吲哚-吡啶化合物的制备及其...生物和线粒体膜电位中的应用_杨锐.pdf

常熟理工学院学报（自然科学）Journal of Changshu Institute of Technology（Natural Sciences）第 37 卷第 2 期2023 年 3 月Vol.37 No.2Mar.,2023吲哚-吡啶化合物的制备及其在检测二氧化硫衍生物和线粒体膜电位中的应用杨 锐，徐敬阳，赵宇昂，朱 涛，陈宇琪，孙梦妮，陈正洋，韩志达，魏蒙蒙（常熟理工学院 电子信息工程学院，江苏 常熟 215500）摘要：二氧化硫和细胞膜电位都参与细胞的重要生命活动，因此，观测细胞内的线粒体膜电位和二氧化硫衍生物对研究与之相关的生命活动至关重要 目前，可观测线粒体膜电位和二氧化硫衍生物的荧光探针往往需要洗涤过程，这会对细胞产生损伤 为此，本文设计合成了可以观测细胞线粒体膜电位和细胞内二氧化硫衍生物的多用途荧光探针，并用此探针观测了细胞线粒体膜电位和细胞内二氧化硫衍生物的变化 此外，该探针的生物相容性较好，可以为与细胞线粒体膜电位和细胞内二氧化硫衍生物相关的疾病诊断提供重要工具，并促进相关学科的发展关键词：线粒体膜电位；二氧化硫衍生物；荧光探针；细胞成像中图分类号：O62 文献标志码：B 文章编号：1008-2794（2023）02-0008-05收稿日期：2022-11-06基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目“有机手性小分子共晶中分子排布调控光子-自旋耦合的研究”（12204067）；江苏省自然科学基金青年基金项目“有机手性小分子共晶中调控光子-自旋耦合的研究”（BK20220689）；江苏 省教育厅自然科学研究面上项目“有机手性给受体共晶 Bper-FTCNQ 中调控光子-自旋耦合的研究”（22KJB140006）；常熟理工学院科研启动基金项目（KYZ2021055Q，KYZ2021056Q）通信作者：魏蒙蒙，副教授，博士，研究方向：有机光电子学，E-mail：0 引言 二氧化硫（SO2）是一种常见的空气污染物 1，过量的 SO2对环境和生物体都有严重的影响 过量摄入SO2及其衍生物可能会引起呼吸性疾病，如慢性支气管炎、偏头痛、中风等神经紊乱疾病和肺癌等 2-3 SO2水溶液具有抗菌、抗氧化作用，其中主要以亚硫酸氢盐（HSO32-）和亚硫酸盐（SO32-）两种形式存在 4 在生物体内，SO2及其衍生物的具体作用机制尚不清楚 因此，急需开发一种能够高效检测生物体内二氧化硫衍生物的方法，这对医学诊断及疾病研究具有重要意义目前，检测 SO2的方法有很多，比如：分光光度法、毛细管电泳法、高效液相色谱法以及电化学法 5-7 这些方法不仅操作流程复杂，而且还会对测试样品造成损害 因此，难以实现对生物体内二氧化硫衍生物变化的原位、无损伤、实时、高灵敏检测 最近发现，有机荧光探针可以无损、原位、可视化二氧化硫衍生物的变化 8 目前，已有很多检测二氧化硫衍生物的探针，但是这些探针的染色过程都需要洗涤，会对细胞产生损害 因此，需要一种免洗型荧光探针来观测活细胞内的二氧化硫衍生物线粒体在细胞和生物体生命活动（如能量供应和信号传导等）中发挥着重要作用 9 线粒体内膜两侧质DOI:10.16101/32-1749/z.2023.02.004第 2 期9子浓度的差异可引起高达-180 mV 的跨膜电位，即线粒体膜电位（MMP），这一跨膜电位由呼吸过程维持 10 线粒体膜电位在离子化合物的流动调节、能量传递、信号转导等方面作用重大，它是线粒体活性的指示器 11 因此，检测 MMP 可以指示细胞和线粒体的状态，并有助于线粒体相关疾病的研究由于MMP不能直接通过光学显微镜和电子显微镜观察到，故最初采用微电极评估MMP水平，通过其电压值来反映 MMP 的数值大小 12 然而采用此方法时，需要分离出线粒体，细胞也会被微电极损坏最近发现，以荧光成像技术为基础的有机荧光探针可以原位、无损、可视化 MMP 的变化因此人们设计出了很多线粒体荧光探针，但是，一些线粒体探针含有苄氯基团，这些探针不受膜电位的影响，无法检测线粒体膜电位 13 其他一些商用的膜电位探针，如罗丹明 123 等，都需要洗涤过程，这会对细胞造成一定的损害 14 因此，需要一种可观测线粒体膜电位的免洗型荧光探针基于此，我们设计合成了一种可以观测线粒体膜电位和细胞内二氧化硫衍生物的荧光探针该探针可以观测细胞内线粒体膜电位的变化以及二氧化硫衍生物，可为线粒体膜电位和二氧化硫相关的疾病提供一种工具，并促进与之相关的生物学和化学学科的发展1 实验部分1.1 主要试剂与仪器2,3,3-三甲基-3H-吲哚、碘甲烷、甲醇、乙醇、石油醚、二氯甲烷、高糖溶液、双抗溶液（青NRNINRINEtOH,refluxCH3IOHCNEtOH,piperdine,reflux123图 1 PVII 