七酶化学.pptx

第一节 酶引论酶的概述酶的概述1酶的化学本质酶的化学本质2酶的命名和分类酶的命名和分类3酶活力的测定酶活力的测定4核酶核酶5酶分子工程酶分子工程6酶促反应的特点：a.具有极高的催化效率：具有极高的催化效率：酶的催化效率可比一般化学催化剂高1071013倍，比没有催化剂时高出1081020倍如：在0度时：2H2O2 2H2O O21mol Fe2+每秒催化10-5 mol1mol 过氧化氢酶 每秒催化10 5 mol1.3.1.3.酶促反应的特点酶促反应的特点b.酶促反应的作用条件温和酶促反应的作用条件温和酶是由活细胞产生的，对周围环境的变化很敏感，不耐高温，高压，遇到强酸，强碱，重金属或紫外线等因素很容易失去活性。一般是在生物体温度范围内和接近中性的环境中起反应，即在常温，常压，酸碱度在接近中性环境条件下发挥作用。c.酶促反应的可调控性酶的催化活性在体内受到多种因素的调节，这是酶区别于一般催化剂的重要特征。如：共价修饰 酶原激活 反馈抑制调节等酶活性的调节酶含量的调节如：操纵子学说理论连续反应链条：一个酶反应的产物是另一酶反应的底物限速步骤：活化自由能做最高的一步反应反馈抑制反馈抑制：链的最终产物积累过多，它对限速步骤的酶产生的抑制作用 d.具有高度的底物专一性（specificity）一一种种酶酶只只作作用用于于一一种种或或一一类类化化合合物物，以以促促进进一一定定的的化化学学变变化化，生生成成一一定定的的产产物物，这种现象称为这种现象称为酶作用的特异性或专一性酶作用的特异性或专一性。H+H+可以催化多糖、脂质和蛋白质的水解。可以催化多糖、脂质和蛋白质的水解。如：蔗糖酶催化蔗糖的水解如：蔗糖酶催化蔗糖的水解 蛋白酶催化蛋白质的水解蛋白酶催化蛋白质的水解结构专一性结构专一性绝对专一性：绝对专一性：脲酶、麦芽糖酶相对专一性相对专一性立体专一性立体专一性基团专一性：基团专一性：己糖激酶、蛋白水解酶键专一性：键专一性：脂肪酶光学专一性：胰蛋白酶光学专一性：胰蛋白酶（L-氨基酸）氨基酸）几何专一性：琥珀酸脱氢酶几何专一性：琥珀酸脱氢酶底物专一性：底物专一性：（1）绝对专一性绝对专一性酶对催化反应的底物有严格的要求，仅仅对一种底物产生作用酶对催化反应的底物有严格的要求，仅仅对一种底物产生作用并且要求并且要求键键和和键两端的基团键两端的基团特异性很强。特异性很强。如：脲酶只能催化尿素的水解如：脲酶只能催化尿素的水解H2O2NH3 +CO2脲酶脲酶如果尿素分子上的一个氨被氯或甲基取代，形成结构相似的如果尿素分子上的一个氨被氯或甲基取代，形成结构相似的衍生物，则脲酶却不发生反应。衍生物，则脲酶却不发生反应。Cl-CH3氯代尿素氯代尿素甲基代尿素甲基代尿素（2）相对专一性相对专一性酶对底物的要求不是特别严格，只要键或键两端的基团相似酶对底物的要求不是特别严格，只要键或键两端的基团相似即可催化反应。即可催化反应。基团专一性：酶只需要底物分子反应键一端的基团与之适应基团专一性：酶只需要底物分子反应键一端的基团与之适应键专一性：酶只要求底物中有适应的化学键即可，对键两端的键专一性：酶只要求底物中有适应的化学键即可，对键两端的 基团没有要求基团没有要求基团专一性基团专一性 例如：例如：-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶要求必须有糖苷键，并且一端必须是葡萄糖，另一端没有要求。要求必须有糖苷键，并且一端必须是葡萄糖，另一端没有要求。键专一性键专一性 例如：脂肪酶例如：脂肪酶 糖苷酶糖苷酶 蛋白酶蛋白酶只要求键适合即可，对键两端的基团没有要求只要求键适合即可，对键两端的基团没有要求脂肪酶脂肪酶 糖苷酶糖苷酶 蛋白酶蛋白酶（3）立体专一性立体专一性几乎所有的酶对底物的立体结构都有高度的选择性，即只能作用几乎所有的酶对底物的立体结构都有高度的选择性，即只能作用于底物的立体异构中的一种于底物的立体异构中的一种如：氨基酸除甘氨酸外都有如：氨基酸除甘氨酸外都有 D/L两种旋光异构体两种旋光异构体 糖类也有糖类也有D/L两种异构体两种异构体 双键化合物存在顺双键化合物存在顺/反异构现象反异构现象L-精氨酸氧化酶只能催化精氨酸氧化酶只能催化L-精氨酸氧化脱氨基，对精氨酸氧化脱氨基，对D-精氨酸酶作用精氨酸酶作用延胡索酸酶只能催化延胡索酸酶只能催化 反反-丁烯二酸（延胡索酸）水合生成苹果酸，丁烯二酸（延胡索酸）水合生成苹果酸，而对顺丁烯二酸（富马酸）没有作用而对顺丁烯二酸（富马酸）没有作用 酶的立体专一性包括旋光异构专一性、顺反异构专一性和区分酶的立体专一性包括旋光异构专一性、顺反异构专一性和区分对称分子中的两个相同的基团。