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第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023朊蛋白体外扩增技术对不同种属朊病毒检测敏感性分析刘楚眸#，杨微#，肖康，武月章，陈冬冬，董小平，石琦*（中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206）摘要：朊蛋白体外扩增技术包括实时震动诱导蛋白扩增（Real-time quaking-induced conversion，RT-QuIC）技术及蛋白错误折叠循环扩增（Protein misfolding cyclic amplification，PMCA）技术。为了分析朊蛋白体外扩增技术与传统的蛋白免疫印迹技术对于朊病毒毒株检测敏感性的差异，应用此三种方法对朊病毒小鼠适应株 139A、ME7和 S15以及仓鼠适应株 263K 毒株进行了检测及对比分析。结果显示，应用 RT-QuIC 方法以及三轮 PMCA 扩增方法，均可检测到 10-9稀释度 139A 小鼠脑匀浆中的朊病毒，比 Western blot方法敏感度提高了 106倍；应用 RT-QuIC 方法以及三轮 PMCA 扩增方法，分别可检测到 10-7稀释度及 10-8稀释度 ME7小鼠脑匀浆中的朊病毒，分别比 Western blot方法敏感度提高了 104倍及 105倍；应用 RT-QuIC方法以及三轮 PMCA 扩增方法，分别可检测到 10-8稀释度及 10-9稀释度 S15小鼠脑匀浆中的朊病毒，分别比 Western blot方法敏感度提高了 105倍及 106倍；应用 RT-QuIC 方法可检测到 10-9稀释度 263K 仓鼠脑匀浆中的朊病毒，比 Western Blot方法敏感度提高了 106倍，但三轮 PMCA 扩增方法可检测到 10-3稀释度的 263K 小鼠脑匀浆中的朊病毒，与 Western Blot方法比较敏感度没有明显提高。本实验为优化朊蛋白体外扩增技术的检测条件、检测敏感性及该技术的临床应用提供了实验数据参考。关键词：朊病毒；实时震动诱导蛋白扩增；蛋白错误折叠循环扩增；蛋白免疫印迹中图分类号：R373.9 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02037212DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004273朊病毒病是一种可侵袭人类及多种动物的致死性神经退行性疾病。该疾病潜伏期较长，致死率为100%，目前并没有有效的治疗方法。人类的朊病毒病包括克-雅病（Creutzfeldt-Jakob disease，CJD）、致死性家族型失眠症（Fatal familial insomnia，FFI）、库鲁 病（Kuru）、吉 斯 特 曼-施 特 劳 斯 综 合 征（Gerstmann-Strussler-Scheinker，GSS）等。其中以克-雅病为主，目前根据其发病机理的不同，可将CJD 分为散发型 CJD（sporadic CJD，sCJD）、家族遗传型 CJD（genetic CJD，gCJD/fCJD）及医源型 CJD（iatrogenic CJD，iCJD）。动物朊病毒病包括羊瘙痒症（Scrapie）、疯牛病（Bovine spongiform encephalopathies，BSE）、骡鹿和麋鹿的慢性消耗性疾病（Chronic wasting disease，CWD）、可传播性貂脑病（Transmissible mink encephalopathy，TME）、猫的 海 绵 状 脑 病（Feline spongiform encephalopathy，FSE）等1。在朊病毒基础研究以及临床诊断领域，通常是运用免疫印迹以及免疫组织化学方法进行朊病毒检测，但是这些方法敏感性较低，所以我们要探索检测朊病毒更加敏感的方法 2-4。体外朊病毒扩增检测方法的出现，包括蛋白错误折叠循环扩增（PMCA）和实时震动诱导蛋白扩增（RT-QuIC），为朊病毒的检测提供了更加快速、高灵敏度和高通量的方法。