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基因工程基本过程【实用文档】doc
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基因工程基本过程
基因工程（genetic ｅngiｎeering）,也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖(称之为＂克隆”)和行使正常功能(称之为＂表达”）,从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来,基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的ＤNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制,继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子,或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物.
常用的工具酶
限制性内切酶—主要用于DＮＡ分子的特异切割　
ＤNA甲基化酶-用于DNＡ分子的甲基化
核酸连接酶-用于DNＡ和RNＡ的连接
核酸聚合酶—用于DＮA和RNＡ的合成
核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割　
核酸末端修饰酶-用于DNA和RNA的末端修饰　
其它酶类——用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
主要过程有为四步：
一． 获得目的基因
有多种方法可获得目得基因
1. 构建cDＮＡ文库分离目的基因
过程：
（1） 从真核细胞中提取mRNＡ，以其为模板，在反转录酶的作用下合成cＤNＡ的第一条链。
（2） 以第一条链为模板,以反转录酶或DＮA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二条链。
（3） 在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。
（4） 接头或衔接子连接。
（5） 凝胶过滤分离cDNA。
（6） 通过核酸探针法或免疫反应法从cＤNA文库中分离特异cDNＡ克隆。
2.人工化学合成法
　　适于已知的核苷酸序列且校小的DNＡ片断合成,常用方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。
过程：先用以上方法合成基因ＤＮA不同部位的两条链的寡核苷短片段,再退火成为两端形成粘性末端的DNＡ双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形较长的DＮA片段,再用连接酶连接成完整的基因.
3.利用PCR技术直接扩增目的基因
PCＲ（Polｙmerａse Ｃｈaiｎ Reaｃtiｏn）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术,已知待扩增目的基因或DNＡ片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物，类似于DNA的天然复制过程,用PＣR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。
二．载体的选择与制备
1．载体的选择（以质粒为例）
⑴载体必须是复制子。
⑵具有合适的筛选标记,便于重组子的筛选。
⑶具备多克隆位点(MCS），便于外源基因插入。
⑷自身分子量较小，拷贝数高。
⑸在宿主细胞内稳定性高。
(6) 应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNＡ聚合酶所识别
(7) 应具有阻遏子，使启动子受到控制,只有当诱导时才能进行转录。
(8) 应具有很强的终止子,以便使RNＡ聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，且所产生的mRNＡ较为稳定。
(9) 所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。
2. 制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等.
目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DＮＡ分开及除去蛋白质和RNA。
在pH值12．0～1２．5范围内时,线性的ＤNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性pH值使之复性,线性染色体形成网状结构,而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有ｃccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒ＤNA.
三。构建基因表达载体
1. 用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出粘性末端。
2. 用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端.
3. 将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量ＤNA连接酶，形成了一个重组DＮA分子(重组质粒）.
四．目的基因导入受体细胞
1. 将目的基因导入植物细胞－农杆菌转化法
2. 将目的基因导入动物细胞－显微注射法
3. 将目的基因导入微生物细胞(以大肠杆菌为例）
（1）用Cａ2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞.
（2）将重组表达载体DNＡ分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DＮＡ分子，完成转化过程.
（3)目的基因在受体细胞内,随其繁殖而复制,由于细菌繁殖的速度非常快,在很短的时间内就能获得大量的目的基因.
五.目的基因的检测与鉴定
1.要检测目的基因是否插入转基因生物染色体的DＮA上
检测方法：采用ＤNA分子杂交技术
2．检测目的基因是否转录了mRＮＡ
检测方法：同样用分子杂交技术DNA与RNA杂交
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
检测方法:提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品.
　　　　 　基因工程制药实例及意义
抗生素类
传统的抗生素生产,主要利用化学合成或微生物发酵来获得，其生产过程中菌种的表达水平比较低,生产成本比较高，而且在使用过程中容易产生耐药菌群.而利用基因工程技术可以对生产菌种进行基因改造,得到表达水平高、产品目的性强的菌株，如大肠杆菌生产青霉素酞胺酶。德国一个科研小组对生产半合成青霉素的材料６AＰA．用基因工程来增强大肠杆菌的青霉素酰胺酶活性。将大肠杆菌的基因PＢR3２2的质粒克隆化所形成的菌株,其酶活力比原株提高５０倍.从而提高6ＡPA生产能力.我国王以光利用基因重组技术对螺旋霉素产生菌进行改造，增强了丙酰基转移酶的基因在螺旋霉素产生菌中的表达，并提高了丙酰螺旋霉素的产量.