对称分子中的两个相同的基团。+H2O延胡索酸酶 H-C-COOHHOOC-C-H反丁烯二酸反丁烯二酸（延胡索酸）（延胡索酸）COOHHO-C-H CH2 COOHL-苹果酸苹果酸（a）锁钥学说 认为整个酶分子的天然构象是具有认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构刚性结构的，酶的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样匙对一把锁一样(刚性模式刚性模式)（E.Fisher）1.4.酶催化化学反应的原理学说（决定酶专一性的机制）酶催化化学反应的原理学说（决定酶专一性的机制）(b)“三点结合”的催化理论（A.Ogster）认为酶与底物的结合处至少认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作这种情况下，不对称催化作用才能实现。用才能实现。用于解释立体催化的机理用于解释立体催化的机理HHO-CH2CH2-OHOHABC甘油分子的三个立体基团都同时附着于甘油分子的三个立体基团都同时附着于甘油激酶的分子表面的特异结合位点甘油激酶的分子表面的特异结合位点AB C上，这三个部位有一个是催化部位上，这三个部位有一个是催化部位两外两个是结合部位，即甘油分子与甘两外两个是结合部位，即甘油分子与甘油激酶只有一种结合方式。油激酶只有一种结合方式。结合部位结合部位催化部位催化部位HOCOOHCH3OHHOOCCH3乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶L-(+)-乳酸乳酸d-(-)-乳酸乳酸结合发生反应结合发生反应不能结合，不能发生反应不能结合，不能发生反应（c）诱导契合学说该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.(柔性学说柔性学说)(D.E.Koshland)酶蛋白酶蛋白 (apoenzyme)：多肽；决定多肽；决定特异性、高效性特异性、高效性辅因子辅因子(cofactor)：非蛋白组分；递非蛋白组分；递氢、电子、基团；决定反应类型、氢、电子、基团；决定反应类型、性质性质全酶全酶(缀合蛋白缀合蛋白)2.1.酶的酶的化学本质化学本质n辅基辅基(prosthetic group)：与酶蛋白结合牢固，不能用：与酶蛋白结合牢固，不能用透析等简单方法与酶蛋白分离的有机小分子透析等简单方法与酶蛋白分离的有机小分子 n辅酶辅酶(coenzyme):：与酶蛋白结合不牢固，能用透析：与酶蛋白结合不牢固，能用透析等简单方法与酶蛋白分离的有机小分子。等简单方法与酶蛋白分离的有机小分子。简单蛋白质：简单蛋白质：有氨酸酸残基：溶菌酶、脂肪酶、蛋白酶辅酶辅基与维生素及核苷酸的关系辅酶辅基与维生素及核苷酸的关系辅助成分辅助成分作作 用用维生素组分维生素组分核苷酸组核苷酸组分分NAD+（辅酶（辅酶）递氢（脱氢酶）递氢（脱氢酶）尼克酰胺尼克酰胺（Vpp,B5）AMPNADP+（辅酶（辅酶）CoA-SH（辅酶（辅酶A）转移酰基转移酰基泛酸（泛酸（B3）FH4（四氢叶酸）（四氢叶酸）转移一碳单位转移一碳单位叶酸（叶酸（B11）磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛/胺胺转移氨基（转转移氨基（转氨酶）、羧基氨酶）、羧基（脱羧酶）（脱羧酶）吡哆醛吡哆醛/胺胺（B6）焦磷酸硫胺素焦磷酸硫胺素TPP转移醛基转移醛基硫胺素（硫胺素（B1）黄素腺嘌呤二核苷酸黄素腺嘌呤二核苷酸FAD递氢（脱氢酶）递氢（脱氢酶）核黄素（核黄素（B2）AMPFMN（黄素单核苷酸黄素单核苷酸）1.1.稳定构象稳定构象：稳定酶蛋白催化活性所必需的分子构象；：稳定酶蛋白催化活性所必需的分子构象；2.2.构构成成酶酶的的活活性性中中心心：作作为为酶酶的的活活性性中中心心的的组组成成成成分分，参参与与构构成酶的活性中心，如辅酶或辅基；成酶的活性中心，如辅酶或辅基；3.3.连接作用连接作用：作为桥梁，将底物分子与酶蛋白螯合起来。：作为桥梁，将底物分子与酶蛋白螯合起来。酶辅基中金属离子的作用酶辅基中金属离子的作用如：醛缩酶如：醛缩酶 需要需要 Mn 2+如：唾液淀粉酶如：唾液淀粉酶 需要需要 Cl-如：磷酸酶如：磷酸酶 需要需要 Mg 2+如：抗坏血酸氧化酶如：抗坏血酸氧化酶 需要需要 Cu 2+2.2 酶的四级缔合酶的四级缔合 n单体酶：只有一条多肽链，催化水解反应的酶，核糖核酸酶A，溶菌酶；胰凝乳蛋白酶（3条肽链）n寡聚酶：具有多条多肽链，同多聚酶（丙酮酸激酶）、杂多聚酶（乳酸脱氢酶）n多功能酶（串联酶）：多种酶缔合而成的结构、功能实体，催化细胞代谢中的连续反应序列。