向天果中柠檬苦素类化合物对...INS-1细胞保护作用研究_翟语桐.pdf

第 51 卷第 3 期2023 年 2 月广 州 化 工Guangzhou Chemical IndustryVol.51 No.3Mar.2023向天果中柠檬苦素类化合物对氧化损伤下INS-1 细胞保护作用研究翟语桐,张刘颖,叶升敏,冯琛博,刁康阳,饶承钿,段静雨(徐州医科大学药学院,江苏省新药研究与临床药学重点实验室,江苏 徐州 221004)摘 要:为了探究向天果中 swietenine(Stn)及 swietenolide(Std)对氧化损伤下 INS-1 细胞保护作用。使用不同浓度的过氧化氢作用于 INS-1 细胞 4 h,CCK-8 法筛选出合适的造模条件;将向天果正丁醇层活性成分 Stn、Std 和阳性药格列齐特(Gli)作用于INS-1 细胞 24 h,CCK-8 法筛选出化合物的安全作用浓度;在过氧化氢损伤模型下,将化合物作用于 INS-1 细胞 24 h 后,分别检测细胞活力并计算细胞存活率和 ROS 水平变化;使用胰岛素 ELISA 试剂盒检测葡萄糖浓度分别为 3.3 mM 和 16.7 mM 刺激下的胰岛素分泌量,模拟 BIS 和 GSIS 下胰岛素分泌量。化合物 Stn、Std 可以提高氧化损伤下 INS-1 细胞的存活率,促进胰岛素分泌,降低 ROS 水平,促进细胞增殖,改善细胞凋亡状况。化合物 Stn、Std 可保护氧化损伤下 INS-1 细胞。关键词:向天果;氧化损伤;INS-1;swietenine;swietenolide中图分类号:TK224.1 文献标志码:B文章编号:1001-9677(2023)03-0104-04 基金项目:江苏省大学生创新创业训练计划项目(202210313096Y)。第一作者:翟语桐(2002-),在读学士。通讯作者:段静雨,博士,副教授,研究方向为中药活性物质筛选及中药药理学。Protective Effects of Swietenine and Swietenolide Isolated fromSwietenia Macrophylla King on INS-1 Cells Induced by Oxidative DamageZHAI Yu-tong,ZHANG Liu-ying,YE Sheng-min,FENG Chen-bo,DIAO Kang-yang,RAO Cheng-dian,DUAN Jing-yu(School of Pharmacy,Jiangsu Key Laboratory New Drug Research and Clinical Pharmacy,Xuzhou Medical University,Jiangsu Xuzhou 221004,China)Abstract:In order to explore the protective effect of Swietenine(Stn)and Swietenolide(Std)on INS-1 cells underoxidative damage,INS-1 cells were treated with different concentrations of hydrogen peroxide for 4 h,and the appropriatemodeling conditions were screened by CCK-8 method.Ins-1 cells were treated with Stn,Std and gliclazide(Gli)for 24 h.The safe concentration of the compounds was screened by CCK-8 method.Under the model of hydrogen peroxide injury,INS-1 cells were treated with the compound for 24 h,and the cell viability,cell survival rate and ROS level weredetected,respectively.Insulin secretion stimulated by 3.3 mM glucose and 16.7 mM glucose was detected by insulinELISA kit to simulate the insulin secretion under BIS and GSIS.The final results showed that compounds Stn and Stdcould improve the survival rate of INS-1 cells under