T∕CACM 1326.42-2019 细叶黄皮种子超低温保存技术规程.pdf

ICS 11.120.01 C 23 团体标准 T/CACM 1326.422019 细叶黄皮种子超低温保存技术规程 Technical code of practice for cryopreservation of Clausena anisum-olens(Blanco)Merr seeds 2019-10-17 发布 2019-10-17 实施 中 华 中 医 药 学 会 发 布T/CACM 1326.422019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 种子采收及选择.2 4.1 种子采收.2 4.2 种子选择.2 5 种子前处理.2 5.1 活力.2 5.2 含水量范围.2 6 种子保存量.3 7 种子冷冻方式.3 8 恢复培养.3 8.1 种子解冻处理.3 8.2 冻后种子活力检测.3 8.3 萌芽成苗.3 附录 A（规范性附录）试剂的配置和保存方法.4 参考文献.5 T/CACM 1326.422019 II 前 言 本标准是药用植物顽拗性种子超低温保存系列标准之一，该系列标准结构和名称如下：T/CACM 1326.1 药用植物顽拗性种子超低温保存技术通则；T/CACM 1326.2 白木香种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.3 降香种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.4 益智种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.5 高良姜种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.6 朱砂根种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.7 草豆蔻种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.8 化州柚种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.9 樟种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.10 两面针种子超低温保存技术规程；。本标准按照 GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由中国医学科学院药用植物研究所海南分所提出。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位：中国医学科学院药用植物研究所海南分所、中国医学科学院药用植物研究所。本标准主要起草人：曾琳，魏建和，郑希龙，李榕涛，王秋玲，何明军，金钺，顾雅坤，符丽。T/CACM 1326.422019 1 细叶黄皮种子超低温保存技术规程 1 范围 本标准规定了细叶黄皮 Clausena anisum-olens(Blanco)Merr 种子超低温保存过程中的术语和定义、种子的选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等内容。本标准适用于细叶黄皮种子的液氮超低温长期贮藏。2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.6 农作物种子检验规程 水分测定 GB/T 3543.7 农作物种子检验规程 其他项目检验 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 细叶黄皮 Clausena anisum-olens(Blanco)Merr 为芸香科（Clausena）黄皮属（Clausena Burm.f.）常绿小乔木，又名鸡皮果、山黄皮，其果实、花、叶具有香气。枝、叶作草药，祛风除湿。鲜果可食用，味酸甜，但多食可致轻度麻舌感。民间将熟果晒干，用酒泡浸，谓有化痰止咳功效。收载于世界药用植物速查辞典（2015）。3.2 细叶黄皮果实 Clausena anisum-olens(Blanco)Merr fruits 果实圆球形，偶有阔卵形，径 1 cm2 cm，淡黄色，偶有淡朱红色，半透明，果皮有多数肉眼可见的半透明油点，果肉味甜或偏酸，有种子 12 粒。3.3 细叶黄皮种子 Clausena anisum-olens(Blanco)Merr seeds 细叶黄皮的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子暗黄色，扁平，子叶深绿色。种皮膜质，基部褐色。3.4 种子超低温保存 seed of cryopreservation T/CACM 1326.422019 2 将经过前处理的细叶黄皮种子置于液氮（-196）中保存。