一个酶分子具有多种生物催化活性，由多酶体系在进化中基因融合形成，丙酮酸脱氢酶复合物多功能酶多功能酶（多功能酶（Multifunctional Enzyme ME）:结构上仅有一条肽链，结构上仅有一条肽链，但却有两种或两种以上的功能的酶蛋白。但却有两种或两种以上的功能的酶蛋白。如：大肠杆菌（如：大肠杆菌（E.coil）的）的 天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶I高丝氨酸脱氢高丝氨酸脱氢酶酶I这个酶有四个亚基组成，但两催化作用的活性中心在一条多肽这个酶有四个亚基组成，但两催化作用的活性中心在一条多肽链上，其中链的链上，其中链的N端部分具有天冬氨酸激酶活性，链的端部分具有天冬氨酸激酶活性，链的C端具有端具有高丝氨酸脱氢酶的活性。高丝氨酸脱氢酶的活性。如：动物体中如：动物体中 脂肪酸合成酶，脂肪酸合成酶，7种功能集中在一条多肽链上。种功能集中在一条多肽链上。如：大肠杆菌如：大肠杆菌 色氨酸合成酶色氨酸合成酶寡聚酶有不同亚基组成，每个亚基表现出不同的催化功能，也称寡聚酶有不同亚基组成，每个亚基表现出不同的催化功能，也称为多功能酶。为多功能酶。该酶含有两种亚基该酶含有两种亚基 ，亚基亚基I A蛋白蛋白 M29500亚基亚基IIB蛋白蛋白 M450002A2B=2 色氨酸合成酶色氨酸合成酶吲哚甘油磷酸吲哚甘油磷酸 吲哚吲哚 3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛吲哚吲哚 L-丝氨酸丝氨酸 L-色氨酸色氨酸吲哚甘油磷酸吲哚甘油磷酸 L-色氨酸色氨酸 3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛A蛋白蛋白B蛋白蛋白色氨酸合成酶色氨酸合成酶1.酶活力酶活力:指酶催化一定化学反应的能力，酶活力与酶催化的化学反应速度成正比2.反应速度反应速度：用单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量表示（单位：浓度/时间）3.酶的活力单位酶的活力单位1个酶活力单位（IU）:规定的条件下,在1分钟内催化1mol底物转化为产物的酶量（1961年)。1个Katal:规定的条件下,每秒钟内催化1mol底物转化为产物的酶量（1972年)。条件条件：温度25摄氏度,其它条件(PH及底物浓度)均采用最适条件。4.2 酶活力的测定酶活力的测定 反应速率为反应速率为A对时间的导数对时间的导数反应速率在曲线上某一点的斜率反应速率在曲线上某一点的斜率酶活力测定采用初速度酶活力测定采用初速度v0一般以测定产物为好-底物浓度为量，测定不准确；产物从无到有，准确。酶反应速度在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降。原因：A.底物浓度下降B.酶在一定PH及温度下失活C.产物对酶的抑制，产物上升而加速逆反应。测定浓度的方法：分光光度测定法、荧光测定法其他方法：化学分析法、电化学法、放射性同位素测定法 所以研究酶的反应速度以酶促反应的初速度为准。所以研究酶的反应速度以酶促反应的初速度为准。4酶的比活力酶的比活力 酶含量大小，即每毫克蛋白所具有的酶活力单位酶含量大小，即每毫克蛋白所具有的酶活力单位/毫克蛋白毫克蛋白 （/mg蛋白质蛋白质)每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示（单位（单位/克克 or 单位单位/ml）对同一种酶来说，比活力越高，表示酶越纯对同一种酶来说，比活力越高，表示酶越纯。5酶的转换数酶的转换数kcat 每分钟每分钟1mol酶分子转换底物的微摩尔数（酶分子转换底物的微摩尔数（mol）6酶活力的测定酶活力的测定反应时间尽量短，5min之内温度、pH等条件保持恒定为了让酶的催化潜能重复表现出来，底物和酶的辅助因子必须过量反应初速度与底物浓度是零级反应，与酶浓度是一级反应酶反应进程曲线酶浓度曲线对照和空白典型例题典型例题称取称取25mg25mg蛋白酶粉配置成蛋白酶粉配置成25ml25ml酶溶液，从中取出酶溶液，从中取出0.1ml0.1ml酶液，以酶液，以酪蛋白为底物，用酪蛋白为底物，用FolinFolin酚法测定酶活力，得知每小时产生酚法测定酶活力，得知每小时产生15001500g的酪氨酸；另取的酪氨酸；另取2ml2ml酶液，用凯氏定氮法测的蛋白氮为酶液，用凯氏定氮法测的蛋白氮为0.2mg0.2mg，若以每分钟产生若以每分钟产生1 1g酪氨酸为酪氨酸为1 1个活力单位计算，个活力单位计算，根据以上数据，求出：根据以上数据，求出：（1 1）1ml1ml酶液中所含的蛋白质的量及活力单位数？