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基因工程复习总结【实用文档】doc
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思考题
第二章分子克隆工具酶
1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。

２。说明限制性内切核酸酶命名原则(举例)。

3.限制内切核酸酶的星活性是指什么？
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性.星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。
引起星星活性的因素：甘油浓度高(>５％），酶过量（〉100U/ml）,离子强度低（〈2５　mmｏl/Ｌ），pH 值过高(〉8.０）,或是加了有机溶剂如ＤMSO（二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺,或是用其它2价阳离子如Mn2+、Cu2+、Ｃo2＋ 或Ｚｎ2+代替了Mg２+。
4．T4 DNA ｌｉgaｓｅ　和E。coli lｉgaｓe 有什么异同?

5.连接酶的反应温度如何选择，为什么？
连接酶最适的反应温度应是３7℃,但在这一温度下粘性末端的氢键结合不稳定，因此连接反应常采用的最佳温度一般在4—１6℃间，通常多选用12－１6℃ 30分钟到1６小时。

6。什么是Ｋlenｏw酶？有什么作用？
Kｌenow DＮＡ聚合酶是从全酶中除去5′―３′外切活性的肽段后的大片段肽段,而聚合活性和 ３′―５′外切活性不受影响.也称为Klenow片段(Ｋｌenowfrgmeｎt），或E．coli ＤNA聚合酶Ⅰ大片段（E.coｌi DNA　poｌymｅraseⅠｌaｒｇe fragｍent).
它也可以通过基因工程得到,分子量为76 kＤa.由于没有5′―3′外切活性，使用范围进一步扩大。
①补平3′凹端,如果使用带标记的dNＴＰ，则可对DNA进行末端标记。
②抹平DＮA３′凸端在3′―5′外切活性
③通过置换反应对DNＡ进行末端标记
④在cＤＮA克隆中合成第二链
⑤随机引物标记
⑥在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA
···7。如何利用工具酶来研究某一个基因内含子的存在？
···8.哪些工具酶可以用于探针标记？
T４ ＤNA聚合酶的替代合成法标记DNA探针。
反转录酶还可利用单链DNＡ或RNＡ作模板合成分子探针.
第三章分子克隆载体
１.基因工程载体应具备哪些特点？
能在宿主细胞中独立复制;
有一定的选择标记,易于识别和筛选；
有合适的限制酶位点,可插入一段较大的外源　DNA,而不影响其本身的复制；
最好有较高的拷贝数，便于载体制备。

2.作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？
能独立复制的单链或双链ＤＮA;
选择标记基因；
合适的限制酶位点。

···3.请简要描述λ噬菌体溶原状态和裂解循环的基因调控模式及其在构建载体中的作用。
4.丝状噬菌体载体克隆中经常遇到哪些问题?
丝状噬菌体载体的优点
ａ．可产生单链DNA或双链DNA，分别用于不同的目的
单链:为丝状噬菌体，可分泌到细胞外，用于测序或制备探针
双链：为含双链RF DNＡ存在于细菌菌落中，可供基因操作，如酶切,重组、提取、转化均应为双链DNＡ。具有质粒的优点
ｂ．丝状噬菌体所能包装的DNA长度没有一定的限制,有些噬菌体颗粒可包装比野生型丝状噬菌体DNA 长7倍的DNA。
缺点
a。较大的外源DＮA片段被克隆以后,在噬菌体扩增过程中往往不稳定，很容易发生缺失的现象，这可能是由于感染较短的噬菌体比长的噬菌体更具竞争优势所致。
b．单链载体分子感染的细胞中往往单双链混杂，纯化某种类型的分子（尤其是双链分子）比较费力,同时由于重组 DNA容易产生缺失,培养时间不能长，故所得ＤNＡ的量有限。
c.重组中，经常出现一些能以两种可能方向插入的载体却仅以一种特定方向插入外源DNＡ片段的情况，这是因为外源DＮA反向链的序列，在不同程度上干扰了载体基因间区域的功能所致。
克服“缺失"的办法
ａ.侵染菌应避免在液体培养基中连续继代培养
ｂ.应用贮存于-70℃,重组ｐhage　Ｍ１３感染细菌后铺板，再从噬菌斑中央部分挑取细菌后进行小规模培养
c。培养时间应尽可能短（通常4－8h)
d。收获噬菌体的培养液不能再做为原液继续培养 (因在重组子和野生型噬菌体共培养中，野生型具有选择优势,几代培养后可消除重组子)。
第四章人工染色体载体
1.大容量克隆载体有哪些种类,各有何特点？

