长叶红砂钙依赖蛋白激酶Rt...K16的非生物胁迫应答分析_张洁.pdf

第 32 卷第 2 期Vol.32，No.297-1092023 年 2 月草业学报ACTA PRATACULTURAE SINICA张洁，程凯，王迎春.长叶红砂钙依赖蛋白激酶 RtCDPK16的非生物胁迫应答分析.草业学报，2023，32（2）：97109.ZHANG Jie，CHENG Kai，WANG Ying-chun.Analysis of the calcium-dependent protein kinase RtCDPK16 response to abiotic stress in Reaumuriatrigyna.Acta Prataculturae Sinica，2023，32（2）：97109.长叶红砂钙依赖蛋白激酶 RtCDPK16的非生物胁迫应答分析张洁，程凯，王迎春*（省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室，内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，内蒙古大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010040）摘要：植物受到逆境刺激后，钙离子结合蛋白能够感知钙信号并将其解码，激活下游靶蛋白，从而引发胁迫应答反应，钙调蛋白激酶在其中发挥了重要作用。长叶红砂为东阿拉善-西鄂尔多斯特有的珍稀泌盐植物，对干旱、盐碱等环境胁迫具有极强的适应性。本研究基于转录组数据，克隆了长叶红砂钙调蛋白激酶 RtCDPK16的开放阅读框（open reading frame，ORF），氨基酸序列比对和进化分析显示，其与拟南芥的同源性为 78.46%，与葡萄 VvCDPK16同源性最高（80.97%）。基因表达特性分析显示，RtCDPK16在根茎叶中均表达，且在根中表达量最高，同时其表达水平可被氯化钠（NaCl）/聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）/冷胁迫（cold stress，cold）/脱落酸（abscisic acid，ABA）等多种环境胁迫和氯化钙（calcium chloride，CaCl2）显著诱导。构建植物表达载体并转化拟南芥，对野生型拟南芥（WT）和过表达拟南芥（OE）株系进行干旱、盐和脱落酸胁迫，发现胁迫处理下 OE 株系的根长、鲜重和叶绿素含量等表型指标均显著高于 WT，表明 RtCDPK16的超表达使转基因株系获得了更强的胁迫耐受性；生理生化指标检测显示，胁迫处理下各株系中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）等抗氧化酶活性及脯氨酸（proline，Pro）、可溶性糖（soluble sugar，SS）等渗透调节物质的含量均被显著诱导，且超表达株系显著高于 WT，而过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）/超氧阴离子（superoxideanion，O2-）的积累量显著低于 WT；实时荧光定量（quantitativereal-time，qRT-PCR）检测发现，胁迫条件下 OE 株系的相关抗氧化酶基因、ABA 合成和信号途径关键元件基因及脯氨酸合成基因均被显著诱导。以上结果表明，RtCDPK16在拟南芥中的超表达通过调控转基因植物中抗氧化和渗透调节系统相关基因的表达和酶活性，促进转基因植物的渗透平衡和活性氧（reactive oxygen species，ROS）稳态的维持，进而提高转基因植物的胁迫耐受性，这一过程可能是通过依赖于 ABA信号的途径实现的。关键词：长叶红砂；非生物胁迫；RtCDPK16；抗氧化；渗透调节Analysis of the calcium-dependent protein kinase RtCDPK16 response to abioticstress in Reaumuria trigynaZHANG Jie，CHENG Kai，WANG Ying-chun*State Key Laboratory of Reproductive Regulation and Breeding of Grassland Livestock，Key Laboratory of Herbage&Endemic CropBiotechnology in Inner Mongolia，School of Life Science，Inner Mongolia University，Hohhot 010040，ChinaAbstract：Calmodulin kinase is a crucial component of calcium-binding proteins，which read and decode calciumDOI：10.11686/cyxb2022198http：/收稿日期：2022-05-05；改回日期：2022-07-28基金项目：内蒙古自治区自然科学基金重大项目（2020ZD07）和国家自然科学基金项目（32060404）资助。