PMCA 技 术 是 2001 年 Saborio 等 人 建 立 的5，PMCA 基于一系列的周期性超声静置孵育，目的是将聚集的 PrPSc分解成更小的片段，从而诱导进一步的形成聚集的 PrPSc。当组织中存在 PrPSc，它将作为一个“种子”，诱导脑匀浆或细胞提取物底物中包含的 PrPC转化成 PrPSc。之后通过系列技术的改进，不断提高了 PMCA 技术的灵敏度6。2008 年日本科学 家 Ryuichiro Atarashi 建 立 了 RT-QuIC 方 法7，RT-QuIC 采用正常重组朊蛋白（rPrPC）为底物进行间歇性震动和孵育，以启动 PrPC向淀粉样纤维蛋白PrPSc的转换，通过硫黄素 T（ThT）与纤维样蛋白的结合可实时检测聚集物出现的丰度8，目前该方法已用于临床检测朊病毒以及相关疾病中错误折叠蛋收稿日期：20220920；接受日期：20221111基金项目：国家重点研发计划（项目号：2020YFE0205700），题目：中国塞拉利昂“一带一路”联合实验室建设与重要传染病病原学研究；传染病预防控制国家重点实验室课题（项目号：2021SKLID101，2019SKLID501）#共同第一作者：刘楚眸和杨微作者简介：刘楚眸（1999），女，从事朊病毒病发病机制的研究，Email：；杨微（1996），女，从事朊病毒病发病机制的研究，Email：通讯作者：石琦（1976），女，研究员，从事朊病毒发病机制的研究，Email：开放科学（OSID）2期刘楚眸，等.朊蛋白体外扩增技术对不同种属朊病毒检测敏感性分析白的检测。PMCA 和 RT-QuIC 方法都能够在朊病毒病的早期无症状阶段检测到朊病毒。本研究应用PMCA 和 RT-QuIC方法，以及经典的免疫印迹方法对朊病毒小鼠适应株 139A、ME7和 S15以及仓鼠适应株 263K毒株进行检测并分析其检测能力的差异。材料与方法1 抗体及生化试剂本实验 Western blot所用检测小鼠朊蛋白的抗体为鼠源单克隆抗体 8H4（abcam），检测仓鼠及人朊 蛋 白 的 抗 体 为 鼠 源 单 克 隆 抗 体 3F4（Merck Millipore），二 抗 为 HRP 标 记 的 抗 鼠 IgG 抗 体（Jackson）；PMCA 所用裂解脑组织的转化液为 PBS（Phosphate Buffered Solution）400 mL，NaCl 4.3875 g，EDTA Na2 0.9305 g，TritonX-100 5 mL。用时取80 mL，加入 0.5 mL lock tail（Merck），PBS 定容至100 mL，调 PH 值至 7.0-7.3；RT-QuIC 所用化学试剂 为 NaCl，EDTA（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid），ThT，PBS，N2，SDS（Sodium dodecyl sulfate）。2 实验样本脑组织以及阴性对照脑组织本实验检测所用的样本包括本实验室保存的小鼠朊病毒毒株 139A、ME7 及朊病毒细胞系 SMB-S15感染的 C57-BL/6小鼠终末期脑组织，以及仓鼠朊病毒毒株 263K 感染叙利亚金黄地鼠终末期脑组织。阴性对照所用样本为同年龄的 C57-BL/6 小鼠和叙利亚金黄地鼠。3 脑组织匀浆制备脑组织匀浆制备时，分别称取脑组织约 0.1g，按照 1 10（m/v）加入脑组织匀浆裂解液，同时加入0.5%蛋白酶抑制剂。匀浆后 2 000g 离心 10min，吸取上清备用。4 蛋白免疫印迹分 别 将 脑 组 织 匀 浆 进 行 102g/10mL，103g/10mL，104g/10mL，105g/10mL 倍梯度稀释，对每个稀释度的样品进行检测。PK 酶处理小鼠及仓鼠的脑 组 织 匀 浆 的 浓 度 为 50 g/mL，消 化 时 间 为60min。检测时使用 12%分离胶，板厚为 1.5mm 的15 孔 SDS-PAGE 凝胶。上样后以 80V 恒压电泳直到 Marker 进入分离胶出现条带分离后调节电压至120V，直到溴酚蓝指示条带移出凝胶则结束电泳。转膜使用半干法，150mA 稳流转膜约 75min。转膜成功后以 5%脱脂奶封闭 1 h，一抗孵育，4过夜后，二抗室温孵育 2 h。所 用 抗 体 稀 释 比 例如下：8H4（1 2 000 稀释）、3F4（1 5 000 稀释）；二抗为 HRP 标记的抗鼠 IgG抗体（1 4 000 稀释）。