１。2 基因工程的基本操作程序
【课标要求】
1.简述基因工程基本操作程序的四个步骤
2．尝试设计某一转基因生物的研制过程。
【本节重难点】
重点：基因工程基本操作程序的四个步骤
难点：（1）从基因文库中获取目的基因
　　 (2)利用PCＲ技术扩增目的基因
【学习过程】
一、基因工程的基本操作程序简述
①目的基因的；
②的构建;
③将目的基因；
④目的基因的。
二、基因工程的基本操作程序
(一)目的基因的获取
1．目的基因:主要是指的基因,也可以是一些具有作用的因子。
2.原核细胞和真核细胞的基因结构
（１)原核细胞的基因结构

（2）真核细胞的基因结构

3．目的基因的获取
目的基因可以从中分离出来，也可以用合成。
常用的方法有以下几种：
（1）从基因文库中获取目的基因
①基因组文库和部分基因文库（如ｃDＮＡ文库）

　　 　 　基因组文库 　 　　 　 cDNA文库
文库类型
cDNA文库
基因组文库
文库大小

基因中启动子

基因中内含子

基因多少

物种间的基因交流

②从基因文库中得到目的基因，可以根据一些信息，如根据基因的、
基因的、基因在染色体上的、基因的,以及基因的等特性。
（2）利用PCR技术扩增目的基因
①PCR是＿__________＿___＿__＿________＿__＿__＿＿＿技术，是的缩写。
②原理：______＿__＿＿_____＿__＿。,
③前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成__＿__＿＿__.
④条件:DNＡ模板、。
⑤扩增过程：

a．变性(℃):目的基因DＮA受热变性后接连为单链
b.退火（℃）：与单链相应互补序列结合
c．延伸（℃):在的作用下进行延伸
Taｑ酶的特点是。
PCR技术与DNA复制的比较：

PCＲ技术
ＤNＡ复制
相
同
点
原理

原料

条件

不
同
点
解旋方式

场所

酶

结果

（3)化学法直接合成
适用于基因比较,核苷酸序列又。
(二）——基因工程的核心
１。基因表达载体的构建，其目的是使目的基因在受体细胞中能，并且可以,同时，使目的基因能够.
２．基因表达载体＝+++

（1）启动子：是一段有特殊结构的,位于基因的,它是
识别和结合的部位，有了它才能驱动基因，最终获得所需要的蛋白质。
（2)终止子:也是一段有特殊结构的，位于基因的，相当于一盏红色信号灯，使在所需要的地方停止下来。
(3）标记基因：作用是为了，从而将含有目的基因的细胞出来,如基因。
３．构建基因表达载体的过程:用（同、不同）种限制酶去切目的基因与运载体，再用使其连接，形成重组DNA分子。
(三）将目的基因导入受体细胞
将目的基因受体细胞，并且在受体细胞内和的过程，称为转化.
(1）将目的基因导入植物细胞
①农杆菌转化法

②法
③法
（２)将目的基因导入动物细胞
①技术是将目的基因导入受体细胞的最有效方法.
②操作程序：将含有目的基因的表达载体→→获得→显微注射→胚胎→胚胎→发育成具有新性状的动物
（3）将目的基因导入微生物细胞
①原核生物作为基因工程受体细胞的优点：。
②大肠杆菌细胞最常用的方法:
a.用处理细胞，使细胞处于一种的生理状态，这种细胞称为细胞；
b．将分子溶于缓冲液与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收ＤNＡ分子.
(四)目的基因的检测与鉴定
（1）检测转基因生物的上是否插入了目的基因
检测方法:技术，即将转基因生物的基因组DNＡ提取出来，在含有目的基因的DNＡ片段上用放射性同位素等作标记,以此作为，使探针与基因组ＤNＡ杂交，如果出现，就表明目的基因已插入染色体DNA中。
(2）检测目的基因是否
检测方法:技术
（3）检测目的基因是否
检测方法:，从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行检测，若有出现,表明目的基因已形成蛋白质产品。
(４）进行水平的鉴定