作者简介：张洁（1994-），女，内蒙古达拉特旗人，在读博士。E-mail： 通信作者 Corresponding author.E-mail：Vol.32，No.2ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）signals and activate downstream target proteins to initiate stress responses in plants after stress stimulation.Reaumuria trigyna，a rare and uncommon salt-producing plant found only in east Alxa and west Ordos，is veryresilient to environmental challenges including drought and salinity.Based on transcriptome information，the openreading frame（ORF）of RtCDPK16 was cloned in this study.The ORF shared 78.46%similarity with Arabidopsisthaliana and 80.97%identity with CDPK16 in Vitis vinifera，according to amino acid sequence alignment andevolutionary analyses.RtCDPK16 was found to be expressed in roots，stems，and leaves，with roots expressing it atthe highest level.Stress conditions such as sodium chloride（NaCl）/macrogol（polyethylene glycol，PEG）/coldstress（cold）/abscisic acid（ABA）and other environmental stresses and calcium chloride（CaCl2）were shown togreatly increase RtCDPK16 expression levels.Construction of plant expression vector and transformation of A.thaliana.Drought，salt and abscisic acid stress were applied to wild type Arabidopsis（WT）and overexpressionArabidopsis（OE）strains.The results showed that root length，fresh weight，chlorophyll content and otherphenotypic indicators of OE strain were significantly higher than WT under stress treatment，indicating that theoverexpression of RtCDPK16 made the transgenic strain obtain stronger stress tolerance.Physiological andbiochemical indexes showed that，in each strain under stress treatment，the activities of antioxidant enzymes such assuperoxide dismutase（SOD），Peroxidase（POD），catalase（CAT）and the content of osmotic regulators such asproline（Pro）and soluble sugar（SS）were significantly induced，and the OE strain was significantly higher thanWT，while the accumulation of hydrogen peroxide（H2O2）/superoxide anion（O2-）was significantly lower thanWT.Quantitative real-time（RT-PCR）detection found that the genes related to antioxidant enzymes，ABAsynthesis and key elements of signal pathway，and proline synthesis genes of OE strains were significantly inducedunder stress.The above results