的合成路线图霉素，链霉素）、激光共聚焦小皿、紫外分光光度计、荧光分光光度计、激光共聚焦显微镜、酶标仪1.2 探针 PVII 的合成探针 PVII 的合成路线如图 1 所示，图中的 1、2、3 分别表示化合物 1、化合物 2 和化合物 31.2.1 苯并吲哚碘盐（化合物 2）的合成将化合物 1（2,3,3-三甲基-3H-吲哚，1.98 mL，10 mmol）溶于 20 mL 纯乙醇溶液中，再加入 1.72 mL 碘甲烷（10 mmol）于烧瓶中搅拌 1 h然后回流 8 h，冷却后用无水 EtOH 洗涤 3 次干燥后过滤得到白色固体，即化合物 2（质量 3.23 g，产率 90%）1H NMR（300 MHz，DMSO-d6），（ppm）：7.897.94（m，1H），7.807.86（m，1H），7.587.67（m，2H），3.97（s，3H），2.78（s，3H），1.53（s，6H）1.2.2 探针 PVII 的合成将化合物 2（0.301 g，1 mmol）和化合物 3（0.109 g，1 mmol）溶于 20 mL 甲醇中，加入 5 滴哌啶，搅拌后在 85 下回流 8 h，冷却至室温后用石油醚洗涤以 CH2Cl2/CH3OH 混合物（101 61，v/v）为洗脱液，柱色谱分离提纯后，得到黄色固体即为探针 PVII（质量 0.25 g，产率 62%）1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）（ppm）：8.02（d，J=16.0 Hz，1H），7.75（d，J=24.0 Hz，1H），7.68（q，J=2.6 Hz,1H），7.55-7.59（m，2H），7.50（t，J=5.3 Hz，1H），7.19（d，J=16.0 Hz，1H），6.49（q，J=2.6 Hz，1H），7.68（q，J=2.6 Hz,1H），3.96（d，J=8.0 Hz，6H），1.75（s，6H）13C NMR（400 MHz，DMSO-d6），（ppm）：180.14，143.01，142.54，139.82，136.16，132.13，128.20，120.49，114.21，113.36，105.76，51.35，34.73，33.70，26.97.HRMS（m/z）：计算值为 265.174 9，测量值为 265.170 5，分子式为 C18H21IN21.3 光物理性质测试用不同种类溶剂和不同比例 Gly-H2O 混合物配制成含 10 mol/L PVII 的测试溶液将上述溶液分别用紫外-可见分光光度计和荧光光谱仪测试其吸收光谱和荧光发射光谱1.4 HeLa 细胞的培养用含 10%胎牛血清的高糖培养液培养 HeLa 细胞，使细胞贴壁培养于培养皿底部，并置于 37，5%CO2的饱和湿度孵箱中培养，及时更换培养液，并进行传代培养待细胞生长完成后进行接片培养：用 PBS 冲洗培养皿中长满的细胞 3 遍，再用胰酶消化细胞 35 min，然后加入新鲜培养液吹打均匀，再放入离心管中杨锐，等：吲哚-吡啶化合物的制备及其在检测二氧化硫衍生物和线粒体膜电位中的应用常熟理工学院学报（自然科学）2023 年10离心 弃上层培养液，加入新鲜培养基，以培养液的添加量控制细胞密度，使细胞终浓度达到1105个/mL，然后接种至上述含盖玻片的培养皿（玻底培养皿）中，放入 5%CO2培养箱中培养，使细胞紧贴培养皿生长待 HeLa 细胞长满玻底培养皿后，用于细胞实验1.5 探针共定位实验以 DMSO（二甲基亚砜）为溶剂配制 1 mmol/L 探针母液当 HeLa 细胞长满玻底培养皿后，在含 5 mol/L PVII的培养液中孵育活性HeLa 细胞15 min，然后将2 nmol/L商用的 MTDR（线粒体深红色荧光探针）加入上述培养液中，继续培养 10 min，用激光共聚焦显微镜成像染色后的 HeLa 细胞1.6 观测线粒体膜电位分别用 5 mol/L 的 PVII 和 0.2 mol/L 的 MTDR 染色活性 HeLa 细胞 10 min 将细胞分为 3 组，不经过任何处理的作为对照组；一组用 CCCP 处理，降低线粒体膜电位；另一组用多聚甲醛固定细胞，以此消除线粒体膜电位 接着，用激光共聚焦显微镜观察，记录细胞中的着色部位、荧光分布及亮度变化、共定位信息等1.7 探针 PVII 的毒性测试 测定活细胞的细胞毒性所用方法为标准 MTT（噻唑蓝）法 将 HeLa 细胞接种于 96 孔板（约 1104个细胞/孔），用培养基填充小孔作为空白组 将接种的细胞置于37，5%CO2培养箱内孵育24 h，然后分别将0，2，5，10，15 mol/L浓度的PVII加入孔中作为实验组 此外，加入终浓度为含0.2%DMSO的DMEM培养液作为对照组细胞在 37，5%CO2下孵育 18 h，然后每孔加入 MTT（5 mg/mL）37 孵育 4 h 后，加入 100 L 的DMSO，再孵育 20 min，使用酶标仪测试每个孔在 490 nm 处的吸光度 细胞毒性实验重复 4 次细胞存活率可通过公式（1）计算得到.