酶液中所含的蛋白质的量及活力单位数？（2 2）比活力？）比活力？（3 3）1g1g酶制剂的总蛋白含量及总活力？酶制剂的总蛋白含量及总活力？解解：（：（1）由题意，已知）由题意，已知2ml酶液中含酶液中含0.2mg蛋白氮，蛋白氮，则则1ml酶液中含酶液中含0.1mg蛋白氮蛋白氮 因为，蛋白质中平均含因为，蛋白质中平均含N量量16%所以，所以，0.1mg氮相当于蛋白质的量为：氮相当于蛋白质的量为：0.1/16%=0.625mg 即：即：1ml酶液中蛋白质含量为酶液中蛋白质含量为0.625mg 又已知：又已知：0.1ml酶液中每小时产生酶液中每小时产生1500 g酪氨酸酪氨酸 则：则：1ml酶液中每小时产生酶液中每小时产生1500 10g酪氨酸酪氨酸 据定义：每分钟产生据定义：每分钟产生1 g酪氨酸的酶量为酪氨酸的酶量为1个活力单位个活力单位 所以：所以：1ml酶液中所含酶单位为：酶液中所含酶单位为：150010 60=250 U（2）比活力是指酶活力单位比活力是指酶活力单位/mg酶蛋白酶蛋白 由前计算可知：由前计算可知：0.625mg酶蛋白含酶蛋白含250酶单位酶单位 则：则：1mg酶蛋白含酶蛋白含x个酶单位个酶单位（3）总活力）总活力=比活力比活力酶蛋白总量酶蛋白总量=400625 =2.5105酶单位酶单位 X=400酶单位酶单位/mg蛋白蛋白25010.625一、酶促反应的速度和影响因素在低底物浓度时在低底物浓度时,反应初速度与反应初速度与底物浓度成正比，表现为底物浓度成正比，表现为一级反一级反应应特征。特征。当底物浓度较高时，增加底物浓当底物浓度较高时，增加底物浓度，反应初速度增加的较慢，反度，反应初速度增加的较慢，反应速度与底物浓度不再呈正比，应速度与底物浓度不再呈正比，表现为表现为混合级反应混合级反应。当底物浓度达到一定值，几乎所当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应初有的酶都与底物结合后，反应初速度达到最大值（速度达到最大值（V Vmaxmax），此时），此时再增加底物浓度，反应初速度不再增加底物浓度，反应初速度不再增加，表现为再增加，表现为零级反应零级反应。（一）底物浓度对酶促反应速度的影响（一）底物浓度对酶促反应速度的影响底物对酶促反应的饱和现象底物对酶促反应的饱和现象饱和效应，非催化反应无此效应饱和效应，非催化反应无此效应中间复合体学说中间复合体学说稳态模型的稳态模型的4个假设：个假设：E与与S形成形成ES复合物的反应是可逆反应，快速平衡反应，复合物的反应是可逆反应，快速平衡反应，ES分解为分解为E及及P的反应为慢反应，反应速度取决的反应为慢反应，反应速度取决于限速步骤于限速步骤S的总浓度远远大于的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即的浓度可认为不变即SSt游离酶浓度游离酶浓度=E-ES不考虑不考虑 P+E ES 这个逆反应这个逆反应 中间产物中间产物vv 酶促反应模式酶促反应模式中间产物学说中间产物学说E+S k1k-1k2ESE+Pv1913年年Michaelis和和Menten提提出出反反应应速速度度与与底底物物浓浓度度关关系系的的数数学学方方程程式式，即即米米曼曼氏氏方方程程式式，简简称称米米氏氏方方程程式式(Michaelis equation)。S：底物浓度：底物浓度V：不同：不同S时的反应速度时的反应速度Vmax：最大反应速度：最大反应速度(maximum velocity)m：米氏常数：米氏常数(Michaelis constant)0 推导过程推导过程推导过程推导过程:游离酶浓度游离酶浓度游离酶浓度游离酶浓度=Et-ES=Et-ES ES ES生成速度生成速度生成速度生成速度=k=k1 1(Et-ES)*S(Et-ES)*S ES ES分解速度分解速度分解速度分解速度=k=k2 2ES+kES+k-1-1ESES 当稳态时：当稳态时：当稳态时：当稳态时：ES ES生成速度生成速度生成速度生成速度=ES=ES分解速度分解速度分解速度分解速度 k k1 1(E(Et t-ES)*S=k-ES)*S=k2 2ES+kES+k-1-1ESESE+S k1k-1k2ESE+P (E (Et t-ES)*S-ES)*S k k-1-1+k+k2 