水环境中3种典型污染物对海洋发光菌的联合毒性作用分析_张建江.pdf

职业与健康2023 年 2 月第 39 卷第 3 期Occup and Health，Feb.2023，Vol.39，No.3基金项目：宁德师范学院 2019 年第二批引进人才科研启动项目（2019Y19）；2019 年宁德市指导性科技计划项目（20190015）作者简介：张建江，男，副教授，主要从事劳动卫生与环境卫生学研究工作。通信作者：陈思萍，教授，E-mail：水环境中 3 种典型污染物对海洋发光菌的联合毒性作用分析张建江1，刘建铃1，陈思萍21.宁德师范学院医学院，福建 宁德 352100；2.韶关学院医学院，广东 韶关 512026摘要：目的分析水环境中 3 种典型污染物氰（CN-）、汞（Hg2+）和草甘膦（Glyphosate）联合作用时对海洋发光菌的毒性。方法将不同浓度的 CN-、Hg2+和 Glyphosate 以相等体积两两组合配制成混合溶液，同时以 3%NaCl 溶液作为空白对照，加入明亮发光杆菌 T3 变种，分别用生物毒性测试仪测试样品和空白对照的发光度，计算发光损失率，并对数据进行分析。结果CN-和 Hg2+联合作用时，不同浓度污染物组合所致的发光损失率之间的差异有统计学意义（P0.01），其中，分别使发光菌的发光率降低 50%的毒物浓度（median effective concentration，EC50）的 CN-和 Hg2+组合所致的发光损失率最高，达到（84.0016.74）%；CN-和 Glyphosate 联合、Hg2+和 Glyphosate 联合作用时，也表现出类似的趋势（均 P0.01），浓度为 EC50的CN-和 Glyphosate 组合所致的发光损失率为（81.0717.22）%，浓度为 EC50的 Hg2+和 Glyphosate 组合所致的发光损失率为（82.4719.73）%。结论随着联合污染物浓度的提高，发光损失率也逐渐增高，二种污染物联合作用时对海洋发光菌所致的发光损失率大于二者的单独作用，利用海洋发光菌对水环境中联合污染物的毒性进行监测和评价具有一定优势。关键词：环境污染物；联合毒性效应；发光菌中国图书资料分类号：R117文献标识码：A文章编号：1004-1257（2023）03-0380-04Study on combined toxicity of three typical pollutants in water environment tomarine luminescent bacteriaZHANG Jian-jiang1，LIU Jian-ling1，CHEN Si-ping21.Medical College，Ningde Normal University，Ningde Fujian，352100，China；2.Medical College，Shaoguan University，ShaoguanGuangdong，512026，ChinaCorresponding author：CHEN Si-ping，Professor，E-mail：Abstract：Objective To analyze the combined toxicity of three typical pollutants，including cyanogen（CN-），mercury（Hg2+）andglyphosate，in water environment to marine luminescent bacteria.Methods The different concentrations of CN-，Hg2+and glyphosatewere combined on pairwise mode in equal volumes to form a mixed solution.At the same time，3%NaCl solution was used as theblank control，and Photobacterium phosphoreum T3 variant was added.The luminosity of the samples and the blank control weretested with a biological toxicity tester，to calculate the luminescent loss rate，and the data were analyzed.Results There wasstatistically significant difference in the luminous loss rate caused by the combination of CN-and Hg2+at different concentrations（P0.01）.The combination of CN-and Hg2+at the concentration of median effective concentration（EC50），which reduced