实验四-耐性微生物对重金属的富集(原子吸收分光光度法).doc

(完整word)实验四 耐性微生物对重金属的富集(原子吸收分光光度法)
实验四 耐性微生物对重金属的富集(原子吸收分光光度法）
一、实验目的及要求
1、了解重金属在微生物细胞内的积累分布情况.
2、掌握微生物样品的消化方法.
3、掌握原子吸收分光光度计的使用方法.
二、实验原理
通过对大冶铜绿山古铜矿遗址、选矿车间和露采场等富铜土壤和水体进行采样，在实验室进行耐铜微生物筛选、纯化后,得到一株高耐铜细菌—恶臭假单胞菌（pseudomonas putida）.革兰氏阴性杆菌，有些菌株为卵圆形，单端丛毛菌，运动活泼.专性需氧,最适生长温度25℃~30℃，42℃不生长,4℃生长不定，菌落与铜绿假单胞菌相似，但只产生荧光素（青脓素)，不产生绿脓素，借此可与铜绿假单胞菌相区别，其陈旧培养物有腥臭味。在前期实验中发现,该细菌对重金属铜具有较高的富集能力。特别是在代谢活跃期，通过吸附和吸收等方式，从环境中蓄积大量的铜，从而降低周围环境中铜含量。因此，在工程治理中可以利用该菌株来降低土壤和水体中的重金属含量，达到治理重金属污染的目的。
原子吸收光谱法（atomic absorption spectrometry，AAS），又称原子吸收分光光度法（atomic absorption spectrophotometry，AAS）是基于蒸汽相中待测元素的基态原子对其共振辐射的吸收强度来测定试样中该元素含量的一种仪器分析方法。它是测定痕量和超痕量元素的有效方法。可进行低含量Cr、Ni、Cu、Mn、Mo、Ca、Mg、Al、Cd、Pb、Ad等金属元素的测定。具有灵敏度高、干扰较少、选择性好、操作简便、快速、结果准确、可靠、应用范围广、仪器比较简单、价格较低廉等优点，而且可以使整个操作自动化，因此近年来发展迅速，是应用广泛的一种仪器分析新技术。
三、实验材料与仪器
1、微生物材料
恶臭假单胞菌菌株为授课教师科研实验中筛选所得.
2、实验试剂
浓硝酸，2%稀硝酸.
铜标准储备液(1mg/mL），为国家计量研究员配制的国家标准物质。
硫酸铜储备液（2000 mg/L）:取CuSO4·5H2O 7.813g 溶于蒸馏水,定容至1L.
3、仪器与设备
三角瓶（150 mL）,容量瓶（50 mL ，100 mL）,微量移液器（0-10µL，10—50µL，50—200µL），移液管(5 mL,10 mL），滴管，烧杯（100 mL，250 mL），电炉，原子吸收分光光度计（VARIAN，AA240FS），铜空心阴极灯，通风橱。
四、实验步骤
1、预备实验
配制细菌培养基转入三角瓶，分别加入硫酸铜储备液2.5,7.5，12。5定容至50mL，铜终浓度为100，300，500 mg/L。培养液高温蒸汽灭菌,冷却后，接种恶臭假单胞菌种子液1mL于锥形瓶中，在震荡恒温摇床上180 rpm/min，培养20h，离心（4000 rpm/min，30 min），收集沉淀，用于后续的样品制备及铜含量测定。
2、标准曲线的绘制
用微量移液器准确吸取铜标准储备液0，0。01，0.025,0.05，0.1和0.2mL,分别以2％稀硝酸定容至100 mL,配制成浓度为0,0.1，0.25,0.5,1和2mg/L标准液，在铜元素的吸收波长324。7nm处测定吸光度，绘制标准曲线。
3、样品制备—-湿法消化
取上述菌体沉淀各1g，每样取3份，分别放入100 mL烧杯中，加浓硝酸2 mL，置通风橱内,于电炉上加热消化,待样液消化至完全碳化，稍等片刻，趁热加入少量浓硝酸，直至白烟冒完，加入2%稀硝酸，待溶液澄清定容至50 mL，324.7nm处测定吸光度。
五、数据处理
1、标准曲线的绘制
铜标准浓度（mg/L）
0
0。1
0.25
0.5
1
2
吸光度

2、样品铜含量测定
实验组数
1
2
3
铜处理浓度(mg/L)
100
300
500
100
300
500
100
300
500
吸光度

铜含量(mg/kg）

M：样品铜含量，mg/kg；
V:样品总体积，mL
W：样品重量，g。
六、思考题
1、配制铜标准曲线时，能否用蒸馏水代替2%稀硝酸进行稀释定容,为什么？
2、根据测定结果，分析铜在微生物细胞内的富集规律.
3、原子吸收分光光度计测定过程中,误差的来源可能有哪些？
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