【巩固练习】
1.下列正确表示基因操作“四部曲”的是 　 　 　 ( 　)
Ａ.提取目的基因→目的基因导入受体细胞→基因表达载体的构建→目的基因的检测和鉴定
B．目的基因的检测和鉴定→提取目的基因→基因表达载体的构建→目的基因导入受体细胞
C．提取目的基因→基因表达载体的构建→目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定
D．基因表达载体的构建→提取目的基因→目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定
２。下列不属于获得目的基因的方法的是 　 　 　 　　 　 　 （　 ）
A。利用ＤNＡ连接酶复制目的基因　 B．利用DＮＡ聚合酶复制目的基因
C．从基因文库中获取目的基因　 　　 D。利用PCR技术扩增目的基因
3。PCR技术扩增DNＡ，需要的条件是( 　 ）
①目的基因 ②ＡTP ③四种脱氧核苷酸 　④ＤNA聚合酶等 ⑤mRＮA　　⑥核糖体
A。①②③④　 B．②③④⑤ 　 Ｃ。①③④⑤　　 Ｄ．①②③⑥
4.根据ｍＲNA的信息推出获取目的基因的方法是（　 ）
Ａ．用DNA探针测出目的基因　 　 Ｂ．用mＲNA探针测出目的基因
C。用mRＮA反转录形成目的基因 　 D．用PCR技术扩增mRＮA
５。在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得该基因的最佳方法是( 　 ）
A．用mRNＡ为模板逆转录合成ＤＮＡ
Ｂ.以4种脱氧核苷酸为原料人工合成
Ｃ。由蛋白质的氨基酸序列推测mRNA
Ｄ.将供体DNＡ片段转入受体细胞中，再进一步筛选
６。下列不属于目的基因与运载体结合过程的是（ 　 )
A.用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端
B．用同种限制酶切割目的基因露出黏性末端
C．将切下的目的基因的片段插入到质粒切口处
D.将重组DNA导入受体细胞中进行扩增
7.下列哪项不是基因表达载体的组成成分（ )
A．启动子 　　B。终止密码子　 C．标记基因 　 Ｄ．复制原点
8。在基因表达载体的构建中，所需要的酶是( 　)
①限制酶 ②DNＡ连接酶 ③解旋酶 　 ④DNA聚合酶
A.①② 　 B．①②③ 　　　 　Ｃ．①②④　　 　　 D．①②③④
９.植物学家在培育抗虫棉时,对目的基因作适当修饰，使目的基因在棉花植株的整个生长发育期都表达,以防止害虫侵害,这种对目的基因所作的修饰发生在(）
A.终止子 　 Ｂ.引物 　 C．标记基因　 　　 　Ｄ.启动子
10．下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法（　 ）
Ａ。基因枪法 　 B。显微注射法 Ｃ.农杆菌转化法 　 D．花粉管通道法
11．在基因工程操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的是（ 　）
A．人工合成目的基因 　 　　 　 　B.目的基因与载体结合
C．将目的基因导入受体细胞 Ｄ。目的基因的检测与鉴定
12．将目的基因导入微生物细胞之前，要用Cａ2+处理细胞，处理过的细胞叫（　 ）
A．感受态细胞 　　B。敏感性细胞 C。吸收性细胞 Ｄ．接受细胞
13．农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞,目的基因的最终位置是（ ）
A．Ｔｉ质粒上 　B．受体细胞染色体上 C.裸露细胞核中　 D。存在细胞质中
14。目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是( 　　 ）
①检测受体细胞是否有目的基因  ②检测受体细胞是否有致病基因 　
③检测目的基因是否转录mRＮA   ④检测目的基因是否翻译蛋白质
    A．①②③   　B．②③④    C．①③④     Ｄ．①②④
15.要检测目的基因是否成功地插入了受体DNA中,需要用基因探针，基因探针是指( )
A。用于检测疾病的医疗器械
B．用放射性同位素或荧光分子等标记的ＤNA分子
C．合成β－球蛋白的DＮA
D．合成苯丙羟化酶的DNA片段
16．(多选)用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述正确的是（　 　 ）
A．常用相同的限制性核酸内切酶处理目的基因和质粒
B．ＤＮA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必须的工具酶
C。可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒
D.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达
17．（多选)我国科学家运用基因工程技术将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫棉。下列叙述正确的是( 　 ）
A.基因非编码区对于抗虫基因在棉花细胞中的表达不可缺少
B.重组DＮA分子中增加一个碱基对,可能导致毒蛋白的毒性丧失
Ｃ．抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递至近缘作物，从而造成基因污染
D．转基因棉花是否具有抗虫特性是可以通过检测棉花对抗生素抗性来确定的
18．（多选）科学家通过基因工程的方法，能使马铃薯块茎内含有人奶主要蛋白。以下有关该基因工程的叙述，正确的是 　 　 　 　　 　 ( ）
A。采用反转录的方法得到目的基因有内含子
B．基因非编码区对于目的基因在块茎中表达是不可缺少的
C。马铃薯的叶肉细胞可作为受体细胞
D．用同一种限制性内切酶,分别处理质粒和含目的基因的DNA,可产生黏性末端而形成重组DNA分子
19.资料显示，近十年来，ＰＣR技术（DNA聚合酶链式反应技术)成为分子生物实验的一种常规手段,其原理是利用DNA半保留复制的特性，在试管中进行DＮＡ的人工复制(如下图),在很短的时间内，将ＤNA扩增几百万倍甚至几十亿倍,使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答：