oxidative injury,promote insulin secretion,reduce ROS level,promote cell proliferation,and improve cell apoptosis.Compounds Stn and Std could protect INS-1 cells from oxidativedamage.Key words:Swietenia macrophylla;N-butanol layer;swietenine;swietenolide向天果是楝科桃花心木属植物大叶桃花心木(Swieteniamacrophylla King)的果实,因其果实向天生长而得名1。马来西亚草药目录 中记载,向天果味苦、涩、性凉,解热、收敛2。当地百姓常将向天果煎煮服用来治疗糖尿病、高血压、高血脂等内分泌失调病症3。近几年国内外的研究表明,向天果具有治疗糖尿病的临床功效,同时还有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤的药理活性4。糖毒性是导致胰岛 细胞凋亡的直接原因,主要以葡萄糖毒性为主,促进 ROS 和一些糖基化终端产物葡萄糖胺的生成,从而出现胰岛 细胞表现出氧化应激的状态,导致胰岛 细胞功能的损伤,诱发凋亡,而线粒体在凋亡过程中起关键作用5。在线粒体凋亡通路中,抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白 Bax 是传递凋亡信号的关键蛋白,线粒体膜受损形成孔道导致释放其内部各种调控凋亡蛋白,氧化应激会上调促凋亡基因 Bax 表达,下调抗凋亡基因 Bcl-2 表达6,这些因素加剧了调控凋亡的相关蛋白从线粒体膜间隙释放,引发下游凋亡的级联反应,促使细胞凋亡7。因此,本实验以大第 51 卷第 3 期翟语桐,等:向天果中柠檬苦素类化合物对氧化损伤下 INS-1 细胞保护作用研究105 鼠 INS-1 细胞为基础建立氧化损伤模型。通过检测胰岛素分泌量、ROS 水平变化、细胞存活率等,探究向天果中柠檬苦素类化合物 swietenine 及 swietenolide 保护 INS-1 细胞的作用机制,为开拓抗型糖尿病药物研究提供实验依据和新方向。1 材料与仪器1.1 材 料实验中所用的材料 swietenine(Stn)及 swietenolide(Std)均为本实验室中分离得来,纯度大于 99.9%。1.2 仪 器实验中用到的主要仪器有:IX53 倒置显微镜,OLYMPUS公司;BX43F 正置荧光显微镜,OLYMPUS 公司;VE 180 Tanon垂直电泳系统,上海天能科技公司;164-5052 Western 电泳-转印电源,Bio-Rad 公司;170-3940 Bio-Rad 半干转印系统,Bio-Rad 公司;电泳仪,Hoefer 公司;凝胶照相分析系统,Bio-Rad公司。1.3 试 剂格列齐特(Gli),10 mmol/L PBS buffer,PBST 洗膜液等。2 实验方法2.1 H2O2诱导 INS-1 细胞氧化损伤条件的筛选及格列齐特(Gli)对 INS-1 细胞安全作用浓度的筛选本实验分组为 H2O2浓度组和空白对照组,同时每组设 5个复孔。使用酶标仪测定 450 nm 处吸光度 INS-1 细胞存活率计算:细胞存活率=(A空白-A加药)/A空白100%2.2 化合物 Stn、Std 对 INS-1 细胞低、中、高剂量的筛选化合物浓度设置为 2 M、5 M、8 M、10 M、15 M、20 M、30 M、40 M、50 M,方法同 2.1。2.3 化合物 Stn、Std 对氧化损伤下 INS-1 细胞存活率的影响本实验分为空白对照组、模型组、阳性药组、Stn 低、中、高剂量组、Std 低、中、高剂量组,同时每组设置 5 个复孔。加入终浓度为 10 M 的 Gli 为阳性药组,Stn 终浓度为:5、15、30 M,Std 终浓度为:5、20、50 M,每孔加入 100 L 培养液,空白对照组和模型组加入等量空白培养液,37,5%CO2,培养箱孵育 24 h;其余方法同 2.1。2.4 化合物 Stn、Std 对氧化损伤下 INS-1 细胞内ROS 水平的影响本实验分为空白对照组、模型组、阳性药组、Stn、Std 低剂量组、Stn、Std 中剂量组、Stn、Std 高剂量组,同时每组设置 5 个复孔。使用酶标仪测定荧光强度,488 nm 为激发波长,525 nm 为发射波长。2.5 化合物 Stn、Std 对氧化损伤下 INS-1 细胞胰岛素分泌量的影响本实验分为空白对照组、模型组、阳性药组、Stn、Std 低剂量组、Stn、Std 中剂量组、Stn、Std 高剂量组,同时每组设置 3 个复孔。