（1）其中 Asample为实验组吸光度，Ac为对照组吸光度，Ab为空白组的吸光度2 结果与讨论如图 2（a）所示，探针PVII在380540 nm范围内存在较大的吸收，这说明探针可以用可见光范围的光激发由图 2（b）可以看出：探针在 480675 nm 的范围内存在荧光；另外，探针在高黏度甘油中荧图 2 （a）PVII（10 mol/L）在不同溶剂中的吸收光谱；（b）PVII（10 mol/L）在不同溶剂中的 荧光光谱，激发波长：各自最大吸收所对应的波长；（c）PVII（10 mol/L）在不同浓度 NaHSO3 溶液中的荧光光谱 （PVII：ex=488 nm；em=500600 nm；MTDR：ex=638 nm；em=650750 nm）图 3 PVII（5.0 mol/L，20 min）与 MTDR（0.2 mol/L，10 min）染色 HeLa 细胞的共聚焦荧光图像，其中，DIC 为微分干涉显微镜 图像，Merged 表示前面图像的叠加光强度较强，在低黏度溶剂中的荧光强度较弱，这说明该探针对黏度变化响应明显，也说明该探针可以用于细胞的高保真成像从图 2（c）中可以看出，随着 SO2浓度的增加，荧光强度逐渐降低，这说明该探针对二氧化硫衍生物敏感，因此可以用探针观测二氧化硫衍生物的变化接着，我们用该探针成像培养的活性 HeLa细胞 从图3可以看出，该探针在细胞中呈现出花丝状，说明成像的可能是线粒体为了进一步验证该探针染色的是线粒体，我们用商用的MTDR 进行了细胞共定位实验从图 3 中可以细胞存活率=100%Asample-AbAc-Ab（a）（b）（c）Wavelength/nmWavelength/nmWavelength/nmFluorescence intensity/(a.u.)Fluorescence intensity/(a.u.)Absorbance2.51.40.60.50.40.30.20.10.03003804605406207001.21.00.80.60.40.22.01.01.50.500475525575625675725775480500520540560580 103 103第 2 期11杨锐，等：吲哚-吡啶化合物的制备及其在检测二氧化硫衍生物和线粒体膜电位中的应用看出，绿光通道和红光通道有着较大的重叠，其复染率为 89%，说明该探针染色的是线粒体由于该探针带有明显的阳离子盐结构，可能对线粒体膜电位响应明显，因此，我们可以利用该探针观测细胞膜电位的变化 我们用探针直接染色 HeLa 细胞作为对照组，用羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）来消除线粒体膜电位，用 4%多聚甲醛固定细胞，使细胞线粒体膜电位完全消除，以此观测细胞内线粒体膜电位的变化 从图 4（a）中可以看出：在未用任何处理剂处理的正常 HeLa细胞中，可以观测到正常的花丝状线粒体，其荧光强度较强；当用 CCCP 降低线粒体膜电位后，线粒体的荧光强度降低；当用多聚甲醛固定细胞消除线粒体膜电位后，线粒体的荧光强度几乎消失图 4（b）为图 4（a）所对应的线粒体荧光强度 从图中可以看出线粒体荧光强度降低 因此，该探针对线粒体膜电位敏感，可以用于观测线粒体膜电位的变化由于该探针在体外对二氧化硫衍生物敏感，因此，我们推断该探针可以观测细胞内二氧化硫衍生物的变化首先，用 2 mmol/L NaHSO3处理HeLa 细胞，然后，用该探针染色 HeLa 细胞，通过记录细胞的相对荧光强度，观测探针对细胞内二氧化硫衍生物的响应 从图5（a）中可以看出，随着处理时间的延长，细胞内探针的荧光强度逐渐降低图 5（b）为图 5（a）中 HeLa 细胞的荧光强度，可以看出，随着时间的延长，荧光强度逐渐降低这说明该探针对细胞内二氧化硫衍生物的响应明显，可以用于观测细胞内 SO2的变化（PVII：ex=488 nm；em=500600 nm；MTDR：ex=638 nm；em=650750 nm），1 表示对照组，2 表示 CCCP 处理组，3 表示多聚甲醛固定组图 4 （a）用 5 mol/L PVII 和 0.2 nmol/L MTDR 染色的 HeLa 细胞、未经处理（对照组）及用含 20 mol/L CCCP 处理或用 多聚甲醛固定后的 HeLa 细胞共聚焦图像；（b）对应（a）中的 PVII 的相对荧光强度（ex=488nm；em=500600 nm）图 5 PVII（5.0 mol/L，20 min）分别染色经 2 mmol/L NaHSO3 处理不同时间的 HeLa 细胞的共聚焦荧光图像图 6 不同浓度 PVII 孵育 HeLa 细胞的存活结果图低细胞毒性是优异荧光探针的一个重要指标，因此，我们测试了探针在 HeLa 细胞中的毒性从图 6 中可以看出，在015 mol/L的浓度范围内，探针具有较高的存活率，即使在15 mol/L的浓度下，细胞在24 h的存活率仍然大于 80%这说明探针的毒性较低，可以用于细胞成像实验3 结论通过有机合成的方法合成了探针 PVII该探针为免洗型多用途探针，对黏度变化敏感，有利于在细胞内的高保真成像；对二氧化硫衍生物敏感，可以在免洗条件下观测细胞内二氧化硫衍生物以及线粒体膜电位的变化此外，该探针毒性较低，生物相容性较好，因此是观测线粒体膜电位和 SO2相关疾病的重要工具，可以有效促进相关学科的发展参考文献 1 TRAIN R E.Sulfur dioxide pollution J.Science,1975,4205(189):748-750.