（1）加热至9４℃的目的是使DNA样品中的_______键断裂，该过程在生物体细胞内是通过＿_____＿___酶的作用完成的。分析可知新合成DNA分子中A=T，C=G，这说明ＤＮＡ分子的合成遵循___＿________________＿_.
(2)与细胞内DNＡ复制相比，PCR技术所需要的ＤNA聚合酶的最适温度比较_＿＿＿______＿_(高、低)。
（3)通过ＰCＲ技术使DNA分子大量复制时,若将一个用1５N标记的模板DＮA分子(第一代)放入试管中，以14Ｎ标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时,含1５N标记的DNA分子单链数占全部DNA总单链数的比例为。
（4）PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法.若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可以用PＣR扩增血液中的（ ）
A。白细胞DＮA B.病毒蛋白质 　 C．血浆抗体 D.病毒核酸
20.下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，请回答下列问题:

（1)一个图１所示的质粒经ＳmaⅠ切割前后，分别含有个游离的磷酸基团。
（2）若对图中质粒进行改造，插入的SｍaⅠ酶切位点越多，其热稳定性越.
（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SｍaⅠ切割，原因是
。
（4）与只使用EcoＲ I相比较,使用BamＨ Ⅰ和Ｈind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止。
（５）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入酶。
(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了。
(7）为了从ｃDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因,将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体,然后在的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。
1．2 　基因工程的基本操作程序答案
ＣAAＣB ＤBＡDB ＣABCB AＣD ＡBC 　ＢCＤ
19(1）氢 解旋 　 碱基互补配对原则 　 （2）高 (３）1／1６ （4） D
20（１）0、2
（2）高
（3）SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源ＤNA中的目的基因
（4）质粒和含目的基因的外源DＮA片段自身环化
(５）ＤNA连接
（6)鉴别和筛选含有目的基因的细胞
（7）蔗糖为唯一含碳营养物质

定义:按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造,将一种生物（供体)的基因转移到另外一种生物（受体)中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
基本步骤：(分、切、接、转、增、检)
Ø 施工材料的准备：目的基因、载体、工具酶和受体细胞（宿主）的准备。用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。
Ø 目的基因与载体DNA的体外重组,形成重组DNA分子。