按照大鼠胰岛素 ELISA 试剂盒(泉州睿信生物科技公司)的操作步骤进行胰岛素分泌量的检测;在 450 nm 波长处测定各孔的 OD 值;将测定的 OD 值代入标准曲线,计算各孔的胰岛素分泌量。3 结 果3.1 筛选 H2O2对 INS-1 细胞诱导损伤的条件如图1 所示,各个浓度下 H2O2对 INS-1 细胞在处理4 h 内细胞存活率的变化情况,以 50 1000 M 浓度的 H2O2处理4 h,50 200 M 浓度内细胞存活率下降平缓,并保持在 80%以上,在 200 500 M 浓度内细胞对 H2O2的浓度变化表现为十分敏感,细胞存活率急剧下降,细胞存活率迅速降至 20%左右,在 600 1000 M 浓度内细胞存活率下降平缓,推测在此浓度下细胞已经出现急性损伤导致死亡。最终选用 300 MH2O2处理 4 h 作为造模条件。图 1 不同浓度 H2O2处理下的细胞存活率Fig.1 Cell survival rate under different concentrations of H2O23.2 筛选格列齐特(Gli)对 INS-1 细胞的安全作用浓度如图 2 所示,2 50 M 下不同浓度的格列齐特作用 INS-1细胞 24 h 后,测得细胞存活率的变化情况,各个浓度下细胞存活率相较对照组均表现出显著性差异(P0.05),同时在2 50 M浓度下,细胞存活率均保持在 90%以上,可以说 2 50 M 为作用的安全浓度,且在 10 M 浓度下,细胞存活率出现了上升,最终选择 10 M 浓度为后续实验中格列齐特的作用浓度。图 2 不同浓度 Gli 处理后的细胞存活率Fig.2 Survival rate of cells treated with differentconcentrations of Gli3.3 筛选化合物 Stn、Std 对 INS-1 细胞的低、中、高剂量106 广 州 化 工2023 年 2 月如图 3 所示,2 50 M 不同浓度的 Stn 作用于 INS-1 细胞24 h 后,测得细胞存活率的变化情况。在化合物 Stn 的不同浓度下,细胞存活率均出现不同程度的提高,且相较于对照组均有显著性差异(P0.05),其中在 2 30 M 浓度内,细胞的存活率出现剂量依赖性的提高,故最终选择 5 M 为作用细胞的低剂量,15 M 为作用细胞的中剂量,30 M 为作用细胞的高剂量。图 3 不同浓度的 Stn 对细胞存活率的影响Fig.3 Effects of different concentrations of Stn on cell survival rate如图 4 所示,2 50 M 不同浓度的 Std 作用于 INS-1 细胞24 h 后,测得细胞存活率的变化情况。在化合物 Std 的不同浓度下,细胞存活率均出现不同程度的提高,且相较于对照组均有显著性差异(P0.05),其中在 2 50 M 浓度内,细胞的存活率出现剂量依赖性的提高,故最终选择 5 M 为作用细胞的低剂量,20 M 为作用细胞的中剂量,50 M 为作用细胞的高剂量。图 4 不同浓度的 Std 对细胞存活率的影响Fig.4 Effects of Std concentrations on cell survival3.4 化合物 Stn、Std 对氧化损伤下 INS-1 细胞存活率的影响为了探究化合物 Stn、Std 在 INS-1 细胞生物数量上的作用效果和机制,首先研究了在 H2O2诱导氧化损伤下存活率的变化情况。如图 5 所示,在给予不同剂量的化合物处理 24 h 后,在化合物 Stn 低、中、高剂量下,细胞存活率均出现不同程度的提高,并呈现剂量依赖性,同时细胞存活率相较于阳性药Gli 的更高;在化合物 Std 低、中、高剂量下,细胞存活率出现不同程度的提高,呈现出剂量依赖性。图 5 不同浓度的 Stn 及 Std 对 H2O2处理下的细胞存活率的影响Fig.5 Effects of Stn and Std at different concentrations on cellsurvival under H2O2treatment3.5 化合物 Stn、Std 对氧化损伤下 INS-1 细胞的ROS 水平的影响ROS 的大量产生是引起细胞功能性损伤以致凋亡的重要因素。如图 6 所示,模型组 ROS 水平高于对照组水平,且具有显著性差异(P0.01),在给予不同剂量的化合物 Stn 处理 24 h后,ROS 水平降至与对照组相当,且具有显著性差异(P 0.01),说明化合物 Stn 有抗氧化的特性,同时也呈现出剂量依赖性;在给予不同剂量的化合物 Std 处理 24 h 后,ROS 水平也出现明显的降低,且呈剂量依赖性,具有显著性差异(P 0.05)。