·····2。简述利用YAC克隆载体构建基因文库的原理。

·····３。简述黏粒、YＡC、BAC克隆载体、P1噬菌体载体的基本构成元件.
4.黏粒载体具有哪些优缺点?怎样克服其缺点?
黏粒的优点
（1)同时具有λ噬菌体和质粒载体的特性
（2)具有高容量的克隆能力
柯斯质粒的缺点
a.两个粘粒之间，当存在同源序列时，可能会发生重组,结果使克隆的外源DNA片段重排或丢失。
b。含不同重组DＮA的菌落生长速度不一。当柯斯质粒文库复制扩增时，由于不同的插入片段对宿主细胞作用的情况不同,结果会出现各种外源DＮA 片段间的比例失调。另外不同重组柯斯质粒的产量相差悬殊。
c。包装蛋白制备过程较复杂,每批包装蛋白的包装效率不稳定。而且，购买包装蛋白的费用较高.
第五章表达载体
····1。以大肠杆菌为例，表达载体比克隆载体多了哪些功能元件,各有什么生物学功能？
2。简述利用Ｔ7噬菌体启动子的ｐＥT系列表达载体的工作原理。
····3。何为穿梭载体，在遗传结构上有何特点？
···4。将人的某个基因在大肠杆菌中表达应注意哪些问题?
···5.分泌表达载体需要哪些基本元件?
···6。什么是融合表达?有什么优点？
第8章　PCＲ技术及其应用
···１。简述ＰCＲ扩增的原理和过程？
PＣＲ反应特点:
特异性强
灵敏度高
简便、快速
对标本的纯度要求低
PＣR的基本原理是什么？用PCR扩增时,必须预先得知什么信息？
a.DＮA的半保留复制原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸.
ｂ.至少要知道足够合成一对引物的靶ＤNＡ序列。