5 实时震动诱导蛋白扩增RT-QuIC 脑 匀 浆 反 应 体 系 组 成：170mM NaCl，10g rHaPrP，100mM EDTA，1mM ThT，PBS 终浓度为 1x。反应是黑色 96 孔光学底板中进行，每孔加入体积为 98 L 的脑匀浆反应体系和2L 待测的脑匀浆样品，最终反应体积为 100 L。配制样品稀释液（1x N2/0.1%SDS/1x PBS）将所测样本进行 103g/10mL，104g/10mL，105g/10mL，106g/10mL，107g/10mL，108g/10mL，109g/10mL 梯 度 稀释，所得稀释样本脑匀浆样本和相应阴性对照（样品稀释液，C57-BL/6 小鼠脑匀浆，叙利亚金黄地鼠脑匀浆）进行四个复孔的测试。用塑料薄膜密封 96孔光学底板放入 RT-QuIC 仪器，设置反应温度为55，转速为 700 r/min，每震动 60 s 间歇 60 s，总运行时间 60 h；吸收光 480 nm，发射光 450 nm；每 45 min读取一次荧光值。当某一个复孔荧光值大于阴性对照组荧光值的均值加上十倍标准差时，结果可视作阳性。当一个样本实验组 4个复孔中同时出现2个及 2个以上的阳性反应时，该样本可视为阳性。6 蛋白错误折叠循环扩增用 正 常 脑 匀 浆 进 行 102g/10mL、103g/10mL、104g/10mL、105g/10mL、106g/10mL、107g/10mL、108g/10mL、109g/10mL稀释。将稀释后的样品置于PMCA 超声仪（SONICATORS-4000）中，具体参数设置为：小鼠朊病毒毒株：超声 20s，孵育 29min40 s，总超声时间 27 min，振幅 80，功率 250W，温度 37；仓鼠朊病毒毒株：超声 20 s，孵育 29 min 40 s，总超声 时 间 27 min，振 幅 100，功 率 300W，温 度 42。PMCA产物经 Western Blot实验进行验证。结果1 小鼠朊病毒毒株检测分析1.1 应用 Western Blot、PMCA 以及 RT-QuIC 方法对小鼠朊病毒毒株 139A的检测分析1.1.1 应用 Western Blot 方法对小鼠朊病毒毒株139A的检测分析将上述方法中制备的小鼠朊病毒毒株 139A 脑组织匀浆作为初始浓度 10-1g/10mL，使用 Western Blot分别分析了 139A 小鼠脑组织匀浆 10-1g/10mL、10-2g/10mL、10-3g/10mL、10-4g/10mL、10-5g/10mL 373病 毒 学 报39卷浓度经 50 g/mL 蛋白酶 K（PK）处理前后的检测结果。在长时间曝光的情况下，能检测到 PrPSc条带的最小浓度为 10-3g/10mL（图 1A）。1.1.2 应用 PMCA 方法对小鼠朊病毒毒株 139A 的检测分析为了观察 PMCA 方法对小鼠 139A 朊病毒毒株的扩增效率，将上述方法中制备的小鼠朊病毒毒株139A 脑组织匀浆作为种子，正常的 C57小鼠作为底物，将种子稀释为 10-2g/10mL 至 10-9g/10mL 浓度进行 PMCA 实验，连续扩增三轮。每轮实验结束后，取出反应产物经 50g/mL蛋白酶 K消化后进行 PrP特异性 Western Blot检测。结果显示，C57-BL/6 小鼠脑匀浆未经 PK 酶消化时，可检测到总 PrP 蛋白，经 PK 酶消化后，正常的 PrPC蛋白全部被消化掉，结果显示无特异性条带。随着 PMCA 扩增次数的增加，PMCA 扩增效率逐渐增加，PMCA 第一轮时，能检 测 到 PrPSc条 带 的 最 小 浓 度 为 10-5g/10mL，而PMCA 第二轮和第三轮时，能检测到 PrPSc条带的最小浓度为 10-9g/10mL（图 1B）。1.1.3 应用 RT-QuIC方法对小鼠朊病毒毒株 139A的检测分析为 了 观 察 RT-QuIC 方 法 对 小 鼠 朊 病 毒 毒 株139A 的扩增效率，将上述方法中制备的 139A 脑组织匀浆作为种子，rHaPrP90-231 作为底物，用脑匀浆稀释液将种子稀释为 10-3g/10mL 至 10-9g/10mL浓度进行 RT-QuIC实验。将 C57-BL/6小鼠脑匀浆和脑匀浆稀释液分别作为阴性对照和空白对照。