indicate that the overexpression of RtCDPK16 in Arabidopsis can promote theosmotic balance and ROS（reactive oxygen species）homeostasis by regulating the genes expression of antioxidantenzyme and osmotic regulation in transgenic plants，and thus improve the stress tolerance of transgenic plants.Thisprocess may be achieved through ABA signal dependent approaches.Key words：Reaumuria trigyna；abiotic stress；RtCDPK16；antioxidant；osmotic regulation植物在生长发育过程中往往会遭遇干旱、水涝、高温、冷害、高盐等非生物胁迫，使其正常生长受到限制，甚至可能造成其死亡1-2。在长期适应过程中，植物逐渐形成了各种调控机制来应对不利的生存环境，钙信号传导系统就是其中之一1，3。当植物受到逆境刺激后，钙离子结合蛋白能够感知钙信号并将其解码，进而调节下游靶蛋白，引发一系列的胞内反应1，4。在高等植物中，有 4类钙离子结合蛋白，包括钙调素（calmodulin，CaM）、钙调素类蛋白（calmodulin-like protein，CML）、钙依赖蛋白激酶（calmodulin-dependent protein kinases，CDPKs）及类钙调磷酸酶 B 亚基蛋白（calcineurin B-like protein，CBL）1，5-6。其中，钙依赖蛋白激酶（CDPKs）是植物细胞中 Ca2+的主要传感器，在各种植物发育过程和适应非生物胁迫中发挥重要作用7-10。CDPK 也称 CPK，是 Ser/Thr 蛋白激酶，具有一个可变的 N 端结构域和 3个功能结构域，包括一个蛋白激酶结构域、一个自身抑制结构域和一个钙调蛋白结合结构域，通常含有 4 个 EF-Hand11-12。CDPK 在植物根、茎、叶、果实和种子中均有高度表达11，13。目前在不同物种的基因组中分别鉴定出大量 CDPK 基因，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）中 34 个、水稻（Oryza sativa）31 个、玉米（Zea mays）25 个和毛果杨（Populus trichocarpa）20个6，11，14。逆境通常会改变植物细胞内 Ca2+的含量，激活 CDPKs的活性，从而调控植物体内离子稳态、抗氧化酶活性及逆境基因的表达15。对从不同的植物中克隆得到的 CDPKs基因的功能研究表明，CDPKs在植物对非生物胁迫的响应中发挥了重要作用，过表达 OsCPK12 提高了水稻转基因株系的抗氧化酶活性，减少了活性氧（reacitveoxygen species，ROS）的积累，增强了其耐盐性16-17；过表达 OsCPK13 显著提高了水稻转基因株系的低温抗性18；低温会诱导玉米 ZmCPK1高表达，同时抑制 ZmCPK25的表达，提高其抗寒性19。玉米中过表达 ZmCPK4能增加转基因株系中渗透调节物质含量，提高抗旱性20。一些 CDPKs还可以通过脱落酸（abscisic acid，ABA）信98第 32 卷第 2 期草业学报 2023 年号途径，作为非生物胁迫反应的正或负调控因子发挥作用8，21。胁迫条件下 AtCPK3和 AtCPK6正调控保卫细胞离子通道的开放和 ABA 依赖的气孔信号传导22-23。拟南芥 CPK10突变体在 ABA 和 Ca2+作用下表现出诱导气孔关闭的特征，推测 CPK10可能通过 ABA 信号途径调节气孔运动，进而提高拟南芥对干旱胁迫的耐受性24。相反，CPK21 的功能丧失则使拟南芥幼苗对高渗胁迫具有更高的耐受性，突变株系在标记基因表达和代谢物积累方面均表现出增加的胁迫反应25。然而迄今为止，有关 CDPKs 的报道依然主要集中在拟南芥、水稻、小麦（Triticum aestivum）和玉米等模式作物及农作物中，针对其他野生抗逆植物中 CDPKs的功能研究报道较少。长叶红砂（Reaumuria trigyna），柽柳科（Tamarieaceae）琵琶柴属（Reaumuria），起源十分古老的珍稀泌盐小灌木，限制性分布于我国西部东阿拉善-西鄂尔多斯地区，对恶劣的生存环境具有极强的适应性11。为了解析该植物的抗逆机制，本实验室前期已对其进行转录组测序，并对 RtNHX1、RtLDOX2、RtNAC100 等基因功能开展研究，发现这些基因通过调控离子稳态、氧化平衡、渗透调节等途径，在植物抵抗非生物胁迫中发挥重要作用26-28。然而，针对长叶红砂的钙传感蛋白在其响应环境胁迫中的调控作用尚未开展研究。本研究对长叶红砂转录组数据（编号：SRP008320）分析发现，钙依赖蛋白激酶相关基因 RtCDPK16在盐胁迫下表达量较高，并对其进行了生物信息和表达特性分析；同时在拟南芥中超表达鉴定基因功能，为探讨 RtCDPK16作为钙传感蛋白参与植物逆境响应调控作用奠定了基础。