theluminescent rate of Photobacterium phosphoreum by 50%，resulted in the highest luminescent loss rate of（84.0016.74）%.Forthe combinations of CN-and glyphosate or Hg2+and glyphosate，it also showed a similar trend（all P0.01）.The luminous loss ratecaused by the combination of CN-and glyphosate at the concentration of EC50was（81.0717.22）%，and the luminous loss ratecaused by the combination of Hg2+and glyphosate at the concentration of EC50was（82.4719.73）%.Conclusions With the increaseof the concentration of combined pollutants，the luminous loss rate also gradually increases.The luminous loss rate caused by themixture of the two pollutants is greater than that caused by the two pollutants alone.Using marine luminescent bacteria to monitorand evaluate the toxicity of combined pollutants in water environment has certain advantages.Keywords：Environmental pollutants；Combined toxic effects；Luminescent bacteria 论著 380DOI:10.13329/ki.zyyjk.2023.0060职业与健康2023 年 2 月第 39 卷第 3 期Occup and Health，Feb.2023，Vol.39，No.3近年来，随着人们环境意识的不断提高，公众对环境污染及由此造成的健康损害效应愈发关注。有调查表明，相当一部分空气及土壤中的污染物会通过各种途径最终进入到水环境中1，其中检出的污染物种类不断增加2，对全球生态系统的危害日益凸显3。目前，传统的污染物检测方法主要是色谱-质谱以及分光光度计等仪器分析方法，这些方法无法对污染物的生物危害性进行评估，而生物监测则通过生物体在自身结构、功能和生理学等指标上的变化，来对环境污染物的生物学效应进行监测和评价4。海洋发光菌是一种从海洋中分离出来的可以自身发光的微生物，当发光菌接触到有毒物质时，其发光强度将减弱，并且减弱的程度与毒物浓度间呈较好的线性关系，基于此原理，国内外不同的学者分别利用海洋发光菌对水环境中的重金属5、无机有毒物6、农药7等单一污染物进行了监测和评价。水环境中的污染物具有混合存在的显著特征，其产生的联合毒性更具有实际意义，但目前有关水环境中污染物联合毒性的研究却非常薄弱。为此，本研究在前期利用海洋发光菌对水环境中单一污染物氰化物（CN-）、汞（Hg2+）和草甘膦（Glyphosate）等进行毒性评价的基础上8-9，进一步进行了污染物的联合毒性研究，旨在为水环境中混合污染物的生物学效应评价提供参考。1材料与方法1.1仪器和试剂DXY-3 型智能化生物毒性测试仪（发光量测试范围 01 999 mV，中国科学院南京土壤研究所），pHS-3E 智能型 pH 计（上海雷磁仪器有限公司），ME104T 精密微量电子天平（量程 0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司），默克密理博 Milli-Q IQ7000 超纯水仪（美国密理博公司），SZ-93A 自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器有限公司），BILON10-300C 型超声波清洗器（上海比朗仪器制造有限公司），DHG-9023A 电热恒温干燥箱（上海笃特科学仪器有限公司）。明亮发光杆菌（photobacterium phosphoreum）T3 变种（中国科学院南京土壤研究所），T3 变种冻干粉由安瓿瓶包装，04 冰箱中冷藏保存，有效期为 180 天，有效期内使用，氰（CN-）标准溶液标准物质编号：GBW（E）080115，中国计量科学研究院，批号 20210520，汞（Hg2+）标准溶液（天津华特化研科技有限公司，批号 20201218），草甘膦（Glyphosate），化学名称为 N-（磷酸甲基）甘氨酸，化学式为 C3H8NO5P（Sigma 试剂公司，生物试剂，含量99%），氯化钠（分析纯，西安化学试剂厂）。