2 ES k ES k1 1 ESES=因因因因v=kv=k2 2ESES，当所有，当所有，当所有，当所有E E被被被被S S饱和时，即达到最大饱和时，即达到最大饱和时，即达到最大饱和时，即达到最大速度，此时速度，此时速度，此时速度，此时ES=EES=Et t，V Vmaxmax=k=k2 2 E Et t 代入上式：代入上式：代入上式：代入上式：=KmEtSKm+Sv0=k2Et tSKmm+SVmaxmax SKmm+S=E+S k1k-1k2ESE+P k k1 1(E(Et t-ES)*S=k-ES)*S=k2 2ES+kES+k-1-1ESESG 米米-曼氏方程解释：曼氏方程解释：?当当SSKmKm时，时，v=(Vmax/Km)S,v=(Vmax/Km)S,即即v v 与与SS成正比成正比?当当SSKmKm时，时，v v0 0 VmaxVmax，即，即SS 而而v v不变不变?当反应速度等于最大速度一半时当反应速度等于最大速度一半时,即即V=1/2 Vmax,Km=SV=1/2 Vmax,Km=S0 1.1.当当0=1/2Vmax时，时，Km=S。因此，。因此，Km等于等于酶促反应速度达最酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度大值一半时的底物浓度。米氏方程的意义米氏方程的意义2.Km的应用是有条件的的应用是有条件的Km值作为常数是在特定的底物、一定的温度、值作为常数是在特定的底物、一定的温度、pH等条件下才等条件下才成立的，所以，成立的，所以，Km值可以作为鉴定酶的手段，但必须在指定的值可以作为鉴定酶的手段，但必须在指定的实验条件下进行才有意义。实验条件下进行才有意义。3.Km可以反映酶与底物亲和力的大小可以反映酶与底物亲和力的大小K2k-1时，时，Kmk-1/k1 Km越小，酶与底物的亲和力越大越小，酶与底物的亲和力越大E+S k1k-1k2ESE+P0E+S k1k-1k2ESE+P0 4.可用于判断反应级数：可用于判断反应级数：当当S100Km时，时，=Vmax，反应为零级反应，反应为零级反应 当当0.01KmS100Km时，为混合级反应。时，为混合级反应。Km值在试剂应用中的意义值在试剂应用中的意义1.鉴定酶鉴定酶测定测定Km值可以鉴别不同来源或相同来源的不同发育期下催化相值可以鉴别不同来源或相同来源的不同发育期下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。同反应的酶是否属于同一种酶。2.Km可用来判断酶的最适底物（天然底物）可用来判断酶的最适底物（天然底物）当酶有几种不同的底物存在时，每个底物对酶都有一个当酶有几种不同的底物存在时，每个底物对酶都有一个Km值，值，通过测定酶在不同底物存在时的通过测定酶在不同底物存在时的Km值，值，Km值最小者，即为该值最小者，即为该酶的最适底物酶的最适底物。3.可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度 当当S=10Km时，时，=91%Vmax，此时即为最合适的测定酶活，此时即为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。性所需的底物浓度。04.了解酶的底物在体内具有的浓度水平了解酶的底物在体内具有的浓度水平一般说来，作为酶的最适底物，在体内的浓度水平是接近它一般说来，作为酶的最适底物，在体内的浓度水平是接近它的的Km值的，值的，如果：如果：S体内体内 Km 则，则，v Km 则，则，v 始终接近于始终接近于 Vmax,这种底物浓度这种底物浓度也失去其生理意义，不符合实际情况也失去其生理意义，不符合实际情况 5.判断反应方向与趋势判断反应方向与趋势酶催化可逆反应，正逆反应的酶催化可逆反应，正逆反应的Km值一般不同，测定正逆反应的值一般不同，测定正逆反应的Km值可以大致推测该酶催化的正逆反应的方向，这对了解细胞值可以大致推测该酶催化的正逆反应的方向，这对了解细胞内酶的催化方向是非常重要的。内酶的催化方向是非常重要的。6.推测代谢途径推测代谢途径丙酮酸丙酮酸乙酰乙酰CoA乙醛乙醛乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶系丙酮酸脱氢酶系丙酮酸脱羧酶丙酮酸脱羧酶乳酸乳酸1.710-51.010-31.310-30V Vm m是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。