1材料与方法1.1试验材料长叶红砂种子于 2017年 10月采集于内蒙古乌海市，充分干燥后在-20 春化 30 d。1.2RtCDPK16基因的克隆、表达特性分析及生物信息学分析基于长叶红砂转录组数据分析，基因 Unigene430被注释为钙依赖蛋白激酶，与拟南芥的 CDPK16基因相似度较高，其完整开放阅读框（open reading frame，ORF）为 1689 bp。设计特异性引物 RtCPK16-F 和 RtCPK16-R，以长叶红砂 cDNA 为模板，克隆完整 ORF；利用在线软件进行基因生物信息学分析；利用 qRT-PCR检测聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、NaCl、ABA、冷胁迫（cold stress，Cold）、CaCl2处理下长叶红砂幼苗中的 RtCDPK16基因的表达量，引物见表 1。1.3RtCDPK16基因的亚细胞定位亚细胞定位使用 21 d 烟草（Nicotiana tabacum）幼苗，载体为 pPCAMBIA-1300 和专一性的质膜 Marker。共同培养目的载体和 Marker后瞬时表达烟草，使用激光共聚焦观察定位。1.4不同胁迫下过表达 RtCDPK16拟南芥的抗逆性分析1.4.1不同胁迫下过表达 RtCDPK16 拟南芥的鉴定及生长指标测定采用农杆菌花苞浸染法浸染拟南芥，T3代中挑选表达量相对较高的 D1、D5和 D6三个过表达（over expression，OE）株系。将 OE 株系和野生型（wildtype，WT）种子播种于 1/2 MS 和 125 mmol L-1NaCl、300 mmol L-1D-甘露醇（D-Mannitol）、3 mol L-1ABA培养基，一部分萌发 10 d 后用于观察萌发率，一部分立体放置培养 5 d 后，再分别移至 3 种胁迫培养基竖直培养10 d 观察根长和侧根数。种子萌发 15 d 后移至营养土中培养 20 d，选取长势一致的幼苗分别用 200 mmol L-1NaCl，100 mol L-1ABA 水溶液胁迫处理幼苗 14 d；停止浇水 10 d检测耐旱性，称量鲜重及利用荧光法测定叶绿素含量11。1.4.2不同胁迫下过表达 RtCDPK16拟南芥的生化指标测定根据苏州科铭试剂盒所带说明书测定抗氧化酶 SOD、POD、CAT、抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）、还原性谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（glutathione disulfide，GSSG）活性，H2O2、O2-及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及渗透调节物质脯氨酸、可溶性糖和甜菜碱（betaine）含量。1.4.3不同胁迫下过表达 RtCDPK16拟南芥叶片的 DAB 和 NBT 染色剪不同胁迫处理下 3片叶子，浸没于1 mg mL-1二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）和 0.5 mg mL-1氯化硝基四氮唑蓝液（nitrotetrazolium bluechloride，NBT）的工作液中，暗处理 12 h后取出叶片用无水乙醇冲洗，并煮沸 5 h脱去叶绿素，冷却后制片，体视显微镜下观察并拍照。99Vol.32，No.2ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）1.4.4不同胁迫下过表达 RtCDPK16 拟南芥抗逆相关基因的表达量分析提取不同胁迫处理下拟南芥RNA，反转录得到 cDNA，基因定量分析，相关引物序列如表 1。1.5数据处理与分析采用 IBM SPSS Statistics 22 进行数据显著性分析，GraphPad Prism 7 统计数据并绘图，采用 Duncan s多重比较和 Student t检验进行显著性差异分析。2结果与分析2.1RtCDPK16基因氨基酸序列比对和进化分析将 RtCDPK16的氨基酸序列与其他物种进行同源比对发现，RtCDPK16蛋白与模式植物拟南芥 AtCDPK16（A.thaliana，Q7XJR9.1）的同源性为 78.46%，与葡萄 VvCDPK16（Vitis vinifera，KF042356.1）的同源性最高，为 80.97%。利用 MEGA 6.0对长叶红砂和拟南芥、葡萄（V.vinifera）以及山麻黄（Parasponia ersonii）等含有的CDPK 序列构建了系统进化树，发现 RtCDPK16 与菠菜（Spinacia oleracea）的亲缘关系较近且聚为一类，与麦瓶草（Silene vulgaris）和藜（Chenopodium alblum）的亲缘关系相对较远（图 1）。2.2RtCDPK16基因的表达特性分析和亚细胞定位qRT-PCR 分析显示，该基因在长叶红砂根、茎、叶中均有表达，其中根的表达量最高，叶次之，茎最低（图2）。