结果显示，RT-QuIC 方法能检测到 139A 小鼠脑组织匀浆的最小浓度为 10-9g/10mL，其中阴性对照和空白对照均为阴性结果。每个点代表四个重复荧光孔荧光强度读数的平均值（图 1C）。1.2 应用 Western Blot、PMCA 以及 RT-QuIC 方法对小鼠朊病毒毒株 ME7的检测分析1.2.1 应用 Western Blot 方法对小鼠朊病毒毒株ME7的检测分析将上述方法中制备的小鼠朊病毒毒株 ME7 脑组织匀浆作为初始浓度 10-1g/10mL，使用 Western blot 分 析 了 ME7 小 鼠 脑 匀 浆 10-1g/10mL、10-2g/10mL、10-3g/10mL、10-4g/10mL、10-5g/10mL 浓度经50g/mL 蛋白酶 K（PK）处理前后的检测结果。在长时间曝光的情况下能检测到 PrPSc条带的最小浓度为 10-3g/10mL（图 2A）。1.2.2 应用 PMCA 方法对小鼠朊病毒毒株 ME7 的检测分析为了观察 PMCA 方法对小鼠朊病毒毒株 ME7的扩增效率，将上述方法中制备的 ME7脑组织匀浆作为种子，正常的 C57小鼠作为底物，将种子稀释为10-2g/10mL 至 10-9g/10mL 浓度进行 PMCA 实验，连续扩增三轮。每轮扩增实验结束后，取出反应产物经 50 g/mL 蛋 白 酶 K 消 化 后 进 行 PrP 特 异 性Western Blot 检测。结果显示，随着 PMCA 扩增次数的增加，PMCA 扩增效率逐渐增加，PMCA 第一轮时，能检测 PrPSc条带的最小种子浓度为 10-4g/10mL；PMCA 第二轮时，能检测出 PrPSc条带的最小种子浓度为 10-6g/10mL；PMCA 第三轮时，能检测出 PrPSc条 带 的 最 小 种 子 浓 度 为 10-8g/10mL（图 2B）。1.2.3 应用 RT-QuIC 方法对小鼠朊病毒毒株 ME7的检测分析为 了 观 察 RT-QuIC 方 法 对 小 鼠 朊 病 毒 毒 株ME7 的扩增效率，将上述方法中制备的 ME7 小鼠脑组织匀浆作为种子，rHaPrP90-231 作为底物，用脑匀浆稀释液将种子稀释为 10-3g/10mL 至 10-9g/10mL 浓度进行 RT-QuIC 实验。将 C57-BL/6 小鼠脑匀浆和脑匀浆稀释液分别作为阴性对照和空白对照。结果显示，RT-QuIC 方法能检测到 ME7 小鼠脑组织匀浆的最小浓度为 10-7g/10mL，其中阴性对照和空白对照均为阴性结果。每个点代表四个重复荧光孔荧光强度读数的平均值（图 2C）。1.3 应用 Western Blot、PMCA 以及 RT-QuIC 方法对小鼠朊病毒毒株 S15的检测分析1.3.1 应用 Western Blot 方法对小鼠朊病毒毒株S15的检测分析将上述方法中制备小鼠朊病毒毒株 S15小鼠脑组织匀浆作为初始浓度 10-1g/10mL，使用 Western blot 分 析 了 S15 小 鼠 脑 匀 浆 10-1g/10mL、10-2g/10mL、10-3g/10mL、10-4g/10mL、10-5g/10mL 浓度经50g/mL 蛋白酶 K 处理前后的检测结果。在长时间曝光的情况下能检测到 PrPSc条带的最小浓度为10-3g/10mL（图 3A）。1.3.2 应用 PMCA 方法对小鼠朊病毒毒株 S15 的检测分析为了观察 PMCA 方法对小鼠朊病毒毒株 S15的扩增效率，将上述方法中制备的 S15 感染小鼠脑组织匀浆作为种子，正常的 C57小鼠作为底物，将种子 稀 释 为 10-2g/10mL 至 10-9g/10mL 浓 度 进 行 3742期刘楚眸，等.朊蛋白体外扩增技术对不同种属朊病毒检测敏感性分析图 1不同方法对小鼠朊病毒毒株 139A感染小鼠脑匀浆的检测 A 免疫印迹方法 B PMCA方法 C RT-QuIC方法Figure 1Detection of mouse brain homogenates infected with mouse prion strain 139A by different methodsNotes：A.Western Blotting；B.PMCA；C.RTQuIC 375病 毒 学 报39卷图 2不同方法对小鼠朊病毒毒株 ME7感染小鼠脑匀浆的检测 A 免疫印迹方法 B PMCA方法 C RT-QuIC方法Figure 2Detection of mouse brain homogenates infected with mouse prion strain ME7 by different methodsNotes：A.Western Blotting；B.PMCA；C.RTQuIC 3762期刘楚眸，等.