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基因工程的基本操作程序 学案【实用文档】doc
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课题 １．2 基因工程的基本操作程序
学习目标:简述基因工程的原理和技术。
　 理解基因操作的工具和基本程序及应用。
学习重点和难点:
重点:提取目的基因的方法。
难点:目的基因导入受体细胞的途径.
自学测评：
基因工程的基本操作程序主要包括4个步骤：①目的基因的;
②的构建；
③将目的基因;
④目的基因的.
一、目的基因的获取：
１、目的基因：符合人们需要的，编码蛋白质的.
２。获取目的基因的方法
(1)从基因文库中获取目的基因
① 基因文库：将含有某种生物不同基因的许多,导人受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因组文库:含有一种生物的基因
② 种类
cDNA文库:含有一种生物的基因
③　目的基因的获取
根据基因的有关信息:基因的序列、基因在上的位置、基因的产物mRNＡ、基因的产物蛋白质等特性获取目的基因。
（2）利用PＣR技术扩增目的基因.
①　ＰCR:是一项在生物体外特定DNA片段的核酸合成技术.
② 过程：目的基因DＮA受热形成，与结合，然后在ﻩ＿＿＿_的作用下进行延伸形成DＮA。
③方式：指数扩增= (n为扩增循环的次数）
(3）化学方法人工合成：基因较,核苷酸序列。
二、基因表达载体的构建
1、表达载体的组成:目的基因+++标记基因+。
2、启动子:位于基因的，它是结合的部位，驱动基因转录产生mRNA。
3、终止子:位于基因的，终止。
４、标记基因:受体细胞是否含有目的基因。
5、表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且给下一代；使目的基因 ﻩ_＿__和发挥作用。
6、不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法，基因表达载体的构建上也会有所差别。
三、将目的基因导入受体细胞
(一）转化:目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和的过程。
(二)方法
１、将目的基因导入植物细胞
(1）农杆菌转化法
①　农杆菌特点：易感染植物和裸子植物，对______＿____植物没有感染力；Ti质粒的可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。
② 转化：目的基因插人农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达.
（２）基因枪法：是植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。
（３)花粉管通道法
２.将目的基因导入动物细胞
(1）方法：。
（２)操作程序：目的基因表达载体→取→显微注射→注射了目的基因的受精卵移植到____性动物的 _＿______＿内发育→新性状动物。
3。将目的基因导人微生物细胞
(1）原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
（２）转化：处理细胞→细胞→表达载体与感受态细胞混合→　_＿＿细胞吸收ＤNA分子。
四、目的基因的检测与鉴定
类型
步骤
检测内容
方法
结果显示
水平检测
第一步
目的基因是否进入受体细胞

是否成功显示出杂交带
第二步
目的基因是否转录出mRＮA

是否成功显示出杂交带
第三步
目的基因是否翻译出蛋白质

是否成功显示出杂交带

水平鉴定

合作探究、精讲点拨:
探究一目的基因的获取
１、基因文库

文库文库2.原核细胞和真核细胞的基因结构 
（1)原核细胞的基因结构

（2）真核细胞的基因结构

3.PCR技术
　 原理:
前提：一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成
条件:、、、、
过程：
a．变性（℃）：目的基因DNＡ受热变性后接连为单链
ｂ．退火(℃）：与单链相应互补序列结合
c．延伸（℃）：在的作用下进行延伸
Taq酶的特点是.
PCR扩增技术与DNA复制的比较

PCR技术
DNＡ复制
相同点
原理
DＮA复制(碱基互补配对）
不
同
点
解旋方式
DNA在条件下变性解旋
催化
场所
复制（ＰCR扩增仪）
主要在内
酶
酶
细胞内含有的
能量

结果
在短时间内形成大量的
形成整个
 探究二 基因表达载体的构建
用一定的_＿_＿＿___＿切割质粒，使其出现一个切口,露出__＿______＿＿_.用__＿__＿_______切断目的基因，使其产生_＿______＿_____＿＿。将切下的目的基因片段插入质粒的__＿_＿_处,再加入适量__＿_＿_＿_＿__，形成了一个重组DNA分子（重组质粒)