1.2方法为便于不同污染物之间的相互比较，本次分析分别设定污染物的两个浓度，EC10是指使发光菌的发光率降低 10%时毒物的浓度，EC50是指使发光菌的发光率降低 50%时毒物的浓度，根据前期单一环境污染物对发光菌毒性测试的结果8-9，CN-的 EC10和 EC50分别为 0.04 和 0.21 mg/L，Hg2+的 EC10和 EC50分别为 0.07和 0.16 mg/L，Glyphosate 的 EC10和 EC50分别为 11.61和 185.52 mg/L，每个浓度设 5 份平行样品。按照环境污染物各自 EC10和 EC50以相等体积两两组合配制成混合溶液，即混合样品 1 为 0.04 mg/L 的 CN-+0.07 mg/L的 Hg2+，混合样品 2 为 0.04 mg/L 的 CN-+0.16 mg/L 的Hg2+，其他混合样品以此类推。见表 13。3 种水环境中污染物不同浓度的样品与对照均采用 18.2 M cm 超纯水进行溶液配制，pH 值调整为中性，配制好的样品与对照均保存于 04 冰箱中冷藏待用，保存期限低于 12 h。对照组统一采用 3NaCl 溶液，同一批样品在测定过程中要求测试室环境温度波动不超过1，所有测试器皿及试剂、溶液于测试前 1 h 置于控温的测试室内。实验时吸取 2 mL 混合污染物溶液放置于定量比色管中，同时吸取 2 mL 3%NaCl 溶液作为空白对照，样品和空白对照分别置于同一试管架上，迅速吸取复苏的 10 L 菌液按顺序加入各盛装混合污染物和空白对照比色管中，加塞后上下颠倒并振荡 5 次，去塞置于试管架上开始准确计时，精确到秒，15 min 后分别将混合污染物和空白对照置于生物毒性测试仪中，对发光菌的发光度进行测试，记录读数后利用公式计算相对发光率，以 5 次测试的平均值为准，发光损失率=1-（样品发光强度/对照发光强度100%）。1.3统计学分析采用 SPSS 21.0 进行分析，数据以xs 进行描述，组间比较利用单因素方差分析，检验水准 0.05。2结果2.1CN-和 Hg2+联合作用对发光菌的毒性不同污染物组合所致发光损失率各不相同，总体而言，随着污染物浓度的提高，发光菌的发光损失率也逐渐提高。经统计学分析发现，不同联合模型所致的发光损失率比较，差异有统计学意义（F=51.063，P0.01）；进一步两两比较分析发现，联合模型二、三、四与模型一相比，差异均有统计学意义（均 P0.01），同时，联合模型二、三与模型四相比，差异均有统计学意义（均 P0.01），但模型二、三之间的差异无统计学意义（P0.05）。见表 1。2.2CN-和 Glyphosate 联合作用对发光菌的毒性0.04mg/L（EC10）的 CN-与 11.61 mg/L（EC10）的 Glyphosate 联合作用时，发光损失率为（22.6012.13）%。经统计学分析发现，联合模型一、二、三和四污染物组合所致的发381职业与健康2023 年 2 月第 39 卷第 3 期Occup and Health，Feb.2023，Vol.39，No.3表 1CN-和 Hg2+联合作用时对发光菌的毒性联合模型CN-（mg/L）Hg2+（mg/L）污染物组合（CN-+Hg2+）发光损失率（%）一0.040.07EC10+EC1025.008.20二0.040.16EC10+EC5059.4012.98ab三0.210.07EC50+EC1059.4713.23ab四0.210.16EC50+EC5084.0016.74a注：a与联合模型一相比，P0.01；b与联合模型四相比，P0.01。表 2CN-和 Glyphosate 联合作用时对发光菌的毒性联合模型CN-（mg/L）Glyphosate（mg/L）污染物组合（CN-+Glyphosate）发光损失率（%）一0.0411.61EC10+EC1022.6012.13二0.04185.52EC10+EC5055.2715.67ab三0.2111.61EC50+EC1046.279.48ab四0.21185.52EC50+EC5081.0717.22a注：a与联合模型一相比，P0.01；b与联合模型四相比，P0.01。表 3Hg2+和 Glyphosate 联合作用时对发光菌的毒性联合模型Hg2+（mg/L）Glyphosate（mg/L）污染物组合（Hg2+Glyphosate）发光损失率（%）一0.0711.61EC10+EC1025.7312.23二0.07185.52EC10+EC5047.2713.68ab三0.1611.61EC50+EC1049.8714.61ab四0.16185.52EC50+EC5082.4719.73a注：a与联合模型一相比，P0.01；b与联合模型四相比，P0.01。光损失率比较，差异有统计学意义（F=44.949，P0.01）；进一步两两比较分析发现，联合模型二、三、四与模型一相比，差异均有统计学意义（均 P0.01），同时，联合模型二、三与模型四相比，差异均有统计学意义（均 P0.01），但模型二、三之间的差异无统计学意义（P0.05）。见表 2。