朊蛋白体外扩增技术对不同种属朊病毒检测敏感性分析PMCA 实验，连续扩增三轮。每轮扩增实验结束后，取出反应产物经 50g/mL 蛋白酶 K 消化后进行PrP 特 异 性 Western blot 检 测。结 果 显 示，随 着PMCA 扩增次数的增加，PMCA 扩增效率逐渐增加，PMCA 第一轮时，能检测出 PrPSc条带的最小浓度为 10-5g/10mL；PMCA 第二轮时，能检测出 PrPSc条带的最小浓度为 10-8g/10mL；PMCA 第三轮时，能 检 测 出 PrPSc条 带 的 最 小 浓 度 为 10-9g/10mL（图 3B）。1.3.3 应用 RT-QuIC 方法对小鼠朊病毒毒株 S15的检测分析为了观察 RT-QuIC 方法对小鼠 S15 朊病毒毒株的扩增效率，将上述方法中制备的 S15 小鼠脑组织匀浆作为种子，rHaPrP90-231 作为底物，用脑匀浆稀释液将种子稀释为 10-3g/10mL 至 10-9g/10mL浓度进行 RT-QuIC实验。将 C57-BL/6小鼠脑匀浆和脑匀浆稀释液分别作为阴性对照和空白对照。结果显示，RT-QuIC 方法能检测到 S15 小鼠脑组织匀浆的最小浓度为 10-8g/10mL，其中阴性对照和空白对照均为阴性结果。每个点代表四个重复荧光孔荧光强度读数的平均值（图 3C）。2 应用 Western Blot、PMCA 以及 RT-QuIC 方法对仓鼠朊病毒毒株 263K的检测分析2.1 应 用 Western Blot 方 法 对 仓 鼠 朊 病 毒 毒 株263K的检测分析将上述方法中制备的仓鼠朊病毒毒株 263K 脑匀浆作为初始浓度 10-1g/10mL，使用 Western blot分析 了 263K 仓 鼠 脑 匀 浆 10-1g/10mL、10-2g/10mL、10-3g/10mL、10-4g/10mL、10-5g/10mL 浓 度 经 50g/mL 蛋白酶 K（PK）处理前后的检测结果。在长时间曝光的情况下能检测到 PrPSc条带的最小浓度为10-3g/10mL（图 4A）。2.2 应用 PMCA 方法对仓鼠朊病毒毒株 263K 的检测分析为了观察 PMCA 方法对仓鼠朊病毒毒株 263K的扩增效率，将制备的 263K感染仓鼠脑组织匀浆作为种子，正常的仓鼠脑匀浆作为底物，将种子稀释为10-2g/10mL 至 10-9g/10mL 浓度进行 PMCA 实验，连续扩增三轮。每轮扩增实验结束后，取出反应产物经 50g/mL 蛋 白 酶 K 消 化 后 进 行 PrP 特 异 性Western blot检测。结果显示，PMCA 第一轮时，能检测出 PrPSc条带的最小浓度为 10-3g/10mL，PMCA第二轮和第三轮时，均能检测出 PrPSc条带的最小浓度为 10-3g/10mL。尽管朊病毒的扩增效率没有明显的梯度变化，但随着 PMCA 扩增次数增加，PrPSc条带含量有明显的增加（图 4B）。2.3 应用 RT-QuIC 方法对仓鼠朊病毒毒株 263K的检测分析为 了 观 察 RT-QuIC 方 法 对 仓 鼠 朊 病 毒 毒 株263K 的扩增效率，将上述方法中制备的 263K 仓鼠脑组织匀浆作为种子，rHaPrP90-231 作为底物，用脑匀浆稀释液将种子稀释为 10-3g/10mL 至 10-9g/10mL浓度进行 RT-QuIC实验。将正常仓鼠脑匀浆和脑匀浆稀释液分别作为阴性对照和空白对照。结果显示，RT-QuIC 方法能检测到 263K 仓鼠脑组织匀浆的最小浓度为 10-9g/10mL，其中阴性对照和空白对照均为阴性结果。每个点代表四个重复荧光孔荧光强度读数的平均值（图 4C）。讨 论针对朊病毒的实验室检测，动物传递实验是该领域早期判断是否感染朊病毒的方法，另外还有免疫组织化学，组织印迹法，斑点印迹法，免疫印迹法以及酶联免疫吸附实验等等多种免疫学实验都可用于朊病毒的检测9。