基因工程原理
内容提要
1. 基因工程又称基因操作、重组DNＡ技术， 是P. Ｂerg等于１9７2年创建的。基因工程技术涉及的基本过程包括“切、连、转、选”.该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达.　
2. 基因工程中使用多种工具酶,包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类。　
3. 限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶,属于水解酶类。根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为三大类.Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小,专一性强,切割的方式有平切和交错切， 作用时需要Mg＋＋作辅助因子,　但不需要ATP和SAM。第一个被分离的Ⅱ类酶是Hｉnd　Ⅱ。　
4. 连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶,有DNA连接酶和RＮA连接酶之分。基因工程中使用的连接酶来自于原核生物,有两种类型的ＤNA连接酶∶E．coｌiDNＡ连接酶和Ｔ4－ＤNA连接酶。基因工程中使用的主要是T4DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染的E．cｏli中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。
5. 载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒ＤNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。
6. DＮA重组连接的方法大致分为四种： 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法.粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法，是指具有相同粘性末端的两个双链ＤNA分子在DNＡ连接酶的作用下,　连接成为一个杂合双链DNA。平末端连接是指在T４ DNA连接酶的作用下,　将两个具有平末端的双链ＤNA分子连接成杂种DNA分子。同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端， 外源DＮA和载体DＮA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dＡ（dG）和dT(ｄC）, 然后在ＤNA连接酶的作用下， 连接成为重组的DＮA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段， 但方法较繁， 需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用。将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶的识别序列)， 加到载体或外源ＤNA的分子上，　然后通过酶切制造黏性末端的方法称为接头连接法。
7. 基因文库分为基因组文库、cDNA文库等,是指在一种载体群体中,　随机地收集着某一生物DNA的各种克隆片段，　理想地包含着该物种的全部遗传信息。
8. DNA重组分子在体外构建完成后,必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组ＤＮA分子的转化。目前常用的诱导感受态转化的方法是ＣａCl２ 法(图３－20），此外也可以用基因枪等方法转化外源ＤＮA。
9. 重组体筛选有遗传学方法、核酸杂交筛选法等.
10. 基因工程技术是现代生物技术的核心，目前在工业、农业和医疗中已经显示了巨大的应用前景,并形成了一大批生物技术产业.

基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因（DNA分子)，按预先设计的蓝图,在体外构建杂种ＤＮA分子,然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品;或是研究基因的结构和功能，揭示生命活动规律。 基因工程技术诞生于２0世纪７０年代初，它是一门崭新的生物技术科学，它的创立和发展使生命科学产生了一次重大飞跃,证明并实现了基因的可操作性，使人类从简单地利用天然生物资源走向定向改造和创造具有新品质的生物资源的时代. 基因工程技术诞生至今已经取得了辉煌的成就，成为当今生命科学研究领域中最有生命力和最引人注目的前沿学科之一,基因工程也是当今新的产业革命的一个重要组成部分。
第一节 基因工程技术的诞生
基因工程又称基因操作（geｎe mａniｐｕlatｉｏn），　重组DＮA（rｅcomｂinａnt DNＡ）技术，　是70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。
一、基因工程技术的诞生
1972年，P.。　Berg等在PＮAS上发表了题为∶“将新的遗传信息插入SV40病毒DNA的生物化学方法: 含有λ噬菌体基因和　E.cｏli 半乳糖操纵子的环状 SV４0DＮＡ”，标志着基因工程技术的诞生。 ＳV40病毒是猿猴病毒,是一种直径为４50的球形病毒,分子量为２8×１06道尔顿。ＳV40的DNA是环状双链结构，全长５24３个碱基对，编码三个衣壳蛋白VＰ1、VP2、VP3和一个T抗原。SＶ40DNA上有一个限制性内切酶Ｅ.cｏRⅠ的切点. Berｇ等首先用化学方法构建了一个二聚体的环状SV40DNA（图３—１）。

图３—1 重组的SV４0二聚体的构建（引自 Berg　et. aｌ，1972）
当时所用的连接方法是同聚物谱尾法，重组体的鉴定主要是通过电子显微镜比较分子量大小. 当获得二聚体SV40DNA后,Ｂerｇ等就证明了环状DNＡ被内切酶切成线性DNA后能够重新环化，并且能够同另外的分子重组。于是他们进行第二步的实验就是从　λｄvgal　DＮＡ中制备含有 E．coli 的半乳糖操纵子DNＡ，用上述同样的方法进行重组连接，并获得成功. Bｅｒg等的工作是人类第一次在体外给遗传物质动手术，标志着一个新时代的到来,为此他获得了１98０年诺贝尔化学奖.
二、基因操作的基本过程　和特点
基因工程的操作可用图3-2表示∶

