下调lncRNA_MCF2...增殖、迁移、侵袭并促进凋亡_常帅.pdf

现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.2023doi:10.13241/ki.pmb.2023.02.009下调 lncRNA MCF2L-AS1 靶向 miR-33b-5p 抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭并促进凋亡*常帅1索丹2赵耀1李顺乐1徐心1吉鸿1（1 西安交通大学第二附属医院普通外科 陕西 西安 710004；2 西安交通大学第一附属医院普通外科 陕西 西安 710061）摘要 目的：探讨 lncRNA MCF2L-AS1 对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及分子机制。方法：选取 45 例胃癌患者的癌组织及癌旁正常组织，或培养胃黏膜上皮细胞 GES-1、胃癌细胞 HGC-27，采用 RT-qPCR 检测 MCF2L-AS1 和 miR-33b-5p 的表达水平。采用双荧光素酶报告实验检测 MCF2L-AS1 和 miR-33b-5p 的靶向关系。将 HGC-27 细胞分为 si-NC 组、si-MCF2L-AS1 组、mimic NC组、miR-33b-5p mimic 组、si-MCF2L-AS1+inhibitor NC 组、si-MCF2L-AS1+miR-33b-5p inhibitor 组，分 别 转 染 si-NC、si-MCF2L-AS1、mimic NC、miR-33b-5p mimic 或共转染 si-MCF2L-AS1+inhibitor NC、si-MCF2L-AS1+miR-33b-5p inhibitor。采用MTT 实验检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡率，克隆形成实验检测细胞克隆形成数，Transwell 实验检测迁移和侵袭细胞数。结果：与癌旁正常组织或 GES-1 细胞相比，胃癌组织或 HGC-27 细胞中 MCF2L-AS1 表达水平升高、miR-33b-5p 表达水平降低，差异均有统计学意义（P0.05）。MCF2L-AS1 可靶向调控 miR-33b-5p。下调 MCF2L-AS1 或过表达 miR-33b-5p，miR-33b-5p表达水平升高，HGC-27 细胞凋亡率升高，但细胞增殖、克隆形成数、迁移和侵袭数均减少，差异均有统计学意义（P0.05）。抑制miR-33b-5p 可减弱下调 MCF2L-AS1 对 HGC-27 细胞的生物学作用。结论：下调 MCF2L-AS1 通过上调 miR-33b-5p 抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭并促进凋亡；MCF2L-AS1 通过靶向调控 miR-33b-5p 表达进而参与胃癌细胞的恶性生物学行为。关键词：MCF2L-AS1；miR-33b-5p；胃癌；增殖；迁移；侵袭；凋亡中图分类号：R-33；R735.2文献标识码：A文章编号：1673-6273（2023）02-251-07Downregulation of lncRNA MCF2L-AS1 Targeting miR-33b-5p InhibitsGastric Cancer Cell Proliferation,Migration and Invasion,and Promotes Apoptosis*CHANG Shuai1,SUO Dan2,ZHAO Yao1,LI Shun-le1,XU Xin1,JI Hong1(1 General Surgery Department,the 2nd Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University,Xian,Shaanxi,710004,China;2 General Surgery Department,the 1st Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University,Xian,Shaanxi,710061,China)ABSTRACT Objective:To investigate the effect of lncRNA MCF2L-AS1 on the malignant biological behavior of gastric cancercells and its molecular mechanism.Methods:The expression levels of MCF2L-AS1 and miR-33b-5p in cancer tissues and paracanceroustissues of 45 patients with gastric cancer,or in cultured gastric mucosal epithelial cells GES-1 and gastric cancer cells HGC-27 weredetected by RT-qPCR.The targeting relationship between MCF2L-AS1 and miR-33b-5p was detected by dual luciferase reporter assay.HGC-27 cells were divided into si-NC group,si-MCF2L-AS1 group,mimic NC group,miR-33b-5p mimic group,si-MCF2L-AS1+in-hibitor NC