探究三 目的基因导入受体细胞－--转化
细胞类型
常用方法
转化过程
植物细胞

将目的基因插入Ti质粒的T—DNＡ上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNＡ上→表达
动物细胞

将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植→发育成为具有新性状的动物
微生物

用Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合 →感受态细胞吸收DNA分子

探究四 目的基因的检测与鉴定——检查是否成功
问题１: 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？

问题2．试分析真核生物的基因导入细菌细胞后，不能正常发挥功效的可能原因有哪些？

拓展提高、达标测评：
1.下列正确表示基因操作“四部曲”的是　 　 　 　　 　 （ 　）
A.提取目的基因→目的基因导入受体细胞→基因表达载体的构建→目的基因的检测和鉴定
Ｂ。目的基因的检测和鉴定→提取目的基因→基因表达载体的构建→目的基因导入受体细胞
C.提取目的基因→基因表达载体的构建→目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定
D．基因表达载体的构建→提取目的基因→目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定
２．下列不属于获得目的基因的方法的是 　 　　 　　　 (　 ）
A．利用DNA连接酶复制目的基因 　 Ｂ．利用ＤNA聚合酶复制目的基因
C．从基因文库中获取目的基因 　 　　 D．利用PＣＲ技术扩增目的基因
３。ＰCＲ技术扩增DＮA，需要的条件是 　 　 　 　 　（ )
①目的基因 　②高温 ③四种脱氧核苷酸　 ④DＮA聚合酶等 　⑤mRNＡ 　⑥核糖体
A．①②③④ 　　B．②③④⑤ C.①③④⑤　　　 Ｄ。①②③⑥
4．根据mRＮＡ的信息推出获取目的基因的方法是 　 　 　　 　 （　 )
A．用DNA探针测出目的基因　 　 B．用mRNA探针测出目的基因
C．用mRNＡ反转录形成目的基因 D．用PCR技术扩增mＲNA
5．在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得该基因的最佳方法是（ 　 ）
A.用mRNＡ为模板逆转录合成DNＡ
B．以4种脱氧核苷酸为原料人工合成
C。由蛋白质的氨基酸序列推测ｍRNＡ　
D.将供体ＤNＡ片段转入受体细胞中，再进一步筛选
６、在基因工程中,把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是４6０个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（ )
A.540个 B.８10０个ﻩ 　C．1728０个 D.７56０个
7.下列不属于目的基因与运载体结合过程的是 　　 　 　 （ )
A.用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端
B。用同种限制酶切割目的基因露出黏性末端
C.将切下的目的基因的片段插入到质粒切口处
D.将重组ＤNＡ导入受体细胞中进行扩增
８．下列哪项不是基因表达载体的组成成分 　　 　 　　　　 　　 　 （ ）
A.启动子　　　 B.终止密码子 　 C．标记基因 　Ｄ。复制原点
9.在基因表达载体的构建中，所需要的酶是 　　 　 　 ( 　 )
①限制酶 ②DNA连接酶 ③解旋酶 ④DNA聚合酶
A．①② 　　 　B．①②③　　 　 Ｃ。①②④　 　 Ｄ．①②③④
1０．植物学家在培育抗虫棉时，对目的基因作适当修饰，使目的基因在棉花植株的整个生长发育期都表达,以防止害虫侵害，这种对目的基因所作的修饰发生在（）