Vmax=KVmax=K2 2 Et Et，当酶的总浓度和最大速度已知时，如可从，当酶的总浓度和最大速度已知时，如可从VmaxVmax计算计算酶的转换数酶的转换数，即动力学常数，即动力学常数K K2 2。酶的转换数酶的转换数(turnover number):(turnover number):当酶被底物充分饱和时，单位当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。酶的转换数可用来比较每单位酶的催化能力酶的转换数可用来比较每单位酶的催化能力V Vm m的意义的意义斜率斜率=Km/Vmax-1/Km1/VmaxKm和和Vmax的测定的测定:Lineweaver-Burk方程方程(双倒数作图法双倒数作图法)当1/S=0时，1/v=1/Vm 直线纵轴上的截距即为1/Vmax从方程可看出当1/v=0时，则1/S=-1/Km直线外推至与横轴相交，其横轴截距既为-1/Km 1.pH 的影响在一定的pH 下,酶具有最大的催化活性,通常称为最适pH唾液淀粉酶唾液淀粉酶精氨酸酶精氨酸酶9.8胃蛋白酶胃蛋白酶1.5植物和微生物植物和微生物 最适最适pH4.5-6.5动物动物 最适最适pH6.5-8.0最适最适pH不是酶的特征常数该值随着不是酶的特征常数该值随着底物性质及浓度、介质的离子强度、底物性质及浓度、介质的离子强度、温度与作用时间不同而不同温度与作用时间不同而不同（二）影响酶促反应速率的其他因素（二）影响酶促反应速率的其他因素pH对酶促反应速度的影响原因：对酶促反应速度的影响原因：1.1.导致蛋白质变性导致蛋白质变性2.2.影响酶分子的构象影响酶分子的构象过高过低的pH会改变酶的活性中心的空间构象，甚至改变整个酶分子的构象3.3.影响酶和底物的互相解离影响酶和底物的互相解离酶和底物的结合的前体是基团处于解离状态，而其解离受到外界pH值影响很大，即受到酸碱度的影响另一方面另一方面,温度升高温度升高,酶的高级结酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。性降低甚至丧失。因此大多数酶都有一个最适温度。因此大多数酶都有一个最适温度。在在最适温度最适温度条件下条件下,反应速度最大。反应速度最大。2.温度的影响温度的影响一方面是温度升高一方面是温度升高,酶促反应速度加快。酶促反应速度加快。温度每上升温度每上升10度所增加的化学反应速率，称为温度系数（度所增加的化学反应速率，称为温度系数（Q10）就整个生物界，就整个生物界，植物和微生物植物和微生物 最适温度最适温度32度度-60度度 动物动物 最适温度最适温度35度度-40度度少数特少数特殊酶，殊酶，如液化淀粉酶如液化淀粉酶 的最适温度为的最适温度为85度度最适温度不是酶的特征常数，该值随着底物性质及浓度、介最适温度不是酶的特征常数，该值随着底物性质及浓度、介质的离子强度、温度与作用时间不同而不同。质的离子强度、温度与作用时间不同而不同。意义：意义：临床上，低温麻醉，减慢细胞的代谢速度，以利于治疗临床上，低温麻醉，减慢细胞的代谢速度，以利于治疗低温保藏种子，降低酶的活性低温保藏种子，降低酶的活性医学上，实验室中高温消毒，高温是酶蛋白变性医学上，实验室中高温消毒，高温是酶蛋白变性4.4 激活剂对反应速度的影响 能够促使酶促反应速度加快的物质称为能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激活剂酶的激活剂。1.酶的激活剂大多数是无机离子，如酶的激活剂大多数是无机离子，如K+、Mg2+、Mn2+、Cl-等。等。如：醛缩酶如：醛缩酶 需要需要 Mn 2+如：唾液淀粉酶如：唾液淀粉酶 需要需要 Cl-如：磷酸酶如：磷酸酶 需要需要 Mg 2+如：抗坏血酸氧化酶如：抗坏血酸氧化酶 需要需要 Cu 2+2.有些酶的激活剂中等大小的分子：有些酶的激活剂中等大小的分子：半胱氨酸半胱氨酸 巯基乙醇巯基乙醇 谷胱甘肽谷胱甘肽 维生素维生素3.大分子物质 如激活酶原的物质：激酶效用：提高酶的活性：使已有活性的酶的活性进一步提高 酶原的激活：使本来没有活性的酶原变成有活性的酶酶原的激活有些酶，当肽链合成后，即可自身折叠形成一定的三维结构，即表现出活性，如：溶菌酶有些酶，合成肽链后，是没有活性的前体：称为酶原酶原经激活活性中心暴露，才成为有活性的酶，这是生物自我保护的一种方式；它可保护其产生及运输部位的组织不被水解。