group,si-MCF2L-AS1+miR-33b-5p inhibitor group,respectively transfected with si-NC,si-MCF2L-AS1,mimic NC,miR-33b-5p mimic or co-transfected with si-MCF2L-AS1+inhibitor NC,si-MCF2L-AS1+miR-33b-5p inhibitor.MTT assay was used todetect the cell proliferation,flow cytometry was used to detect the apoptosis rate,clone formation assay was used to detect the number ofcell clones,and Transwell assay was used to detect the number of migration and invasion cells.Results:The expression level ofMCF2L-AS1 was increased and the expression level of miR-33b-5p was decreased in gastric cancer tissues or HGC-27 cells comparedwith paracancerous tissues or GES-1 cells(P0.05).MCF2L-AS1 can target and regulate miR-33b-5p.Downregulation of MCF2L-AS1or overexpression of miR-33b-5p could increase the expression level of miR-33b-5p,increase the apoptosis rate but decrease the cell pro-liferation,clone formation number,migration and invasion number of HGC-27 cells,with statistical significance(P50 个细胞的集落。1.8 Transwell 检测迁移和侵袭细胞数迁移：在 Transwell 小室上室加 100 L 细胞悬液（密度1104个/mL），下室加 500 L 含血清培养液，37培养 24 h，取出培养板，0.5%结晶紫染色 15 min，PBS 漂洗 2 遍，棉签擦拭掉上层未穿过基底膜的细胞，光学显微镜（200）下随机选择5 个视野，计数。侵袭：用 Matrigel 包被 Transwell 上室 5 h，其余与迁移实验操作相同。1.9 双荧光素酶报告实验检测 MCF2L-AS1 和 miR-33b-5p 的靶向关系将 MCF2L-AS1 野生型（WT-MCF2L-AS1）和突变型荧光素酶载体（MUT-MCF2L-AS1）分别与 miR-NC 和 miR-33b-5p共转染至 HGC-27 细胞，48 h 后按照试剂盒说明检测荧光素酶活性。252现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.20231.10 统计学分析采用 SPSS 21.0 软件进行统计学分析，本研究相关数据均为计量资料，且符合正态分布，用均数 标准差（xs）表示，癌旁组织与胃癌组织基因表达情况采用配对 t 检验比较，余采用成组 t 或 t 检验。以 P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 胃癌组织中 MCF2L-AS1 和 miR-33b-5p 表达分析与癌旁正常组织相比，胃癌组织中 MCF2L-AS1 表达水平升高、miR-33b-5p 表达水平降低，差异有统计学意义（P0.05）。见图 1。图 1 胃癌组织中 MCF2L-AS1 和 miR-33b-5p 表达情况（n=45）Fig.1 MCF2L-AS1 and miR-33b-5p expression in gastric cancer tissuesA：胃癌组织中 MCF2L-AS1 高表达；B：胃癌组织中 miR-33b-5p 低表达A:High expression of MCF2L-AS1 in gastric cancer tissue;B:Low expression of miR-33b-5p in gastric cancer tissue注：与癌旁组织比，*P0.05。Note:Compared with paracancerous tissue,*P0.05.2.2 胃癌细胞中 MCF2L-AS1 和 miR-33b-5p 表达分析与 GES-1 细胞相比，胃癌细胞 HGC-27 中 MCF2L-AS1 表达水平升高、miR-33b-5p 表达水平降低，差异有统计学意义（P0.05）。见图 2。图 2 胃癌细胞中 MCF2L-AS1 和 miR-33b-5p 表达情况（n=9）Fig.2 MCF2L-AS1 and miR-33b-5p expression in gastric cancer cellsA：胃癌细胞中 MCF2L-AS1 高表达；B：胃癌细胞中 miR-33b-5p 低表达A:High expression of MCF2L-AS1 in gastric cancer cells;B:Low expression of miR-33b-5p in gastric cancer cells注：与 GES-1 组相比，*P0.05。