A．终止子 　 B．引物 C.标记基因 D。启动子
11。下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法 　 　　　 （ 　 ）
A．基因枪法 B．显微注射法 Ｃ.农杆菌转化法　 Ｄ．花粉管通道法
1２．在基因工程操作的基本步骤中,不进行碱基互补配对的是 　 　　 （　 　 ）
Ａ．人工合成目的基因 　 　 B．目的基因与载体结合
Ｃ。将目的基因导入受体细胞 Ｄ．目的基因的检测与鉴定
13。将目的基因导入微生物细胞之前,要用Cａ2+处理细胞,处理过的细胞叫（　 　）
Ａ.感受态细胞 Ｂ．敏感性细胞 C.吸收性细胞 D.接受细胞
14。农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞，目的基因的最终位置是 　 （ 　 ）
A．Ti质粒上　 B。受体细胞染色体上　 C。裸露细胞核中 Ｄ．存在细胞质中
15.目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是 　 （ 　　 )
①检测受体细胞是否有目的基因 　②检测受体细胞是否有致病基因 
③检测目的基因是否转录mRＮA   ④检测目的基因是否翻译蛋白质
   　A。①②③    B.②③④    Ｃ．①③④     Ｄ.①②④
１6．要检测目的基因是否成功地插入了受体ＤNＡ中，需要用基因探针，基因探针是指 　 　 　　 ( 　）
A.用于检测疾病的医疗器械
B。用放射性同位素或荧光分子等标记的目的基因
Ｃ.合成β—球蛋白的DＮA
D。合成苯丙羟化酶的DNA片段
17.（多选）用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质.下列叙述正确的是（ 　 ）
A．常用相同的限制性核酸内切酶处理目的基因和质粒
B.DNＡ连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必须的工具酶
C．可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒
D.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达
1８.（多选）我国科学家运用基因工程技术将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达,培育出了抗虫棉。下列叙述正确的是 　 　 　 （　 ）
Ａ．基因非编码区对于抗虫基因在棉花细胞中的表达不可缺少
B.重组DNA分子中增加一个碱基对，可能导致毒蛋白的毒性丧失
Ｃ.抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递至近缘作物，从而造成基因污染
D。转基因棉花是否具有抗虫特性是可以通过检测棉花对抗生素抗性来确定的
19。（多选）科学家通过基因工程的方法,能使马铃薯块茎内含有人奶主要蛋白。以下有关该基因工程的叙述，正确的是 　 　 　 　 　 　 　 　 ( 　　)　
A.采用反转录的方法得到目的基因有内含子
B．基因非编码区对于目的基因在块茎中表达是不可缺少的
C．马铃薯的叶肉细胞可作为受体细胞
D.用同一种限制性内切酶，分别处理质粒和含目的基因的ＤNA,可产生黏性末端而形成重组DＮA分子
2０．人体受到病毒刺激后可以产生干扰素。干扰素分为α．β．γ三类。１９80年生物学家成功地破译了α干扰素的全部遗传信息.并运用插入质粒的方法．用大肠杆菌生产。得到的干扰素可以用于治疗肝炎和肿瘤．回答下列问题:
（1)上述材料中涉及到的现代生物技术有.
（2)人体中能合成干扰素的细胞是,合成的场所是细胞中的。　（3）在利用大肠杆菌生产干扰素过程中，目的基因是，所用的运载体是
(4)目的基因在大肠杆菌中表达时必须经过和过程。