图３-２ 基因工程的基本过程（引自Oｌd ＆ Primrｏse,1９80）
它所涉及的过程可用“分（合成)、 切、连、转、选、鉴”六个字表示。
分(合成)∶指DNA的制备，包括从生物体中分离或人工合成。分离制备或合成制备DNA的方法都有很多种。
切∶即在体外将DＮA进行切割,使之片段化或线性化。　
连∶即在体外将不同来源的ＤNA分子重新连接起来,构建重组ＤNA分子.　
转∶即将重组连接的DＮA分子通过一定的方法重新送入或细胞中进行扩增和表达.
选∶从转化的全群体中将所需要的目的克隆挑选出来；
鉴∶就是进行对筛选出来的重组体进行鉴定,因为有些重组体并非是所需要的,必需通过分析鉴定.　
基因工程有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。遗传重组是生物进化的推动力，自然界中发生的遗传重组主要是靠有性生殖。基因工程技术的诞生使人们能够在试管里进行分子水平上的操作,构建在生物体内难以进行的重组,然后将重组的遗传物质引入相应的宿主细胞,让其在宿主细胞中进行工作。这实际上是进行无性繁殖,即克隆，所以基因工程通常有称为基因克隆。

第二节　限制性内切核酸酶
外科医生给患者动手术需要手术刀，基因工程师们给ＤＮA分子(基因)动手术需要分子手术刀，这就是工具酶。基因工程中使用的工具酶很多,包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DＮA合成与修饰的酶类，最重要的是限制性内切核酸酶。基因工程上把那些具有识别双链DＮA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割ＤNＡ双链结构的核酸内切酶统称为限制性内切核酸酶。
一、限制性内切核酸酶的发现
1９5２年Luria、Human在T偶数噬菌体、１９５3年ｗｅigle、Bertanｉ在　λ　噬菌体对大肠杆菌的感染实验中发现了细菌的限制和修饰现象。正是对限制和修饰现象的深入研究,导致限制性内切核酸酶的发现。
噬菌体在某一特定细菌宿主中生长的能力,取决于它最终在其中繁殖的细菌是什么菌株。 例如,将A噬菌体从一株大肠杆菌转移到另外一株，其生长效率往往会削弱，对这两个菌株的滴　定度可差好几个数量级。第二个菌株释放的噬菌体能百分之百再感染同类菌株，但是若先将它们感染原来的宿主菌,再将释放的子代噬菌体重新感染第二个菌株时,感染率要大大下降。此种现象即为宿主控制的限制作用（host-Contrｏllｅd ｒestrictioｎ）。
用放射性同位素标记的噬菌体进行的实验结果表明，在受感染的宿主细胞中,噬菌体生长的限制伴有噬菌体DNA的迅速降解，然而，用作繁殖噬菌体的感染宿主菌株并不导致类似的噬菌体DNＡ的降解.如果某一细菌细胞具有一种能选择性降解来自侵染病毒（或其他来源)的核酸酶，那么，它必须能将这种外来DNA同它自己的DNA区分开来,之所以能够如此，乃是通过稍 为宿主控制的修饰作用（ｈoｓｔ—cｏnｔrolｌed moｄificatiｏｎ）。　
因此，限制（resｔrictiｏn)作用是指细菌的限制性核酸酶对DNＡ的分解作用，限制一般是指对外源DNA侵入的限制.修饰(modiｆiｃatｉon）作用是指细菌的修饰酶对于DNA碱基结构改变的作用（如甲基化),经修饰酶作用后的DNA可免遭其自身所具有的限制酶的分解。
到20世纪60年代中期，科学家推测细菌中有限制－修饰系统(restｒictioｎ—ｍｏdifｉｃatioｎ　systｅm。 Ｒ—M　syｓｔem)。该系统中有作用于同一DＮA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变DＮA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，而且，这两种酶作用于同一DNA的相同部位。一般说来，不同种的细菌或不同种的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制—修饰系统。　
1968年，Meseｌｓon从E．colｉ Ｋ株中分离出了第一个限制酶EcoK，同年Ｌｉnn和Aeber从 E。cｏli B株中分离到限制酶ＥcｏB.遗憾的是，由于EcoK和ＥcoB这两种酶的识别和切割位点不够专一,在基因工程中意义不大。
１970年,Sｍitｈ和Wiｌcｏｘ从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶，能够特异性地切割　DNＡ，这个酶后来命名为HｉnｄⅡ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶.由于这类酶的识别序列和切割位点特异性很强，对于分离特定的DＮＡ片段就具有特别的意义.
二、限制性内切核酸酶的命名和分类
（一)限制性内切核酸酶的命名
按照国际命名法,限制性内切核酸酶属于水解酶类。由于限制性酶的数量众多,而且越来越多,并且在同一种菌中发现几种酶。为了避免混淆，1973年Ｓmｉtｈ 和Nａthaｎs对内切酶的命名提出建议,1９８0年，Ｒobｅｒｔs对限制性酶的命名进行分类和系统化。
限制性酶采用三字母的命名原则，即属名 + 种名　+ 株名的个一个首字母，再加上序号,将限制性内切核酸酶的命名要点列于表3-１。