Note:Compared with GES-1 cells,*P0.05.2.3 下调 MCF2L-AS1 对 HGC-27 细胞的影响与 si-NC 组相比，si-MCF2L-AS1 组 MCF2L-AS1 表达水平降低、miR-33b-5p 表达水平升高，HGC-27 细胞凋亡升高，而细胞增殖、克隆形成数、迁移和侵袭数均减少，差异有统计学意义（P0.05）。见图 3、表 1。2.4 MCF2L-AS1 靶向 miR-33b-5pStarbase 预测显示 MCF2L-AS1 和 miR-33b-5p 有互补序列，见图 4。253现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.2023图 4 MCF2L-AS1 和 miR-33b-5p 的互补序列Fig.4 Complementary sequences of MCF2L-AS1 and miR-33b-5p图 3 下调 MCF2L-AS1 促进 HGC-27 凋亡但抑制迁移和侵袭Fig.3 Downregulation of MCF2L-AS1 promotes HGC-27 apoptosis but inhibits migration and invasionA：凋亡；B：迁移；C：侵袭A:Apoptosis;B:Migration;C:InvasionNote:Compared with si-NC group,*P0.05.miR-33b-5p 与 WT-MCF2L-AS1 共转染后细胞荧光素酶活 性 降 低，差 异 有 统 计 学 意 义（P0.05），见表 2。表 1 下调 MCF2L-AS1 对 HGC-27 增殖、凋亡、克隆、迁移、侵袭的影响（n=9）Table 1 Effect of MCF2L-AS1 downregulation on proliferation,apoptosis,cloning,migration and invasion of HGC-27(n=9)GroupsMCF2L-AS1miR-33b-5pProliferationApoptosisCloningMigrationInvasionsi-NC1.000.070.980.071.130.077.500.95116.805.77174.899.38139.746.11si-MCF2L-AS10.260.03*3.030.25*0.490.08*23.301.33*54.342.27*76.464.06*62.393.54*t15.582-12.08518.541-28.90016.54516.96732.856P0.0010.0010.0010.0010.0010.0010.001Note:Compared with miR-NC group,*P0.05.表 2 双荧光素酶报告实验（n=9）Table 2 Double luciferase report experiment(n=9)GroupsWT-MCF2L-AS1MUT-MCF2L-AS1miR-NC1.000.121.030.11miR-33b-5p0.370.04*0.960.13t9.6891.114P0.0010.282254现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.20232.6 抑制 miR-33b-5p 对下调 MCF2L-AS1 处理的 HGC-27 的影响与 si-MCF2L-AS1+inhibitor NC 组相比，si-MCF2L-AS1+miR-33b-5p inhibitor 组 miR-33b-5p 表达水平降低，HGC-27 细胞凋亡率降低，而细胞增殖、克隆形成数、迁移和侵袭数均升高，差异有统计学意义（P0.05）。见图 6、表 4。2.5 miR-33b-5p 对 HGC-27 细胞的影响与 mimic NC 组相比，miR-33b-5p mimic 组 miR-33b-5p 表达水平升高，HGC-27 细胞凋亡升高，而细胞增殖、克隆形成数、迁移和侵袭数均减少，差异有统计学意义（P0.05）。见图 5、表3。图 5 miR-33b-5p 促进 HGC-27 凋亡但抑制迁移和侵袭Fig.5 miR-33b-5p promotes HGC-27 apoptosis but inhibits migration and invasionA：凋亡；B：迁移；C：侵袭A:Apoptosis;B:Migration;C:InvasionNote:Compared with mimic NC group,*P0.05.表 3 miR-33b-5p 对 HGC-27 增殖、凋亡、克隆、迁移、侵袭的影响（n=9）Table 3 Effect of miR-33b-5p on proliferation,apoptosis,cloning,migration and invasion of HGC-27(n=9)GroupsmiR-33b-5pProliferationApoptosisCloningMigrationInvasionmimic NC1.020.111.150.077.390.85113.016.58173.609.05145.007.20miR-33b-5p mimic2.380.15*0.630.09*19.061.34*63.894.15*89.734.73*79.194.15*t-22.45114.208-22.09718.94224.62923.764P0.0010.0010.0010.0010.0010.001图 6 抑制 miR-33b-5p 可减弱下调 MCF2L-AS1 对 HGC-27 凋亡的促进作用和对迁移和侵袭的抑制作用Fig.6 Inhibition of miR-33b-5p could attenuate the promotion of apoptosis and inhibition of migration and invasion of HGC-27 by downregulatingMCF2L-AS1A：凋亡；B：迁移；C：侵袭A:Apoptosis;B:Migration;C:Invasion255现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.20233 讨论靶向药物治疗是胃癌的治疗方法之一，可以提高治疗效果，是有希望的未来重要治疗方法。