21．资料显示，近十年来，PCR技术（DNA聚合酶链式反应技术）成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DＮA半保留复制的特性，在试管中进行DNA的人工复制（如下图)，在很短的时间内，将DNＡ扩增几百万倍甚至几十亿倍,使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答：

(1)加热至9４℃的目的是使DNA样品中的_＿___＿_键断裂，该过程在生物体细胞内是通过__＿＿＿_____酶的作用完成的。分析可知新合成DＮＡ分子中Ａ＝T，C＝G，这说明DNA分子的合成遵循_＿_＿____＿___________＿＿.
（2）与细胞内ＤNＡ复制相比,PCR技术所需要的ＤＮＡ聚合酶的最适温度比较__＿____＿__＿＿(高、低）.
（3）通过PＣR技术使ＤNA分子大量复制时,若将一个用15N标记的模板DNA分子(第一代)放入试管中，以1４Ｎ标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含15N标记的DNA分子单链数占全部DＮA总单链数的比例为。
（４）PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可以用PCR扩增血液中的（　 ）
Ａ．白细胞DNA B.病毒蛋白质　　 C。血浆抗体 D。病毒核酸
２2.下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，请回答下列问题:

（1）一个图1所示的质粒经SmaⅠ切割前后，分别含有个游离的磷酸基团。
(2）若对图中质粒进行改造，插入的ＳｍaⅠ酶切位点越多，其热稳定性越。
（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmａⅠ切割,原因是
。
（4)与只使用EcoR I相比较，使用BamH Ⅰ和Ｈｉnd　Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源ＤNA的优点在于可以防止。
（5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入酶。
（6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了.
（7）为了从ｃDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体,然后在的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。
基因工程基本过程
基因工程（genetic ｅngiｎeering）,也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖(称之为＂克隆”)和行使正常功能(称之为＂表达”）,从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来,基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的ＤNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制,继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子,或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物.
常用的工具酶
限制性内切酶—主要用于DＮＡ分子的特异切割　
ＤNA甲基化酶-用于DNＡ分子的甲基化
核酸连接酶-用于DNＡ和RNＡ的连接
核酸聚合酶—用于DＮA和RNＡ的合成
核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割　
核酸末端修饰酶-用于DNA和RNA的末端修饰　
其它酶类——用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
主要过程有为四步：
一． 获得目的基因
有多种方法可获得目得基因
1. 构建cDＮＡ文库分离目的基因
过程：
（1） 从真核细胞中提取mRNＡ，以其为模板，在反转录酶的作用下合成cＤNＡ的第一条链。
（2） 以第一条链为模板,以反转录酶或DＮA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二条链。
（3） 在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。
（4） 接头或衔接子连接。
（5） 凝胶过滤分离cDNA。
（6） 通过核酸探针法或免疫反应法从cＤNA文库中分离特异cDNＡ克隆。
2.人工化学合成法
　　适于已知的核苷酸序列且校小的DNＡ片断合成,常用方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。
过程：先用以上方法合成基因ＤＮA不同部位的两条链的寡核苷短片段,再退火成为两端形成粘性末端的DNＡ双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形较长的DＮA片段,再用连接酶连接成完整的基因.
3.利用PCR技术直接扩增目的基因
PCＲ（Polｙmerａse Ｃｈaiｎ Reaｃtiｏn）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术,已知待扩增目的基因或DNＡ片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物，类似于DNA的天然复制过程,用PＣR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。
二．载体的选择与制备
1．载体的选择（以质粒为例）
⑴载体必须是复制子。
⑵具有合适的筛选标记,便于重组子的筛选。
⑶具备多克隆位点(MCS），便于外源基因插入。
⑷自身分子量较小，拷贝数高。
⑸在宿主细胞内稳定性高。
(6) 应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNＡ聚合酶所识别
(7) 应具有阻遏子，使启动子受到控制,只有当诱导时才能进行转录。
(8) 应具有很强的终止子,以便使RNＡ聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，且所产生的mRNＡ较为稳定。
(9) 所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。
2. 制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等.
目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DＮＡ分开及除去蛋白质和RNA。
在pH值12．0～1２．5范围内时,线性的ＤNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性pH值使之复性,线性染色体形成网状结构,而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有ｃccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒ＤNA.
三。构建基因表达载体
1. 用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出粘性末端。
2. 用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端.
3. 将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量ＤNA连接酶，形成了一个重组DＮA分子(重组质粒）.
四．目的基因导入受体细胞
1. 将目的基因导入植物细胞－农杆菌转化法
2. 将目的基因导入动物细胞－显微注射法
3. 将目的基因导入微生物细胞(以大肠杆菌为例）
（1）用Cａ2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞.
（2）将重组表达载体DNＡ分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DＮＡ分子，完成转化过程.
（3)目的基因在受体细胞内,随其繁殖而复制,由于细菌繁殖的速度非常快,在很短的时间内就能获得大量的目的基因.
五.目的基因的检测与鉴定
1.要检测目的基因是否插入转基因生物染色体的DＮA上
检测方法：采用ＤNA分子杂交技术
2．检测目的基因是否转录了mRＮＡ
检测方法：同样用分子杂交技术DNA与RNA杂交
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
检测方法:提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品.
　　　　 　基因工程制药实例及意义
抗生素类
传统的抗生素生产,主要利用化学合成或微生物发酵来获得，其生产过程中菌种的表达水平比较低,生产成本比较高，而且在使用过程中容易产生耐药菌群.而利用基因工程技术可以对生产菌种进行基因改造,得到表达水平高、产品目的性强的菌株，如大肠杆菌生产青霉素酞胺酶。德国一个科研小组对生产半合成青霉素的材料６AＰA．用基因工程来增强大肠杆菌的青霉素酰胺酶活性。将大肠杆菌的基因PＢR3２2的质粒克隆化所形成的菌株,其酶活力比原株提高５０倍.从而提高6ＡPA生产能力.我国王以光利用基因重组技术对螺旋霉素产生菌进行改造，增强了丙酰基转移酶的基因在螺旋霉素产生菌中的表达，并提高了丙酰螺旋霉素的产量.