同时，PEG、NaCl、ABA、cold 以及高钙胁迫处理，均能显著诱导该基因的表达，干旱对其诱导作用最为强烈。激光共聚焦显微镜观察 RtCDPK16基因定位情况表明，空载 GFP在烟草细胞所有部位表达，RtCDPK16-GFP融合蛋白的绿色荧光与质膜标记蛋白（ER marker cherry）的红色荧光则均在细胞膜稳定表达；当两者互相重合时，细胞膜呈现出黄色荧光，表明 RtCDPK16在植物细胞中定位于细胞膜（图 2）。2.3过表达 RtCDPK16对拟南芥耐受非生物胁迫的影响将 pPZP221-RtCDPK16 真核表达载体通过花序浸染法转化至拟南芥（T0代）中。以 T1拟南芥叶片基因组DNA 为模板进行 PCR扩增和电泳，发现转基因株系 D1D6均在 1700 bp处有明显条带，而野生型拟南芥（WT）无表 1RT-PCR引物序列Table 1RT-PCR primer sequences（5-3）引物 PrimerRtCDPK16RtCDPK16-QRtActin-QRtCDPK16-1300AtActinAtPOD1AtSOD1AtCAT1AtAPX1AtP5CS1AtRD29AAtDREB2AAtRD22AtABF4AtSnRK2.2AtSnRK2.3AtNCED3上游引物序列 Forward primer sequences（F）CGCTCTAGAATGGGTTCTTGTTTCTCGTGGATGCTCAAGCGAGAAGTCCTGGATTCTCCTGATGGTGTGTCTCGCGAGCTCATGGGTTCTTGTTTCTGGATTCTGGTGATGGTGTGTCTAAAGCGAACATTTTACTCTGGGAGGAAACATCACTGTTGGAGATTCCTGTTATCGTTCGTTTCTCAAAATACGTCCCTGATGAAGATGGCGCATAGTTTCTGATGCAATTCTGTAAGGACGACGTTTACAAACCTGTCAGAACAACAGCAGGGATTTGTCTATGCACTGCTCTGAACAACTTAGGAGGTGGTGGTCATATGCCATCGGGATCTGAAGTTGGATGGAAGTCCTGCTCGATGAATTTGTTACTGAGAGCG下游引物序列 Reverse primer sequences（R）CGCGAGCTCTCACAGCTTACGTGAATCCAGCAATTCACCGCCTTCACGAACCACCGATCCAGACTCGATACCGCTCTAGACAGCTTACGTGAAGGAACCACCGATCCAGACACTGTACCAACAAGTCAATCCTCTAGGGAGTTTGTGATCGCAGAGAGGAACAAAGTTCCCCTCTCTGGTGTACGAGCTACGATCGCACACAGTGCAACTTCGTGATCCTCTGCGTACTCGTTACATCCTCTGTTTTAAGCCTGCAAACACATCGTCGCTGGAAGCTTTCTGTTACAAACGCTTCAGGAGTTCATCCATGTTCTTGGTTGGGAATGAAGAACAGTGCCATCATATTCCTGACGAAACACTAGGATCAGCCGTTTTA100第 32 卷第 2 期草业学报 2023 年此条带。将上述筛选得到的 6个转基因株系用含庆大霉素抗生素的培养基筛选至 T3代，RT-PCR 定量分析 6个株系中 RtCDPK16 基因的表达情况，发现 D1/D5/D6三个株系的表达量较高且能够稳定遗传，可用于后续研究（图 3）。对过表达 RtCDPK16拟南芥进行盐、甘露醇、ABA 胁迫处理，表型分析显示 3种胁迫下过表达株系比野生型具有更高的存活率，生长状态明显优于野生型。胁迫处理后，各株系的根系发育均受到明显抑制，但过表达株系主根长及侧根数均显著高于野生型（图 4）。图 1RtCDPK16基因氨基酸序列比对和进化分析Fig.1Amino acid sequence alignment and evolution analysis of RtCDPK16*：代表长叶红砂中的 RtCDPK16这个基因 Represents the gene RtCDPK16 in R.trigyna101Vol.32，No.2ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）为进一步确定 RtCDPK16在拟南芥胁迫响应中所发挥的作用，对各株系进行土培实验，发现在正常条件下，拟南芥的生长状况无明显差异；NaCl胁迫下，野生型植株相比转基因株系叶片生长受限，莲座叶较小，叶片萎蔫程度较大；甘露醇胁迫下，各株系均表现出叶片严重失水、萎蔫枯黄，但过表达株系与野生型相比所受影响较小；ABA 处理下，过表达株系相比野生型叶片卷曲黄化程度较小，生长表型明显优于野生型。NaCl、ABA、甘露醇处理下，拟南芥过表达株系的鲜重和叶绿素含量均明显高于野生型（图 5）。