，开发了一系列新型的 检测荧光探针。这类荧光探针有良好的生物相容性、光稳定性，有着广阔的发展前景。年，等设计并合成出一种检测 的比例荧光探针（见图），将金纳米团（）与特异性识别 的配体（）结合，再固定水溶性磺基花青 酯（酯）作为参考。该探针可在 的 浓度范围内显示出良好定量能力，并且检出限低至 。此外，该纳米材料探针对 的响应时间小于 ，具有选择性高、准确性高以及长期稳定的优点，已将其成功应用于神经元和 细胞中 的实时生物传感和生物成像，研究发现活细胞中 浓度的增加与氧化应激密切相关。年，等通过微波水热碳化在 内快速合成了丙烯酰胺 壳聚糖衍生的探针（见图），产率高达 。与壳聚糖或丙烯酰胺衍生的碳点相比，探针 的合成产率分别提高了 倍和 倍。壳聚糖接枝聚丙烯酰胺在微波水热碳化过程中作为碳点的前驱体，提高了碳点的合成产率。由于存在氨基和羧基，该探针对亚铁离子的螯合能力比 强。探针 通过螯合可以线性检测在 范围内的 ，检测限低至 。材料导报，（）：图 探针 的结构式（红色部分为探针与 反应位点）（电子版为彩图）（）图 探针 的结构及其与 的荧光响应机理。在存在不同浓度的 的情况下，用 探针（）处理的不同通道收集的神经元的共聚焦荧光显微图像：（），（），（），（）；（）在 存在下，用 探针（）处理的不同通道收集的神经元共聚焦荧光显微图像，然后加入 ；（）从 获得的平均荧光强度比（）的汇总数据；（）无 时，不同神经元区域（躯体、近端轴突、远端轴突和突触室）的 值。数据是根据对 多个神经元的统计分析得出的。和 分别代表从绿色通道（）和红色通道（）收集的平均荧光强度（电子版为彩图）（）：（），（），（），（）；（）（）；（）（）；（）（，）（）（），亚铁离子荧光探针研究进展 李佳佳等 图 基于螯合能力的碳点对亚铁离子的检测探针 年，等以反应为基础合成了一种新型荧光探针，该探针可检测水中的 和 ，检测示意图如图 所示。通过羟基自由基（）对金纳米材料 的剧烈“”荧光反应进行测定，该反应是在同时存在和 时产生的。当仅存在 或 时，该探针的荧光没有变化，而当同时存在 和 时，该探针的荧光可以被有效地猝灭。的检出限低至 ，的检出限低至 。在最佳条件下，探针 在 处的荧光强度与 浓度（）呈良好的线性关系。和 的检测限分别低至 和 。该探针具有特异性好、灵敏度高的优点，已成功应用于实际水样中 和 的检测。图 用于检测 和（）的探针 示意图 （）年，等开发出以杂化金卡宾纳米晶体结构为基础的 的荧光探针。通过在液体中进行激光烧蚀来一步合成覆盖有金纳米颗粒的荧光碳炔纳米晶体。在 的参与下，该探针具有荧光猝灭和产生颜色的特性，这使其成为化学和生物医学检测的双通道平台，其荧光猝灭和变色的机理如图 所示。相对于其他金属离子，该探针对 的选择性极高，其荧光和比色法检测限分别为 和 。该探针扩大了无机纳米材料在化学和生物医学传感领域的应用。图 探针 荧光猝灭和变色特性的机理 年，等发现由牛血清白蛋白（）稳定的金纳米簇（）可用作亚铁离子的荧光探针（见图）。通过在 和 之间的 反应中产生的羟基自由基（）对 修饰的 荧光的猝灭，间接对 浓度进行检测。该探针对 的浓度检测范围为 ，检测限低至 。当用于测定大鼠脑脊髓液（）中的 时，该方法还显示出良好的准确性和高灵敏度。将该探针应用于阿尔茨海默氏病大鼠模型的脑脊液中时，与对照组相比，它显示出较高的 水平，从而显示了 在该疾病中的重要生理作用。图 探针 对（由 和 的 反应产生）的荧光反应示意图 （）年，等合成出以木瓜蛋白酶稳定的 纳米团簇（）来作为检测 的双发射荧光探针（见图）。该探针与 发生比例荧光反应，而其他阳离子和阴离子对其发射的荧光没有影响。当该探针与 反应后，在 和 处的发射均减少，并且两个波长（）的荧光强度之比与 的浓度具有良好的线性关系。该探针可用于检测 范围内的 ，检出限为 。响应机制归因于木瓜蛋白酶配体中的甘氨酸（）残基与 螯合，由于静态猝灭效应导致木瓜蛋白酶配体在 处发生荧光猝灭，并减少了木瓜蛋白酶配体与 结合，导致 在 处的荧光发生猝灭。此外，与标准的，菲咯啉方法相比，该探针应用到检测乳酸亚铁口服溶液的 浓度表现出令人满意的结果。材料导报，（）：图 探针 的合成过程及 的检测方法（电子版为彩图）结语与展望荧光检测法是一种快速、高效的检测 浓度的方法。近年来，围绕其开发的各种荧光探针相继被报道并取得一定的进展。本文主要归纳总结了近十几年用于检测 的荧光探针，其中主要可分为两大类：有机小分子和纳米材料。现阶段，文献中已报道的荧光探针都展现出对 较好的响应性，但大多数探针对 的检测仅限于细胞水平，且特异性不足，而适用于动物活体实时检测 浓度的荧光探针还鲜有报道。因此，为了将荧光检测法成功应用于体内 体外的 浓度检测，还需要拓宽探针的激发和发射波长以克服生物组织自发荧光的干扰，开发出在近红外区域响应的体内荧光探针。同时，探索合适的作用机理和方法，进一步优化 荧光探针的特异性和检测限，相信更多性能优异的 荧光探针将会被开发并成功应用。参考文献 ，（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），：，：，：，：，（），（），（），（），（），（），（），：，（），（），（），（），（），（），：，（），（），（责任编辑 李承佳）李佳佳，年 月毕业于安徽师范大学，获得工学学士学位。现为安徽大学化学化工学院硕士研究生，在张忠平研究员和张瑞龙副教授的指导下进行研究。目前主要研究领域为碳点在荧光成像上的应用。张瑞龙，通信作者，安徽大学化学化工学院副教授、硕士研究生导师。年毕业于中国科学技术大学，取得博士学位。研究方向为荧光探针与细胞成像 通过多响应型单分子荧光探针研究细胞内不同生物分子之间的相互关联性。曾在 、等杂志发表多篇学术论文。目前主持国家自然科学基金面上和青年项目各一项。亚铁离子荧光探针研究进展 李佳佳等