2.3Hg2+和 Glyphosate 联合作用对发光菌的毒性联合模型一、二、三和四的发光损失率分别为（25.7312.23）%、（47.2713.68）%、（49.8714.61）%和（82.4719.73）%，经统计学分析发现，差异有统计学意义（F=34.972，P0.01）；进一步两两比较分析发现，联合模型二、三、四与模型一相比，差异均有统计学意义（均 P0.01），同时，联合模型二、三与模型四相比，差异均有统计学意义（均 P0.01），但模型二、三之间的差异无统计学意义（P0.05）。见表 3。3讨论近年来，随着我国经济的快速发展和工业化进程的加速，进入到水环境中的污染物大幅增长，氰污染主要来源于一些电子产品、染料和药品等生产过程中的排放物，氰化物属于剧毒物质，即使含量很低也会对生态系统产生严重负面影响10。汞的用途非常广泛，目前，我国约有近百种工业生产需要汞作为生产原料，水环境中的无机汞可在微生物的作用下转化为有机汞，并通过食物链的富集进入生物体而危害健康11。草甘膦是目前世界上产量最大、应用最为广泛的非选择性有机磷除草剂，由于使用量巨大，喷洒在植物附近的残余草甘膦可能通过雨水冲刷和地表径流而迁移到地表和地下水中，草甘膦的显著特征是易溶于水，在水环境中性质稳定，成为一种对机体健康有重要影响的污染物12。水环境中的污染物具有混合存在的特点，单一污染物的毒性效应显然已无法满足现实水环境的实际状况，环境污染物联合毒性的研究迫在眉睫。海洋发光菌对环境污染物毒性的测试具有应用范围广、使用简便、响应迅速等优势13，本次实验将海洋发光菌作为指示生物，将水环境中三种典型的污染物进行混合，以测试其对海洋发光菌的联合毒性，结果表明，无论 CN-和 Hg2+联合、CN-和 Glyphosate 联合还是Hg2+和 Glyphosate 联合，都表现为随着联合污染物浓度的提高，发光损失率也逐渐增高，这与国内外其他学者所研究的单一环境污染物对海洋发光菌的毒性特点具有相似性，李建凤等14用 28 个含苯环类化合物的结构参数化表征，通过多元线性回归建立含苯环类化合物的分子结构与对发光菌急性毒性（-lgEC50）之间的关系模型，模型的相关系数达到了 0.960，MUNEESWARAN等15用发光菌评价几种重金属的毒性，暴露 15 min 后，显示 Cr、Cu、Ni 和 Zn 的浓度与发光率之间具有很高的相关性。环境污染物的单独与联合作用所致的生物学效应明显不同，毒物的联合作用是一个颇为复杂的问题16，但同时也更符合环境污染所致健康损伤的实际情况。本次实验结果显示，在联合模型一（EC10+EC10）中，EC10的 CN-、EC10的 Hg2+或 EC10的 Glyphosate 单独作用时分别使发光菌发光损失率为 10%，但二者联合作用时，发光损失率均大于二者的单独作用，联合模型二（EC10+EC50）、模型三（EC50+EC10）和模型四（EC50+EC50）也都表现出类似的趋势，这表明水环境中污染物单独作用使发光菌发光损失率与二者联合作用使发光菌发光损失率之间存在较大区别，水环境中不同污染物的组合是作为一个整体而产生生物学效应的17，基于生物学原理建立的发光菌毒物检测技术有一个独特的优势，对于水环境中需要检测的成分复杂、种类繁多的污染物，该技术能同时对多种污染物产生受抑反应，进而可以了解其综合生物毒性效应18，这些优势使得该技术既可以单独使用，也可作为传统仪器等色谱分析法的有益补充。本次实验的优势体现在利用海洋发光菌对水环境中 3 种污染物进行了联合毒性的评估，据查阅到的文献，目前尚未见到其他报道，但由于本次分析的指标有382职业与健康2023 年 2 月第 39 卷第 3 期Occup and Health，Feb.2023，Vol.39，No.31790，1794.23马丹婷.护士工作生活质量，职业承诺与离职意愿的相关性研究以某大学附属三甲医院为例 D.广州：南方医科大学，2018.24胡慧秀，孙超，李欣，等.护士职业承诺在护理工作环境与离职倾向间的中介效应 J.中华现代护理杂志，2021，27（20）：2718-2723.25胡慧秀，孙超，孙可，等.我国东中西部地区护理工作环境与护士职业承诺的现状及关系研究 J.中华现代护理杂志，2020，26（34）：4748-4755.26李雪静，路潜，王泠.三级医院手术室专科护士工作压力及其与职业倦怠和组织承诺的相关性 J.护理学杂志，2018，33（13）：1-4.收稿日期：2022-06-10修回日期：2022-06-20责任编辑：张文洁限，毒物浓度的数量设置较少，且只对 3 种污染物的两两组合进行了联合毒性测试，结果具有一定局限性，在未来的研究中，应设置更多种类环境污染物，以评估其联合毒性，另一方面，环境污染物对发光菌联合毒性效应的机制也是今后需关注的一个重要方向。作者声明本文无实际或潜在的利益冲突参考文献1TANG Y，YIN M，YANG W，et al.Emerging pollutants in waterenvironment：Occurrence，monitoring，fate，and risk 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