2.4过表达 RtCDPK16对转基因拟南芥抗氧化能力的影响为了进一步探讨过表达 RtCDPK16对转基因拟南芥抗氧化能力的影响，检测了 NaCl、甘露醇和 ABA 胁迫处理下，拟南芥各株系的 ROS积累和氧化损伤情况，结果显示，3种胁迫下过表达株系的丙二醛（MDA）和电解质渗漏率（electrical leakage，EL）均显著低于野生型。DAB 和 NBT 染色结果显示，正常条件下，野生型与过表达株系叶片无明显的颜色差异，胁迫处理后，过表达株系相比野生型产生了较少的褐色和蓝色物质，表明转基因株系中图 2RtCDPK16的表达特性与亚细胞定位分析Fig.2RtCDPK16 specific expression and subcellular localization analysis不同小写字母表示不同处理间差异显著（P0.05）。下同。Different lowercase letters indicate significant differences between the different treatmentsat the 0.05 level.The same below.图 3RtCDPK16转基因拟南芥的鉴定Fig.3Identification of RtCDPK16 transgenic A.thalianaM：标记；WT：野生型；D1D6：RtCDPK16的 6个过表达株系。下同。M：Marker；WT：Wild-type；D1-D6：Six overexpressing lines of RtCDPK16.The same below.102第 32 卷第 2 期草业学报 2023 年积累的 H2O2和 O2-相比野生型较少；H2O2和 O2-的含量检测结果与染色分析结果一致，胁迫处理下，野生型的H2O2和 O2-的积累速率和含量均显著高于过表达株系（图 6和图 7）。图 4不同胁迫对转基因拟南芥幼苗存活率和根部发育的影响Fig.4Effects of different stress on the survival rate and root development of transgenic Arabidopsis seedlings图 5不同胁迫下拟南芥的生长表型及生理指标Fig.5Growth phenotype，and physiological indicators of Arabidopsis under different stress103Vol.32，No.2ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）图 6不同胁迫下的拟南芥叶片的 DAB与 NBT染色Fig.6DAB and NBT staining of Arabidopsis leaves under different stress图 7不同胁迫下的拟南芥 ROS的积累Fig.7ROS accumulation of Arabidopsis under different stress104第 32 卷第 2 期草业学报 2023 年进一步检测了盐、甘露醇和 ABA 胁迫下，野生型和过表达株系中抗氧化酶 SOD、POD、CAT 的活性，AsA、GSH、GSSG 及渗透调节物质脯氨酸、可溶性糖和甜菜碱的含量，结果显示，胁迫处理显著诱导各株系抗氧化酶活性以及抗氧化剂和渗透调节物质积累，过表达株系中 SOD、POD、CAT 酶活性，AsA、GSH 以及脯氨酸、可溶性糖和甜菜碱的含量均显著高于野生型，但 GSSG 含量显著低于野生型（图 8）。表明过表达 RtCDPK16显著提升了胁迫处理下转基因拟南芥的抗氧化和渗透调节能力。图 8不同胁迫下拟南芥的抗氧化酶活性和渗透调节物质含量Fig.8Antioxidant enzyme activity and content of osmotic regulators of Arabidopsis under different stress105Vol.32，No.2ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）2.5过表达 RtCDPK16对拟南芥中胁迫相关基因表达量的影响利用 qRT-PCR 检测盐、甘露醇和 ABA 胁迫下拟南芥中胁迫相关基因的表达量，结果表明，胁迫处理下抗氧 化 酶 相 关 基 因（AtSOD1、AtPOD1、AtCAT1、AtAPX1）、胁 迫 响 应 相 关 基 因（AtRD29A、AtDREB2A、AtRD22）、脯 氨 酸 合 成 基 因 AtP5CS1 以 及 ABA 合 成 和 信 号 通 路 关 键 元 件 基 因（AtNCED3、AtABF4 和AtSNRK2.2/2.3）均在过表达株系中被显著诱导表达，表达量明显高于野生型，表明过表达 RtCDPK16促进了胁迫响应相关基因和 ROS清除相关酶基因在转录水平的提高（图 9）。3讨论3.1过表达 CDPKs对植物非生物胁迫的耐受性的影响许多研究表明，CDPKs 参与了植物对多种非生物胁迫的耐受调控。干旱、高盐和低温显著诱导拟南芥中AtCDPK1和 AtCDPK2的表达，同时过表达 AtCDPK1能显著提高转基因株系的叶绿素含量和鲜重，缓解盐胁迫带来的生长抑制29。