在传统的检测方法中，最常用的就是免疫组化和免疫印迹两种方法。免疫组化是一种非常成熟的方法，优点众多，已成为确诊 TSE病的“金标准”之一。但由于组织样本获取及处理较难，使得该方法也存在一定局限性。免疫印迹法是目前 OIE 公认的用于确诊疯牛病的方法之一3。该方法是利用凝胶电泳分离技术和免疫检测技术，不仅可以检测标本中特定的组分，还能显示其电泳分离图谱，敏感性高、特异性强。但由于该法样本用量较大，实验时间长，所以不适合常规的朊病毒检测，更不适合大批量样本的筛查。随着技术的进步，朊蛋白体外扩增技术包括蛋白错误折叠循环扩增（PMCA）和实时震动诱导转化（RT-QuIC）技术的诞生，将朊病毒的检测诊断和研 究 带 入 到 一 个 新 的 领 域10。目 前 RT-QuIC 和PMCA 方法在朊病毒生物学和诊断中在如下领域有应用，如人类（和动物）临床诊断；监测及治疗效果；朊病毒菌株的区分；PMCA 技术在科研领域的广泛应用 8。蛋白错误折叠循环扩增（PMCA）利用朊病毒的最核心的复制机制，将 PrPC转化为更多的 PrPSc。检测样本与含有 PrPC的正常脑组织匀浆或者细胞匀浆混合，放置在超声静置孵育循环中。检测样本 377病 毒 学 报39卷图 3不同方法对小鼠朊病毒毒株 S15感染小鼠脑匀浆的检测 A 免疫印迹方法 B PMCA方法 C RT-QuIC方法Figure 3Detection of mouse brain homogenates infected with mouse prion strain S15 by different methodsNotes：A.Western blotting；B.PMCA；C.RTQuIC 3782期刘楚眸，等.朊蛋白体外扩增技术对不同种属朊病毒检测敏感性分析图 4不同方法对仓鼠朊病毒毒株 263K感染小鼠脑匀浆的检测 A 免疫印迹方法 B PMCA方法 C RT-QuIC方法Figure 4Detection of hamster brain homogenates infected with mouse prion strain 263K by different methodsNotes：A.Western blotting；B.PMCA；C.RTQuIC 379病 毒 学 报39卷中的 PrPSc诱导 PrPC蛋白发生构象改变，当生成的PrPSc足够多时，可以被免疫印迹方法检测出来。PMCA 相比传统方法，提高了检测 PrPSc的敏感度。但 PMCA 也 有 缺 点，比 如 无 法 从 脑 脊 液 中 检 测PrPSc，需要脑匀浆或细胞匀浆来提供反应所需的底物 PrPC，检测通量低，一次检测的耗时长，产物具有生物安全危害等11。受到 PMCA 的启发，日本科学家发明了实时震动诱导蛋白扩增（RT-QuIC）技术。同样利用 PrPSc能够诱导 PrPC转化这个特性，但将超声替换为了震荡，并 加 入 能 够 与 淀 粉 样 纤 维 结 合 的 硫 黄 素 T（ThT），因此机器可以实时监测产生的纤维量。目前，应用 RT-QuIC 方法可以从患病脑组织中检测出微量的 PrPSc，同时也能从脑脊液中检测出微量的PrPSc。获取脑脊液相比较于脑组织更容易让患者接受，并且创伤也更小。RT-QuIC 方法除了可以在脑组织和脑脊液中检测到朊病毒12、尿液、粪便、13唾液14、血 15、淋巴结16，皮肤中也可以检测出朊病毒。该方法检测时还具备样品量少，底物为重组蛋白，敏 感 性 高，产 物 不 具 有 感 染 性 等 优 点。RT-QuIC技术利用荧光检测的高通量的多孔板的技术，可一次处理大量样品，比多次 PMCA 和传统的生物测定法效率更高，并且可以实时监测实验的结果，因此更加适合推广至临床标本的检测。已知朊病毒的感染性是由不同的蛋白酶敏感/抗性亚型17，18组成，RT-QuIC 避免了蛋白酶 K 的使用，从而可以提高对不同蛋白酶敏感亚型的检测。国际上不同实验室使用的 RT-QuIC 方法在底物、震荡时间、温度等条件都是不尽相同，且 PMCA方法也难以制定标准化程序，实验室之间即使采用相同的方案，实验结果依旧缺乏一致性。在本研究中，我们分别使用来自小鼠的三种朊病毒毒株以及一 种 来 自 仓 鼠 的 朊 病 毒 毒 株 对 本 室 建 立 的 RT-QuIC 和 PMCA 方法检测敏感性进行了分析。