表3—1 限制性内切核酸酶的命名要点
条目
要点
基本原则
３—4个字母组成, 方式是：属名+种名+株名+序号
首字母
取属名的第一个字母， 且大写
第二字母
取种名的第一个字母， 小写
第三字母
①取种名的第二个字母,　小写;　②若种名有词头, 且已命名过内切酶， 则取词头后的第一字母代替
第四字母
若有株名, 株名则作为第四字母, 是否大小写, 根据原来的情况而定
顺序号
若在同一菌株中分离了几个限制性内切核酸酶， 则按先后顺序冠以Ｉ、ＩＩ、IＩI,....。等
如： EcｏＫ： Ｅsｃherichia coli    Ｋ （大肠杆菌K株）
（二)　限制性内切核酸酶的分类
限制性内切核酸酶的作用特点，将它们分为三大类。
１. I类限制性内切核酸酶
I类限制性内切核酸酶的分子量较大， 一般在３0万道尔顿以上， 通常由三个不同的亚基所组成。例如限制性酶EcoB是由R（135kD),M(6２ｋD）和S（55ｋD)三种亚基组成的复合酶,这三个亚基分别由不同的基因编码。全酶的总分子量为4４9ｋＤ,共5个亚基，其中Ｒ亚基和M亚基各两分子。 Ⅰ类酶不仅是一种核酸内切酶, 同时在酶分子上还具有甲基化酶和ATPａse的活性，所以是具有多种酶活性的复合酶类.作用时除了需要Mg++作辅助因子外， 还要求ATP和Ｓ腺苷甲硫氨酸（ＳAＭ）的存在。Ⅰ类酶具有特异的识别序列，大约１5个碱基对。
Ⅰ类酶虽然能够在一定序列上识别ＤＮA分子， 并能同DＮA分子作用， 因其识别DＮA后,　要朝一个方向或两个方向移动一段距离(通常为10０0个碱基左右），并且要形成一个环才能切割DNA(图３—3)， 所以识别位点和切割位点不一致,产生的片段较大.　