（a）（a）（b）（b）t/minConcentration/（molL-1）0 min10 min30 min45 min常熟理工学院学报（自然科学）2023 年12 2 HRKNEN H,NORDMAN H,KORHONEN O,et al.Long-term effects of exposure to sulfur dioxide.Lung function four years after a pyrite dust explosion J.The American review of respiratory disease,1983,5(128):890-893.3 CRAKER L E,STARBUCK J S.Leaf age and air pollutant susceptibility:Uptake of ozone and sulfur dioxide J.Environmental Research,1973,1(6):91-94.4 NIE A,MENG Z.Study 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Potential YANG Rui,XU Jingyang,ZHAO Yuang,ZHU Tao,CHEN Yuqi,SUN Mengni,CHEN Zhengyang,HAN Zhida,WEI Mengmeng(School of Electronic Information and Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)Abstract:Both sulfur dioxide and cell membrane potential are involved in vital life activities of cells.Therefore,the observation of mitochondrial membrane potential and sulfur dioxide derivatives in cells is critical to the study of the life activities related to them.In view of the fact that fluorescent probes that are currently in use to observe mitochondrial membrane potential and sulfur dioxide derivatives may cause cell damage in the oftentimes requires washing procedure,we designed and synthesized a multipurpose fluorescent probe that can observe both mitochondrial membrane potential and intracellular sulfur dioxide derivatives and the changes of the latter.In addition,the probe affords a relatively advanced biocompatibility:it can function as a critical tool for the diagnosis of diseases related to mitochondrial membrane potential and intracellular sulfur dioxide derivatives,promising high potential to promote the development of related disciplines.Key words:mitochondrial membrane potential;sulfur dioxide derivatives;fluorescent probes;cell imaging