没有活性的酶原没有活性的酶原有活性的酶分子有活性的酶分子激活剂激活剂去掉部分肽段去掉部分肽段肠激酶或肠蛋白酶肠激酶或肠蛋白酶Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys六肽六肽SSVal-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ile-Trp193Ser177SS胰蛋白酶原的激活胰蛋白酶原的激活肠激酶或肠蛋白酶肠激酶或肠蛋白酶胰蛋白酶原胰蛋白酶原激活剂作用特点：激活剂作用特点：酶对激活剂有一定选择性，Mg2+对脱羧酶有激活作用，对肌球蛋白的ATP酶抑制某些离子有拮抗作用，Na+抑制K+的激活作用有些金属离子激活剂可以相互替代，Mg2+可被Mn2+替代激活剂的作用与浓度有关，NADP+合成酶，Mg2+在510*10-3mol/L有激活作用，到30*10-3mol/L活性降低激活剂作用机制多种多样，作为辅酶、辅基，或者活性中心的构成部位4.抑制剂对酶活性的影响抑制剂抑制剂:与酶分子的某些必需集团结合，使酶的活性降与酶分子的某些必需集团结合，使酶的活性降低或丧失，这个现象，称为低或丧失，这个现象，称为酶的抑制作用酶的抑制作用。抑制剂对。抑制剂对酶具有选择性，他涉及酶的局部结构酶具有选择性，他涉及酶的局部结构变性剂：对酶无选择性，影响酶的整个三维结构。在变性剂：对酶无选择性，影响酶的整个三维结构。在变性剂的作用下引起酶活力降低或丧失的现象叫失活变性剂的作用下引起酶活力降低或丧失的现象叫失活酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：a.a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。b.b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体复合体或结合物。或结合物。按照抑制机理分类：按照抑制机理分类：失活作用：在外界物理或化学因素作用下，破坏了价键，使酶分子失活作用：在外界物理或化学因素作用下，破坏了价键，使酶分子的构象发生改变，即蛋白质变性，的构象发生改变，即蛋白质变性，变性剂对酶没有选择性变性剂对酶没有选择性抑制作用：酶的必须基团受到外界的抑制剂的影响，而发生改变抑制作用：酶的必须基团受到外界的抑制剂的影响，而发生改变从而导致酶活性的降低或丧失。从而导致酶活性的降低或丧失。抑制剂对酶有一定的选择性抑制剂对酶有一定的选择性去激活作用：金属酶（必须要金属离子存在下才有活性或高活性）去激活作用：金属酶（必须要金属离子存在下才有活性或高活性）如果用螯合剂取出金属离子，从而使酶的活性降低或丧失，常见如果用螯合剂取出金属离子，从而使酶的活性降低或丧失，常见的的EDTA去除二价阳离子（去除二价阳离子（Mg2+、Mn2+）可降低许多酶的活性。）可降低许多酶的活性。(1).(1).可逆抑制可逆抑制抑制剂与酶蛋白以抑制剂与酶蛋白以非共价非共价方式结合，引起酶活性方式结合，引起酶活性暂时性丧失暂时性丧失。抑制剂可以通过。抑制剂可以通过透析、超过滤透析、超过滤等方等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。I I、E E、ESES之间存在平衡，抑制程度由之间存在平衡，抑制程度由E E与与I I的亲和的亲和力、力、I I和和S S的浓度决定。的浓度决定。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为:竞争性抑制竞争性抑制、反竞争性抑制反竞争性抑制、非竞争性抑制非竞争性抑制几种几种类型。类型。抑制剂的作用方式抑制剂的作用方式竞争性抑制竞争性抑制:最常见、I与S有相似结构，争夺E活性部位，I与E的活性部位结合，但不转化为产物，竞争性抑制可借助增加底物浓度而消除。例：琥珀酸脱氢酶（丙二酸与丁二酸相似）反竞争性抑制反竞争性抑制：不与游离E结合，只与ES结合。结合在E活性部位以外的结合部位，不影响E与S的结合。阻止IES形成产物，增加底物，反应速率增加，但比无抑制剂时要小，与竞争性抑制不同竞争性抑制不同。非竞争性抑制非竞争性抑制：结合在E活性部位以外的结合部位，可以与E（非活性部位）和ES结合。S和I与E结合互不干扰的为纯非竞争性抑制。有影响的为混合型非竞争性抑制。抑制剂的作用方式a.a.不可逆抑制不可逆抑制抑制剂与酶反应中心的活性基团以抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价共价形式结合，不能采用形式结合，不能采用透析等简单方法使酶活性恢复的抑制作用就是不可逆抑制作透析等简单方法使酶活性恢复的抑制作用就是不可逆抑制作用。用。