图3－３ I类酶的作用方式 （引自Lｅwin，1９97)
２．　Ⅲ类限制性内切核酸酶
Ⅲ类限制性内切核酸酶也是基因工程中不常用的酶，分子量和亚基组成类似于Ⅰ类酶, 作用方式基本同Ⅱ类酶。如EcoＰ1是由两个亚基组成，一个亚基（Ｍ亚基）负责位点识别和修饰。另一个亚基(Ｒ亚基)具有核酸酶的活性(图３—5)。切割DＮA时需要ATＰ,Mg2+,也能被ＳAM激活,但并非必需。

图3-４　Ⅲ类限制性内切核酸酶（引自Ｌewin,1997)
3。 Ⅱ类限制性内切核酸酶
这类酶的分子量较小. 一般在2—４万道尔顿， 通常由2—４个相同的亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA, 极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNＡ, 或DNA/RNA杂种双链。这类酶的专一性强, 它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求， 而且对更远的碱基也有要求，　因此, Ⅱ类酶既具有切割位点的专一性， 也具有识别位点的专一性， 一般在识别序列内切割.切割的方式有平切和交错切， 产生平末端的ＤＮＡ片段或具有突出粘性末端的DNＡ片段（５'或３’粘性末端).作用时需要Mg+＋作辅助因子， 但不需要AＴＰ和SAM.Ⅱ类酶与对应的甲基化酶在蛋白亚基上尚未发现有什么关系， 第一个被分离的Ⅱ类酶是Hiｎd　Ⅱ。
三。 Ⅱ类限制性内切核酸酶的性质
1。 识别序列的特异性
在３类限制性内切核酸酶中，Ⅱ类限制性内切核酸酶的特异性最强。
大多数Ⅱ类限制性内切核酸酶识别的序列是回文序列。如ＢamHＩ和BglI都是识别六个碱基的ＤNA序列(图3—5）,都是完全的回文序列。这段序列有两个基本的特征,第一是能够中在间划一个对称轴,两侧的序列两两对称互补配对，第二个特点是两条互补链的5'到3'的序列组成相同，即将一条链旋转180０，则两条链重叠。

图３—5 Ⅱ类限制性内切核酸酶识别的回文序列(引自D．Ｖoet ＆　Voｔｅ J．G.1995)
2．　限制性内切核酸酶的切割频率与速度
切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNA分子中预测的切点数。由于ＤNA是由四种类型的单核苷酸组成，假定DＮA的碱基组成是均以的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的,那么对于任何一种限制性内切核酸酶的切割频率,理论上应为１/４ｎ，n表示该限制性内切核酸酶识别的碱基数。如识别4个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每256个碱基有一个识别序列和切点（１/44=1/2５６)，识别5个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每1０24个碱基有一个识别序列和切点，余下类推。
实际上因DＮA的分布是不均一的,且有大量的重复序列,加上内切酶的切点具有GC倾向，所以实际的频率偏低.如同是识别6个碱基的限制性内切核酸酶，切割的频率相差很大∶EcoRI 4０00；BaｍＨI：6０00；SalI:8０00;HpａＩI:200.　
根据限制性内切酶切割DNA所产生的产物末端,发现限制性内切酶对DNA的切割有两种方式,即平切和交错切。所谓平切，就是限制性内切酶在DNA双链的相同位置切割DNＡ分子,这样产生的末端就是平末端.交错切就是限制性内切酶在DNA双链的不同位置切割DNＡ，产生的ＤNA片段的末端不是平齐的(图３—６）。

图3-６　平末端与黏性末端（Ｈarｔl,1991）
Ⅱ类限制性内切酶的切割产物有平末端和粘性末端(ｃohesive end)。粘性末端是指DＮＡ分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分, 这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对，　形成双链.并在DNA连接酶的作用下,　使同一DNA分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子.不同限制性内切酶切割DNＡ产生的三种不同类型的末端（表3－３）.
表 3-3 某些限制性内切酶及产生的末端
５'-粘性末端
3’粘性末端
平末端
酶
识别序列
酶
识别序列
酶
识别序列
Taq Ｉ
T/CＧA
Ｐｓt　I
CTGCA／G
Ａlu　I
ＡG/CT
Ｃlａ　I
AT/CGAT
Sac I
GＡGCT/C
FnuDⅡ
CG/CＧ
Mbo I
／ＧATＣ
Spｈ I
GＣATG/C
Ｄpn I
ＧＡ／TＣ
BglⅡ
A/GＡTCＴ
Bｄe I
ＧＧCGC/C
ＨaeⅢ
GG/CC
BaｍHＩ
G/GAＴCＣ
Apa Ｉ
ＧGGCC/C
Pvu　Ⅱ
CAG/CＴG