图 6 不同浓度的 Stn 及 Std 对 H2O2处理下 ROS 的影响Fig.6 Effects of Stn and Std at different concentrations on ROSunder H2O2treatment3.6 化合物 Stn、Std 对氧化损伤下 INS-1 细胞胰岛素分泌量的影响如图 7 和图 8 所示,300 M H2O2处理 4 h 后,在 3.3 mM葡萄糖刺激下,模型组的胰岛素分泌量相较于对照组,下降为对照组的 35.6%,具有显著性差异(P0.001),在 16.7 mM 葡萄糖刺激下,模型组的胰岛素分泌量相较于空白组,下降为空白组的 49.2%,具有显著性差异(P0.05),说明 H2O2氧化损伤 INS-1 细胞并影响了胰岛素的正常分泌。在模拟 BIS 实验中,图 7 可以看出在给予化合物后胰岛素的分泌量均有所提高,并呈剂量依赖性,其中在化合物 Stn 高剂量下,胰岛素的分泌量相当于阳性药水平,具有显著性差异(P0.05);在模拟第 51 卷第 3 期翟语桐,等:向天果中柠檬苦素类化合物对氧化损伤下 INS-1 细胞保护作用研究107 GSIS 实验中,图 8 可以看出在给予化合物后,胰岛素的分泌量均相较于模型组有所提高,其中在化合物 Stn 高剂量下胰岛素分泌量高于对照组,同时两个实验中均呈现出化合物 Stn 在促进胰岛素分泌的效果中整体优于化合物 Std 组。图 7 Stn 对氧化损伤下 INS-1 细胞胰岛素分泌量的影响,Fig.7 Effect of Stn on insulin secretion in INS-1 cellsafter oxidative injury图 8 Std 对氧化损伤下 INS-1 细胞胰岛素分泌量的影响Fig.8 Effect of Std on insulin secretion in INS-1 cellsafter oxidative injury4 结 论目前,研究胰岛功能损伤模型可供选择的细胞主要有小鼠胰岛 细胞瘤(MIN6)和大鼠胰岛 细胞瘤(INS-1)两种细胞株。MIN6 细胞是从胰岛素启动子控制下的表达 SV40 大 T 抗原的转基因小鼠肿瘤中建立的,其不仅能够分泌胰岛素,还能分泌胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和 ghrelin8。而 INS-1 细胞来源于辐射诱导的大鼠胰岛细胞瘤,通过在肿瘤细胞培养基中加入-巯基乙醇建立的,是保留了胰岛素分泌功能的胰岛 细胞,对葡萄糖刺激敏感,不生成胰高血糖素及生长抑素9。相同浓度的高血糖对INS-1 细胞株造成更大的细胞毒性,而25 M糖浓度对 MIN6 具有保护性10,相比之下 INS-1 细胞具有更低的生理阈值,易于培养,细胞稳定性高,结合文献报道,常作为模型细胞。H2O2是经典造成氧化损伤的试剂,通过诱导产生过量 ROS 导致胰岛成为氧化应激状态,由于胰岛 细胞内缺少抗氧化酶,从而会造成氧化损伤,进而会使得一些蛋白、核酸、磷脂异常引发细胞凋亡11。这与高血糖状态下造成损伤的机制相同,而且造模方便,所以选择 H2O2为造模试剂。实验对化合物 Stn 和 Std 如何保护氧化损伤下 INS-1 细胞作用进行了研究,发现 Stn 和 Std 可以提高氧化损伤下 INS-1 细胞存活率,降低 ROS 水平,促进胰岛素分泌,减轻凋亡,参考文献1 朱莉莉,王国凯,刘劲松,等.向天果脂肪酸成分的气相色谱-质谱分析J.安徽中医药大学学报,2014,33(3):85-86.2 Soheil Z M,Bey H G,Chim K C,et al.Biological activities andphytochemicals of Swietenia macrophylla KingJ.Molecules,2013,18(9):10465-10483.3 Kalpana K,Pugalendi K V.Antioxidative and hypolipidemic efficacy ofalcoholic seed extract of Swietenia macrophylla in streptozotocin diabeticratsJ.Basic Clin Physiol Pharmacol,2011,22:11-21.4 Mercolini L,Mandrioli R,Ferranti A,et al.Quantitative evaluation ofauraptene andumbelliferonechemopreventivecoumarins incitrusfruitsby HPLC-UV-FL-MSJ.Agric Food 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