了解胃癌的分子机制，有助于发现新的靶向治疗的分子靶点，而且可用以发掘更多的分子靶向治疗联合化疗或免疫治疗胃癌的新方法，不仅有利于提高患者的生存率、延长生存期，还可以降低化疗的毒性副作用9,10。有研究报道，肾细胞癌组织中 miR-33b-5p 表达降低，过表达 miR-33b-5p 可抑制肾癌细胞增殖、迁移和侵袭；miR-33b-5p低表达与患者的不良预后有关，可以作为肾癌的肿瘤抑制调节因子并可作为肾癌患者预后的预测生物标志物11。骨肉瘤组织中，miR-33b-5p 呈低表达，上调 miR-33b-5p 的表达水平可以抑制肿瘤的发展，而 lncRNA HIF1A-AS2 可通过海绵 miR-33b-5p进而调节沉默调节蛋白 6（SIRT6）信号轴，从而促进骨肉瘤细胞 存 活、细 胞 周 期 进 展、凋 亡 以 及 迁 移、侵 袭，HIF1A-AS2/miR-33b-5p/SIRT6 信号轴可能是治疗骨肉瘤的新靶点12。miR-33b-5p 在肺腺癌细胞中呈低表达，上调miR-33b-5p 表达可抑制肺腺癌细胞增殖并加速细胞凋亡；lncRNA MSC-AS1 通过海绵 miR-33b-5p，可上调线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAM）的表达水平进而促进肺腺癌细胞增殖、抑制细胞凋亡，最终促进肺腺癌的发展13。miR-33b-5p 在前列腺肿瘤组织中也呈低表达，过表达 miR-33b-5p 可以抑制前列腺癌细胞的侵袭性和进展；Cullin 蛋白家族 4B（CUL4B）可通过表观遗传沉默 miR-33b-5p 的表达，进而上调癌基因c-Myc 水平从而促进前列腺癌细胞的增殖和侵袭14。另外，miR-33b-5p 在紫杉醇耐药的前列腺癌细胞系（PC3-TXR）中也呈低表达，过表达 miR-33b-5p 可以增强前列腺癌细胞对紫杉醇的敏感性；lncRNA-DANCR 通过海绵 miR-33b-5p 进而上调乳酸脱氢酶 A（LDHA）水平，从而促进糖酵解并导致前列腺癌进展，同时可增加前列腺癌细胞对紫杉醇的耐药性15。鼻咽癌细胞中 miR-33b-5p 也呈低表达，上调 miR-33b-5p 表达可以减低鼻咽癌细胞的增殖活性；脂筏特征蛋白 2（FLOT2）抑制miR-33b-5p 表达后可导致 c-Myc/胞浆支链氨基酸转氨酶 1（BCAT1）信号轴激活，进而促进鼻咽癌细胞增殖，FLOT2/miR-33b-5p/c-Myc/BCAT1 是鼻咽癌的潜在治疗靶点16。以上研究均表明，miR-33b-5p 是一种抑癌基因，并且参与了多种肿瘤的进展。另外，已有研究表明，miR-33b-5p 在胃癌细胞系中低表达，上调 miR-33b-5p 可抑制胃癌细胞的生长5，然而 miR-33b-5p对胃癌细胞凋亡和转移的影响尚不清楚。本实验结果显示，胃癌组织和 HGC-27 细胞中 miR-33b-5p 表达水平均降低；过表达 miR-33b-5p 后，HGC-27 细胞凋亡升高，细胞增殖、克隆形成数、迁移和侵袭数均减少，证实了 miR-33b-5p 在胃癌中发挥了抑癌基因的作用，与他人的研究结果相符，说明 miR-33b-5p 或可作为胃癌分子靶向治疗的靶点。lncRNA 可通过调控 miRNA 影响肿瘤进展。有研究报道，LncRNA MCF2L-AS1 在肺癌组织和细胞中高表达，可通过调节 miR-873-5p 水平进而促进非小细胞肺癌细胞出现癌症干细胞样特征；敲除 MCF2L-AS1 可抑制非小细胞肺癌细胞的癌症干细胞样特性17。在结直肠癌细胞中，MCF2L-AS1 呈高表达，可促进癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化（EMT）进程，抑制 MCF2L-AS1 表达可抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移并且降低侵袭相关蛋白如基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9的表达18。MCF2L-AS1 可通过内源性海绵 miR-874-3p 进而调控叉头盒转录因子 M1（FOXM1）信号轴，从而加剧结直肠癌的发生并促进癌细胞的增殖、侵袭和糖酵解进程18，或通过抑制miR-874-3p 表达导致细胞周期蛋白 E1（CCNE1）表达上调进而促进结直肠癌侵袭8。MCF2L-AS1 还可通过靶向调控miR-105-5p/Rab 相关蛋白 Rab-22A（RAB22A）信号轴加重直肠癌的恶性进展19；通过靶向调控 miR-105/IL-1 信号轴调节结直肠癌细胞对奥沙利铂的耐药性，敲低 MCF2L-AS1 表达可缓解结直肠癌细胞的化疗耐药性20。另外，MCF2L-AS1 也参与了肿瘤巨噬细胞的浸润过程，而该浸润情况与肿瘤进展及肿瘤突变负荷呈正相关，与免疫治疗的免疫检查点呈负相关，并且可用于预测接受抗程序性死亡受体-1（PD-1）或抗细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4（CTLA4）抗体治疗患者的免疫治疗反应性21。