研究发现过表达唐古特白刺（Nitraria tangutorum）NtCDPK1可以显著降低转基因拟南芥的根长和侧根数减少率，降低胁迫下叶片的黄化萎蔫程度，促进生物量和叶绿素的积累，从而提高其耐盐耐旱及耐冷性1。在拟南芥中异源表达胡杨（Populus euphratica）PeCPK10 基因可以显著提高转基因拟南芥的耐寒能力30；过表达葡萄的 VaCPK20可以提高转基因拟南芥在干旱和盐胁迫下的存活率31。本研究从泌盐盐生植物长叶红砂中克隆了 RtCDPK16基因并将其在拟南芥中过表达，验证其基因功能，结果证实，RtCDPK16提高了转基因拟南芥幼苗在盐、干旱及 ABA 胁迫下的存活率、根长和侧根数、鲜重和叶绿素含量，表明过表达 RtCDPK16可有效缓解转基因株系因胁迫引起的生长抑制，增加其对胁迫的耐受性。3.2CDPKs对植物活性氧的积累和清除能力的影响非生物胁迫诱导活性氧（ROS）的积累，而 ROS作为一种有毒分子引起细胞的氧化损伤32。植物在抵抗非生物胁迫中已经进化出了防御系统，以尽量减少和防止 ROS 对细胞的氧化损伤，维持细胞的氧化还原稳态33-34。马铃薯（Solanum tuberosum）的 CDPK4 和 CDPK5 能通过磷酸化 NADPH 氧化酶来调节 ROS 的产生35，水稻图 9不同胁迫下相关基因的表达量Fig.9Expression of related genes under different stress106第 32 卷第 2 期草业学报 2023 年OsCPK12的过表达降低了盐胁迫条件下转基因株系中 H2O2含量，提高了水稻的耐盐能力36。水稻 OsCDPK4的超表达显著降低了转基因植物膜脂过氧化程度，提高细胞膜的完整性，从而提高水稻的耐盐耐旱能力37，玉米ZmCPK4在拟南芥的过表达同样能增加渗透调节物质的含量，保证细胞膜的完整性，进而提高转基因拟南芥的抗旱性20。此外，CDPKs除抑制活性氧的产生，还可以通过提高抗氧化酶的活性，积极清除体内活性氧来应对胁迫。水稻中过表达 OsCPK4/12/13 均可以显著提高转基因植株的 SOD/POD/CAT/抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）等相关抗氧化酶活性，增加脯氨酸和可溶性糖的含量，从而降低 MDA 含量，积累更少的 ROS，提高水稻的低温抗性36-38。也有研究发现，CDPKs有时也作为负调控因子起作用39。例如突变拟南芥的 CPK21，能显著提高其抗氧化酶活性及脯氨酸含量，降低电导率，表现出比野生型更强的耐旱性25。本研究发现，在拟南芥中过表达长叶红砂 RtCDPK16显著降低了拟南芥的膜损伤程度，缓解了电解质渗漏，使转基因植物积累较少的 H2O2和 O2-，显著提高了胁迫条件下转基因拟南芥的抗氧化酶 SOD、POD、CAT 活性，增加了抗氧化剂 AsA、GSH 和渗透调节物质脯氨酸、可溶性糖和甜菜碱的含量，从而提高了转基因株系的抗氧化和渗透调节能力，降低了细胞膜的氧化损伤程度和电解质渗透率。同时发现转基因株系的抗氧化酶基因 AtSOD1、AtPOD1、AtAPX1、AtCAT1，脯氨酸合成关键基因 AtP5CS1 在胁迫条件下被显著诱导表达，过表达 RtCDPK16 在转录水平上调控了抗氧化酶基因和渗透调节物质基因的高表达，从而促进了酶活性的升高和脯氨酸/可溶性糖含量的增加，使转基因植物比野生型具有更高的氧化和渗透平衡调节能力。3.3CDPKs参与调控 ABA信号的分子机制对抗逆性的影响CDPKs通过参与 ABA 信号转导，介导植物对非生物胁迫的耐受性40。有报道称拟南芥 CDPKs通过磷酸化ABA 响应元件结合因子（ABFs）参与 ABA 信号通路，如拟南芥 CPK4和 CPK11参与了 ABA 调控的生理过程，包括种子萌发、幼苗生长、气孔运动和对盐胁迫的耐受性。CPK4 和 CPK11 可以磷酸化两个 ABA 响应转录因子ABF1 和 ABF4，表明它们在 CDPK 介导的 ABA 信号通路中是正调控因子41。拟南芥 CPK32 与 ABF4 相互作用，并在体外可以磷酸化 ABF4，表明 CPK32 可以通过磷酸化 ABF4 调控 ABA 应答基因的表达，进而参与 ABA信号通路对胁迫的应答42。此外，拟南芥的 CPK10突变体在 ABA 和 Ca2+作用下表现出气孔关闭诱导和气孔开放抑制受损24。本研究发现胁迫条件下转基因拟南芥中 ABA 合成及信号通路相关基因 AtABF4、AtSNRK2.2/2.3 和 AtNCED3 的表达量均显著高于野生型，推测 RtCDPK16 的超表达可能促进植物 ABA 信号的转导，通过ABA信号通路调节下游相关胁迫应答反应。4结论1）RtCDPK16的过表达有利于转基因拟南芥氧化平衡的维持，减轻胁迫引起的氧化损伤，提高了抗氧化酶活性，缓解了胁迫带来的 ROS积累，增加了渗透调节物质的积累，促进了转基因植物的抗逆性。2）RtCDPK16作为一个正调控因子在植物抗逆过程中发挥作用。3）RtCDPK16可能促进 ABA参与植物对胁迫的应答，通过 ABA信号通路调节应对相关非生物胁迫。参考文献 References：1 Tang Y C.Physiological response of ex