专题五遗传的分子基础
时间　 201８-2-24
第二部分 基因工程
一、考纲要求:
1、基因工程的诞生（Ⅰ）
２、基因工程的原理及技术（含ＰCR技术)(Ⅱ)
3、基因工程的应用（Ⅱ)
4、蛋白质工程（Ⅰ）
二、知识网络：

三、课本填空:
【基因工程的概念】
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNＡ重组和转基因技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品.基因工程是在DNＡ分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNＡ重组技术.
基因工程的原理是
(一）基因工程的基本工具：限制酶、DNA连接酶、载体
1.“分子手术刀”—-限制性核酸内切酶(简称为限制酶）
(１）来源:主要是从中分离纯化出来的。（真核生物中也有,如:酵母菌）
(2）功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的断开，因此具有专一性.
　 　　　 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数也有4、5、8个组成。
（３)结果：经限制酶切割产生的ＤＮＡ片段末端通常有两种形式:和。
２。“分子缝合针”-—ＤＮA连接酶
（１)两种DNＡ连接酶（DＮA连接酶和ＤＮA连接酶）的比较:
①相同点:都缝合磷酸二酯键.
②不同点：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌,只能将双链DNA片段互补的 末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DＮA连接酶来源于Ｔ4噬菌体，能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
（２）与DNA聚合酶作用的异同:
DNＡ聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DＮＡ片段的末端，形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体
（１)载体具备的条件:①能在受体细胞中,或整合到染色体DＮA上，随染色体ＤNA进行同步复制。
②具有一至多个,供外源ＤNA片段插入.
③具有,供重组DＮA的鉴定和选择。（注意：标记基因不一定都是抗性基因)
(２）最常用的载体是，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链状DNＡ分子。（天然质粒常需进行人工改造）
（３）其它载体：　 、