而抗 PD-1 抗体目前被应用于与抗 HER2 抗体及化疗药物联合治疗不可切除或转移的 HER2 阳性胃腺癌患者，其该方案的疗效已被认可22；抗 CTLA4 抗体则可提高应用抗 PD-1 抗体的胃癌患者的临床获益23。本实验结果显示，胃癌组织和HGC-27 细胞中 MCF2L-AS1 表达水平均升高，结合上述文献结论进一步提示，MCF2L-AS1 可能在胃癌的发生或发展中发挥了重要的促进作用。随后，为进一步研究 MCF2L-AS1 对胃癌细胞的影响及机制，本实验通过下调 MCF2L-AS1 表达并发现，与对照组相比，HGC-27 细胞的凋亡升高，但细胞增殖、克隆形成数、迁移和侵袭数均减少，证实 MCF2L-AS1 参与了胃癌的发展过程，进一步提示 MCF2L-AS1 可能作为胃癌靶向治疗Note:Compared with si-MCF2L-AS1+inhibitor NC group,*P0.05.表 4 抑制 miR-33b-5p 可减弱下调 MCF2L-AS1 对 HGC-27 增殖、凋亡、克隆、迁移、侵袭的影响（n=9）Table 4 Inhibition of miR-33b-5p could attenuate the effect of downregulating MCF2L-AS1 on proliferation,apoptosis,cloning,migration and invasionof HGC-27(n=9)GroupsmiR-33b-5pProliferationApoptosisCloningMigrationInvasionsi-MCF2L-AS1+in-hibitor NC3.100.180.490.0722.961.6555.942.7675.994.9963.643.88si-MCF2L-AS1+miR-33b-5p inhibitor1.380.15*0.930.08*12.731.10*101.644.49*149.435.93*117.076.37*t21.986-11.90515.489-25.998-28.432-21.472P0.0010.0010.0010.0010.0010.001256现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.2023的靶点或诊断、治疗的生物标志物。当前认为，癌症的发病机制与 lncRNA、miRNA、mRNA 之间的复杂调节作用有关7。研究表明，MCF2L-AS1 可通过调节miR-33a 表达控制骨髓间充质干细胞的成骨分化24，但MCF2L-AS1 与 miR-33b 在胃癌中的调节关系尚不清楚。因此，为研究 MCF2L-AS1 和 miR-33b-5p 的关系，本实验首先通过双荧光素酶报告基因实验证实了二者之间的靶向调控关系，随后通过 qRT-PCR 验证了抑制 MCF2L-AS1 表达对 miR-33b-5p 表达 的 上 调 作 用，最 后 通 过 设 置 Rescue 实 验 发 现 抑 制miR-33b-5p 可减弱下调 MCF2L-AS1 对 HGC-27 细胞恶性生物学行为的抑制作用。以上实验结果充分说明，lncRNAMCF2L-AS1 可通过靶向调控 miR-33b-5p 的表达水平进而影响胃癌的进展。综上所述，下调 MCF2L-AS1 可通过上调 miR-33b-5p 进而抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭并促进细胞凋亡，因此MCF2L-AS1 和 miR-33b-5p 均可能成为胃癌分子靶向治疗的新靶点。另外，Yang 等5研究发现 miR-33b-5p 可通过调控高迁移率族蛋白 A2（HMGA2）表达进而参与胃癌的进展，Ni 等25研究发现 miR-33b-5p 可通过调控肉碱氧位甲基转移酶（CROT）信号轴参与大肠癌的进展，而 MCF2L-AS1 靶向 miR-33b-5p 是否也是通过 HMGA2 或 CROT 信号轴进而发挥了对胃癌细胞恶性生物学行为的调控作用则有待进一步研究。参 考 文 献（References）1Chen Z,Li Y,Tan B,et al.Progress and current status ofmolecule-targeted therapy and drug resistance in gastric cancer J.Drugs Today(Barc),2020,56(7):469-4822 Pellino A,Riello E,Nappo F,et al.Targeted therapies in metastaticgastric cancer:Current knowledge and future perspectivesJ.World JGastroenterol,2019,25(38):5773-57883 Ghafouri-Fard S,Vafaee R,Shoorei H,et al.MicroRNAs in gastriccancer:Biomarkers and therapeutic targets J.Gene,2020,757:1449374Azarbarzin S,Safaralizadeh R,Khojasteh MB,et al.Currentperspectives on the dysregulated microRNAs in gastric cancerJ.MolBiol Rep,2020,47(9):7253-72645 Yang X,Zhao Q,Yin H,et al.MiR-33b-5p sensitizes gastric cancercells to chemotherapy drugs via inhibiting 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