随随I I的浓度和作用时间增加而增强，不能用米的浓度和作用时间增加而增强，不能用米-曼方程处理。曼方程处理。引起酶的永久性失活。如有机磷毒剂对乙酰胆碱酯酶。引起酶的永久性失活。如有机磷毒剂对乙酰胆碱酯酶。酶的不可逆抑制作用包括酶的不可逆抑制作用包括:专一性不可逆抑制：抑制剂只作用于一种氨基酸侧链或一类酶专一性不可逆抑制：抑制剂只作用于一种氨基酸侧链或一类酶非专一性不可逆抑制：抑制剂作用于酶分子上的不同基团或作非专一性不可逆抑制：抑制剂作用于酶分子上的不同基团或作 用于几类不同的酶用于几类不同的酶如：路易士气对如：路易士气对巯基酶巯基酶的抑制、烷化剂（碘乙酸，的抑制、烷化剂（碘乙酸，DNFB）酰化剂（酸酐，碘酰氯）酰化剂（酸酐，碘酰氯）如：有机磷农药对如：有机磷农药对胆碱酯酶胆碱酯酶的丝氨酸羟基抑制的丝氨酸羟基抑制 有机汞专一抑制巯基、二异丙基氟磷酸（有机汞专一抑制巯基、二异丙基氟磷酸（DFP）Ev1.无抑制剂无抑制剂2.不可逆抑制剂不可逆抑制剂3.可逆抑制剂可逆抑制剂可逆抑制的动力学可逆抑制的动力学写出可逆抑制的动力学模型写出可逆抑制的动力学模型根据模型，写出酶守恒公式总的各项根据模型，写出酶守恒公式总的各项速率表达式写出如下速率表达式写出如下根据稳态假设写出各种酶形式根据稳态假设写出各种酶形式Ei的代数式，代入上式，消去的代数式，代入上式，消去实验不易测定的变数项实验不易测定的变数项动力学实验设计：动力学实验设计：I保持不变，保持不变，S逐步增加，每一逐步增加，每一S测定测定v0，然后做双倒数曲，然后做双倒数曲线线做几个不同做几个不同I浓度的抑制实验曲线浓度的抑制实验曲线(1)(1)竞争性抑制动力学曲线竞争性抑制动力学曲线无抑制剂竞争性抑制剂1/Vmax加入竞争性抑制剂后，加入竞争性抑制剂后，K Km m 变大，酶促反应速度减小。变大，酶促反应速度减小。E+SESI+EIkik1k2K-1E+P 竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同结合部位相同；抑抑制制剂剂浓浓度度越越大大，则则抑抑制制作作用用越越大大；但但增增加加底底物物浓浓度度可可使使抑制程度减小；抑制程度减小；动力学参数：动力学参数：KmKm值增大，值增大，VmVm值不变值不变。竞争性抑制的特点竞争性抑制的特点抑抑制制剂剂不不能能与与游游离离酶酶结结合合，但但可可与与ESES复复合合物物结结合合并并阻阻止止产产物物生生成，使酶的催化活性降低，称酶的反竞争性抑制。成，使酶的催化活性降低，称酶的反竞争性抑制。反竞争性抑制的特点：反竞争性抑制的特点：反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；抑制剂与底物可同时与酶的抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合不同部位结合；必必须须有有底底物物存存在在，抑抑制制剂剂才才能能对对酶酶产产生生抑抑制制作作用用；抑抑制制程程度度随底物浓度的增加而增加随底物浓度的增加而增加；动力学参数：动力学参数：KmKm减小，减小，VmVm降低。降低。(2)反竞争性抑制 (2)反竞争性抑制 (3)非竟争性抑制酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。非竞争性抑制剂。如某些金属离子（如某些金属离子（CuCu2+2+、AgAg+、HgHg2+2+）以及）以及EDTAEDTA等，通常能与酶分子的等，通常能与酶分子的调控部位中的调控部位中的-SH-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。非竞争性抑制的特点：非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；动力学参数：Km值不变，Vm值降低。非竞争性抑制的动力学曲线加入非竞争性抑制剂后，加入非竞争性抑制剂后，K Km m 虽然不变，但由于虽然不变，但由于Vmax减小，减小，所以酶促反应速度也下降所以酶促反应速度也下降无抑制剂非竞争性抑制剂-1/km+I+SESIEI+IEES+P+SE酶酶的的活活性性中中心心一、酶的活性中心一、酶的活性中心酶分子上具有一定空间构象的部位，该部位必须化学基团集酶分子上具有一定空间构象的部位，该部位必须化学基团集中，直接参与将底物转变为产物的反应过程，这一部位就称中，直接参与将底物转变为产物的反应过程，这一部位就称为为酶的活性中心酶的活性中心第三节 酶的作用机制和酶活性的调节活性中心内必需基团活性中心内必需基团活性中心外必需基团活性中心