我们建立的 RT-QuIC 和 PMCA 方法在对不同种属的脑组织朊病毒的检测中，都显示了高于 WB的敏感性。但在本研究中，针对仓鼠朊病毒毒株 263K 检测时，发现未 PMCA 扩增的 Western Blot 检测 PrPSc条带检测到 10-3g/10mL稀释度，经三轮 PMCA 扩增后检测 PrPSc条带检测到 10-3g/10mL 稀释度。不同的朊病毒毒株因蛋白空间构象的不同，在进行 PMCA 扩增的实验时会出现不同的扩增效率，这在国际上其它研究团队的实验中也有类似的现象，但我们在接下来的研究中会继续优化条件如功率、温度和扩增时间等来进一步提高扩增效率。其它研究小组对患慢性消耗性疾病的鹿的脑组织匀浆（CBP6）进行免疫印迹方法、酶联免疫分析、免疫组化方法和蛋白质扩增方法检测的比较，得出PMCA 扩增方法检测 PrPSc敏感度比蛋白免疫印迹技术检测方法提高了 105倍，RT-QuIC 扩增方法检测 PrPSc敏感度比蛋白免疫印迹技术检测方法提高了 106倍10。与文献的结果相似，本研究结果中 RT-QuIC和 PMCA 扩增方法检测 PrPSc敏感度与免疫印迹技术技术相比都大大提高了。免疫组化法，蛋白印迹法和生物测定法已被认为是检测 PrPSc的金标准20，体外扩增技术的使用有助于我们理解朊病毒的发病机制和传播动力学21-23，虽然还需要更多的检测，但是有关文献认为 RT-QuIC 和 PMCA 可能有助于评估朊病毒的传染性23-25，而不是生物测定25-28，与以前对仓鼠和一些小鼠朊病毒毒株的观察相比，它们的复制速率主要不是由构象稳定性决定的，而是由控制朊病毒聚集体生长速率的特定结构特征决定的29，30。根据 PMCA 和 RT-QuIC 对不同毒株的扩增效率，这些模型动物中的控制朊病毒聚集体生长速率的特定结构特征可能存在差异。（致谢：中国疾病预防控制中心病毒病所朊病毒病室所有师生）参考文献：1 Sejvar JJ，Schonberger LB，Belay ED.Transmissible spongiform encephalopathiesJ/OL.J Am Vet Med Assoc，2008；233（11）：1705-1712.DOI：10.2460/javma.233.11.1705.2 Christina D Orr，Jason M Wilham，Lynne D Raymond，Franziska Kuhn，Bjrn Schroeder，Alex J Raeber，Byron Caughey.Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversionJ/OL.mBio，2011；2（3）：e00078-e11.Published 2011 May 10.DOI：10.1128/mBio.00078-11.3 Alan M Elder，Davin M Henderson，Amy V Nalls，Jason M Wilham，Byron W Caughey，Edward A Hoover，Anthony E Kincaid，Jason C Bartz，Candace K Mathiason.In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters J/OL.PLoS One，2013；8（11）：e80203.DOI：10.1371/journal.pone.0080203.4 Cheng YC，Hannaoui S，John TR，Dudas S，Czub S，Gilch S.Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material J/OL.J Vis Exp，2017；（127）：56373.Published 2017 Sep 29.DOI：10.3791/56373.3802期刘楚眸，等.朊蛋白体外扩增技术对不同种属朊病毒检测敏感性分析5 Saborio GP，Permanne B，Soto C.Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic 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