(二)基因工程的基本操作程序：
基因工程的操作程序主要包括四个步骤：、
、、

第一步:目的基因的获取
1.目的基因主要是指： 编码的结构基因 。也可以是一些具有.
２.目的基因可以从已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成.原核基因常采取直接分离获得，真核基因常采用人工合成。
３．目前常用的获取目的基因的方法有以下几种：
⑴从基因文库中获取目的基因:
基因文库分为文库（含一种生物的所有基因）和文库（含一种生物的一部分基因，如：ｃDNA文库)
⑵PＣR技术扩增目的基因
①原理：
②过程:第一步:加热至90~95℃DNA解链；(高温变性)
第二步：冷却到５5～6０℃，引物结合到互补DNA链;（低温退火)
第三步：加热至70～75℃，热稳定DＮＡ聚合酶从引物起始互补链的合成。（室温延伸）
⑶此外，如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过ＤNA合成仪用方法直接人工合成。
第二步:基因表达载体的构建
1．目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。
2。组成：五部分
（1)启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。使转录在所需要的地方停止下来。
（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因.
第三步：将目的基因导入受体细胞
１。转化的概念：
是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2．常用的转化方法：
⑴将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是 ，其次还有
和 等。
总结：农杆菌转化法中常考点:
①农杆菌在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能
力，如:不能感染玉米、小麦、水稻等单子叶植物。
　②当植物体受到损伤时，伤口处的细胞分泌，吸引土壤农杆菌。
　 ③农杆菌中的Ti质粒上可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNＡ上，因此通过转化作用，目的基因就可以进入植物细胞,并整合到染色体DNＡ上。
⑵将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是　。此方法的受体细胞多是 。
⑶将目的基因导入微生物细胞:原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖、多为单细胞、遗传物质相对　，最常用的原核细胞是 大肠杆菌　，其转化方法是:先用　处理细胞，使其成为　 细胞 ，再将 重组表达载体ＤNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成过程。
第四步：目的基因的检测和表达
1.首先要检测 转基因生物的染色体ＤＮA上是否插入了目的基因，方法是采用　
技术。
2．其次还要检测　目的基因是否转录出了ｍRNＡ，方法是采用技术 （即用标记的目的基因作探针与　ｍRNA杂交,如果显示出杂交带，就表明目的基因转录出了ｍRNA）。
3．最后检测　目的基因是否翻译成蛋白质,方法是.（即从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的　抗体进行抗原抗体杂交)。
4．除了上述的分子检测外，有时还需进行　水平的鉴定.（如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状,需要做实验)。
(三)基因工程的应用
1．植物基因工程:抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。
2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物(如：乳腺生物反应器)、用转基因动物作器官移植的供体.
3。基因工程的药物异军突起：抗体、疫苗、激素、淋巴因子等
4。基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。
注意：①基因治疗并非把健康的外源基因导入患者的所有细胞中，而只是导入某些功能细胞中，且是体细胞。
　　 ②基因治疗分为体内基因治疗和体外基因治疗。
（四）蛋白质工程的概念
1.蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过
，对进行改造,或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（因此蛋白质工程又称为第二代基因工程）
２．基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质；蛋白质工程可以生产出自然界中不存在的蛋白质.
3。蛋白质工程的基本途径：
从出发，设计预期的，推测应有的序列，找到相应的（基因）如下图：

举例：如，速效型胰岛素的生产

四、经典高考：
１.(2０1７年北京卷，５）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒（图2）重组,再借助农杆菌导入菊花中。

下列操作与实验目的不符的是( ）
A．用限制性核酸内切酶EcoRI和连接酶构建重组质粒
Ｂ．用含Ｃ基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将Ｃ基因导入细胞
Ｃ．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D.用分子杂交方法检测Ｃ基因是否整合到菊花染色体上
2.（２017年新课标Ⅱ卷,3８)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解.通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题:
(1)在进行基因工程操作时,若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是_＿___＿_＿＿＿____＿_＿_________。提取ＲNA时，提取液中需添加ＲNA酶抑制剂，其目的是＿____＿________＿___＿__＿____。
（2)以mＲＮA为材料可以获得cDNA，其原理是________＿______＿___＿______。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞,原因是_＿__＿＿＿__＿＿___＿_＿＿_＿____＿_(答出两点即可)。
（４）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNＡ连接酶催化形成的化学键是_＿__＿________＿＿______＿____。
（５)若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析,其可能的原因是__＿_____________＿___＿__＿＿_。
3．（２017年新课标Ⅰ卷，３8)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白Ａ）。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因Ａ，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A,其原因是___＿__＿_＿___＿_＿_＿____。
(２）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用__＿___＿＿__＿__＿＿_____作为载体,其原因是_＿_____＿＿＿＿＿_________.
(３）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_____________＿＿＿_（答出两点即可）等优点。
(4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是__＿___＿_＿＿_＿_______(填“蛋白Ａ的基因”或“蛋白Ａ的抗体”)。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献,也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示,那么，这一启示是__＿________＿________＿＿＿__。
4。（２017年新课标Ⅲ卷,38)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲）由A、Ｂ、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示.