4 种子采收及选择 4.1 种子采收 6 月份成熟，当果皮变成黄色，质软时，即可采收，去除果肉，取出种子。4.2 种子选择 挑选发育饱满、完整、健康的种子，置于 4 冰箱中保存备用（存放时间不超过 1 个月）。5 种子前处理 5.1 活力 5.1.1 检测 细叶黄皮种子活力以种子生活力为判别标准。按照 植物生理学实验指导 中的溴麝香草酚蓝（BTB）法测定细叶黄皮种子生活力。待测种子在 30 35 温水中浸种 2 h，随后取吸胀种子 50 粒，整齐地埋于备好的 1.5 BTB 琼脂凝胶中，注意要将胚埋入凝胶中。将培养皿置于 35 温箱中 4 h后观察结果。BTB 的配制和保存方法见附录 A 的 A.1。5.1.2 鉴定及要求 在光下用放大镜对染色结果进行观察鉴定。凡种胚周围出现黄色晕圈的种子为有活力的种子，否则为无活力的种子。待保存的细叶黄皮种子生活力应 95。5.1.3 计算 生活力按照公式（1）进行计算：式中：A生活力；y有活力的种子数；x总的种子数。5.2 含水量范围 用尼龙网袋包裹细叶黄皮种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为 60:1，室温条件下干燥处理 2 h16 h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由 15%20%降至 10%15%。T/CACM 1326.422019 3 按照 GB/T 3543.6 中的高恒温烘干法（130 烘干 1 h）测定种子含水量（W0），并按照公式（2）进行计算：式中：W0含水量，用百分数表示（）；M1种子鲜重，单位为克（g）；M2种子烘后重量，单位为克（g）。6 种子保存量 细叶黄皮种子保存量不少于 300 粒，以便后期的活力检测使用。7 种子冷冻方式 细叶黄皮种子超低温保存的冷冻方式为分步冷冻法，即将装有种子和玻璃化保护溶液（PVS2）的 15 mL 冻存管（每管 30 粒种子）置于 4 冰箱中 0.5 h，取出立即放入-20 冰柜中 1 h，之后迅速投入液氮中保存。PVS2 的配置方法见附录 A 的 A.2。8 恢复培养 8.1 种子解冻处理 液氮中至少冻存 24 h 后，取出 1 个冻存管，立即放入 40 水浴中快速解冻 3 min，而后用洗涤液（DS）浸泡 3 次，每次 5 min，并用纯净水冲洗干净。DS 的配置方法见附录 A 的 A.3。8.2 冻后种子活力检测 取出 15 粒解冻后的种子，按照 5.1 活力检测方法进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力 80 时视为保存成功。8.3 萌芽成苗 将剩下 15 粒解冻后的细叶黄皮种子，播种到带有无菌滤纸的带盖发芽盒中，温度 25 30，湿度 7085 条件下培养。T/CACM 1326.422019 4 A A 附 录 A（规范性附录）试剂的配置和保存方法 A.1 BTB 的配制和保存方法 精密称取 BTB 0.1 g，溶解于煮沸过的 100 mL 纯水中，然后用滤纸去残渣。滤液若呈黄色，可加数滴氢氧化钠溶液，使之变为蓝色或蓝绿色，置于棕色瓶中长期贮存。1.5 BTB 琼脂凝胶：称量 0.1 BTB 溶液 40 mL 置于烧杯中，称取 0.5 g 琼脂，将其剪碎后加入杯中，加热并不断搅拌使之完全溶解。待溶液稍稍冷却即可趁热倒入 9 cm 培养皿中，使之成一均匀的薄层，完全冷却后备用。A.2 PVS2 的配置及保存方法 精密量取甘油 23.8 mL、乙二醇 13.6 mL、二甲亚砜 13.6 mL，称取蔗糖 13.7 g，溶于 MS 溶液中，定容至 100 mL，调 pH 值至 5.8，高温高压灭菌，4 冷藏。注：配置时需戴手套，并在通风厨内操作。A.3 DS 的配置及保存方法 精密称取蔗糖 41.1 g 溶于 MS 溶液中，定容至 100 mL，调 pH 值至 5.8，高温高压灭菌，4 冷藏。T/CACM 1326.422019 5 参 考 文 献 1 肖培根，刘昌孝，江纪武等.世界药用植物速查辞典M.中国医药科技出版社.2015 2 中国科学院中国植物志委员会.中国植物志.第 43(2)卷M.科学出版社，2004(1997)，43(2)：138 3 Zhang Dianxiang.Thomas G.Hartley.David J.Mabberley.Rutaceae M/Flora Of China Beijing:Science Press/St.Louis:Missouri Botanical Garden Press.2008.11:83-85.4 傅家瑞，宋松泉.顽拗性种子生物学M.中国科学文化出版社，2004:1 5 Reed BM.Plant CryopreservationA Practical GuideM.Springer,2010:3 _