回答下列问题:
（1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙,若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列（ＴTCGCＴTCT……CAGGAAGGA），则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙,原因是______＿__＿_＿_____＿__________＿_＿______.
(２）某同学在用PＣR技术获取DNA片段B或Ｄ的过程中，在PCR反应体系中加入了DＮA聚合酶、引物等,还加入了序列甲作为______＿_＿＿＿＿_______＿＿,加入了_____＿_______＿_＿作为合成DNA的原料。
（3）现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用,某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组,其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照,培养并定期检测T淋巴细胞浓度,结果如图2.
①由图2 可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使Ｔ淋巴细胞继续增殖,可采用的方法是＿__＿___________＿__。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO２浓度,CＯ2的作用是_____________＿_＿＿_。
②仅根据图、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中,若缺少______＿___＿_＿_(填“A”“B”“C”“D"或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果.

基因工程经典高考题答案
１、Ｃ
2、(1）嫩叶组织细胞易破碎 防止ＲＮA降解
（2）在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成ｃＤNA
(3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子
（４)磷酸二酯键
（5)目的基因的转录或翻译异常
3、（1)编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mＲＮA无起始密码子
（2）模板 　 dNTＰ
（3)①进行细胞传代培养 　维持培养液是的ｐＨ 　　 ② C

4、（１）基因A有内含子，在大肠杆菌中,其初始转录产物中与内含子对应的RNＡ序列不能被切除，无法表达出蛋白Ａ 　
(2)噬菌体 　　噬菌体的宿主是细菌,而不是家蚕
（3）繁殖快、容易培养 　
（４)蛋白A的抗体
(５）DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体

１。2 基因工程的基本操作程序
【课标要求】
1.简述基因工程基本操作程序的四个步骤
2．尝试设计某一转基因生物的研制过程。
【本节重难点】
重点：基因工程基本操作程序的四个步骤
难点：（1）从基因文库中获取目的基因
　　 (2)利用PCＲ技术扩增目的基因
【学习过程】
一、基因工程的基本操作程序简述
①目的基因的；
②的构建;
③将目的基因；
④目的基因的。
二、基因工程的基本操作程序
(一)目的基因的获取
1．目的基因:主要是指的基因,也可以是一些具有作用的因子。
2.原核细胞和真核细胞的基因结构
（１)原核细胞的基因结构

（2）真核细胞的基因结构

3．目的基因的获取
目的基因可以从中分离出来，也可以用合成。
常用的方法有以下几种：
（1）从基因文库中获取目的基因
①基因组文库和部分基因文库（如ｃDＮＡ文库）

　　 　 　基因组文库 　 　　 　 cDNA文库
文库类型
cDNA文库
基因组文库
文库大小

基因中启动子

基因中内含子

基因多少

物种间的基因交流

②从基因文库中得到目的基因，可以根据一些信息，如根据基因的、
基因的、基因在染色体上的、基因的,以及基因的等特性。
（2）利用PCR技术扩增目的基因
①PCR是＿__________＿___＿__＿________＿__＿__＿＿＿技术，是的缩写。
②原理：______＿__＿＿_____＿__＿。,
③前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成__＿__＿＿__.
④条件:DNＡ模板、。
⑤扩增过程：

a．变性(℃):目的基因DＮA受热变性后接连为单链
b.退火（℃）：与单链相应互补序列结合
c．延伸（℃):在的作用下进行延伸
Taｑ酶的特点是。
PCR技术与DNA复制的比较：

PCＲ技术
ＤNＡ复制
相
同
点
原理

原料

条件

不
同
点
解旋方式

场所

酶

结果

（3)化学法直接合成
适用于基因比较,核苷酸序列又。
(二）——基因工程的核心
１。基因表达载体的构建，其目的是使目的基因在受体细胞中能，并且可以,同时，使目的基因能够.
２．基因表达载体＝+++

（1）启动子：是一段有特殊结构的,位于基因的,它是
识别和结合的部位，有了它才能驱动基因，最终获得所需要的蛋白质。
（2)终止子:也是一段有特殊结构的，位于基因的，相当于一盏红色信号灯，使在所需要的地方停止下来。
(3）标记基因：作用是为了，从而将含有目的基因的细胞出来,如基因。
３．构建基