·过程：
ａ。变性(deｎaturaｔｉon)：将模板DＮＡ置于９２—96℃,使ｄｓＤNA在高温下解链成为ｓｓDNＡ，且热变性不改变其化学性质；
b.退火（ａnnealinｇ）:将温度降至37—72℃，使引物与模板的互补区相结合；
c.延伸(extension):在72℃条件下,DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3‘-ＯH端，合成ＤＮA。
这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过　20-40个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的DNＡ片段。
PCR引物有哪些基本要求?
在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1　μM，即1pmoｌ/μl，在1０0 μl反应体系中相当于6ｘ1013个分子.如果５％用于扩增1 ｋb的ＤNA片段，可得到3.3　μｇ的产物，足以用于常规分析。
引物设计要考虑的几个问题
①长度:至少16 ｂp，通常为18—30 bp,更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。
②解链温度（Tm值):两个引物之间的Tm值差异最好在2-5℃。
③避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基）
④ Ｇ＋Ｃ含量尽量控制在40％－６０%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀.尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列,以及Ｔ在3′末端的重复排列。
⑤引物的3′末端最好是G或Ｃ，但不要GC连排。
·PＣR技术产生污染的主要原因和预防方法？
污染原因:1、样本间交叉污染 2、PCR试剂污染  3、ＰＣR扩增产物污染  4、实验室中克隆质粒的污染  
预防方法：
A。防止污染：试剂小量分装,吸头及ＥＰ管一次性使用；器皿及工作区域要分开;无菌操作B、设立对照:阳性对照  阴性对照 包括:标本对照和试剂对照.
···PCR技术有哪些应用？
···2．Ｔ/A克隆的基本原理是什么？
第九章 ＤNA序列分析
1.简述化学降解法测序的基本原理以及主要应用范围.
a。原理：将待测DNA片段的５‘端磷酸基团作放射性标记，再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并在该位置打断核酸链，从而产生一系列长度不一且分别以不同碱基结尾的ＤNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样（laｎe—by-lanｅ）的方式用凝胶电泳进行分离,再经放射自显影,即可读出目的ＤNA的碱基序列。
ｂ。核心原理:特定化学试剂可对不同碱基进行特异性修饰并在被修饰的碱基处（5′或３′）打断磷酸二酯键，从而达到识别不同碱基种类的目的。
化学降解测序法的基本步骤包括：
（１）对待测DNＡ片段的５′端磷酸基团作放射性标记；
（2）用化学修饰剂修饰特定碱基;
（3）凝胶电泳分离和放射自显影显示出各片段的长度
（４）读序,由于在同一反应体系中,各DNA片段的标记端相同、起始位点相同,所以,根据断裂部位至标记端起始部位之间的距离(片段长度)，即可得出碱基顺序.
化学降解测序法的应用
Mａxａm—Gｉlbert化学降解测序法不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；
a。对未经克隆的DNA片段可以直接测序.
b．化学降解测序法特别适用于测定含有如5-甲基腺嘌呤、Ｇ+Ｃ含量较高的DNＡ片段以及短链的寡核苷酸片段的序列。
c．测定长度大约250个碱基
２。简述Ｓanｇeｒ双脱氧链终止法测序的原理。
双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的3’位置的— OH缺失，致使下位核苷酸的５'磷酸基团无法与之结合。一旦双脱氧核苷酸整合到正在合成的DNA链中,该股ＤNA的合成就到此终止.
···3.试述化学降解法和双脱氧链终止法的异同点。
第十一章 DNＡ文库的构建和目的基因的筛选
1。基因组DNA文库有哪些类型？其相关的特点是什么？
⑴质粒文库
质粒是最早用于构建基因组文库的载体,质粒载体所容纳的外源ＤNA片段一般在10 ｋb以内。
这类基因组ＤＮA文库一般应用于“鸟枪法"全基因组测序研究和用于构建亚克隆文库或亚基因组文库。
⑵噬菌体文库
噬菌体文库是以细菌噬菌体基因组衍生的一系列载体系统构建的，常用的有l噬菌体载体、M1３单链噬菌体载体、P１噬菌体载体及由噬菌体衍生的质粒载体。
M13载体所容纳的外源片段较小,一般用于构建cＤNA文库或ＢAC和PAC亚克隆文库。
噬菌体文库中应用最广泛的是l噬菌体。由于其有利于利用分子杂交的方法进行筛选，用l噬菌体构建的基因组DNＡ文库在小基因组物种的基因克隆中起着重要作用.
⑶黏粒文库
黏粒又称柯斯质粒，是由ｌ噬菌体的coｓ序列、质粒的复制序列及抗生素抗性基因构建而成的一类特殊的质粒载体。
黏粒载体和噬菌体载体类似，主要用于构建小基因组物种的基因组DNA文库。
利用它们在筛选上的优势来分离单个基因或构建一定区间范围的亚基因组DNＡ文库等.
⑷人工染色体文库
包括酵母人工染色体文库、细菌人工染色体文库和Ｐ1人工染色体文库,也称为大片段基因组ＤNA文库，容纳的外源DNA片段为1０0 kb-１ Mb。
主要用于大基因组物种的基因克隆、物理图谱构建和基因组测序等，在基因组研究中应用越来越广泛.
⑸亚基因组文库
亚基因组文库是相对于基因组文库提出的，文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的某一区段，如基因组DNA某一特定大小酶切片段的组合、一条染色体或更小的区段（如一个YＡC或BAC克隆等）。
···2。构建大片段基因组文库过程中需要注意哪些问题?
３.均一化cＤNＡ文库构建的基本原理是什么？
mRＮA－cDNA杂交方法的原理是用过量的驱动mRNA 与供体的cDNA文库质粒反复多轮杂交，去除驱动和供体共同表达的基因,构建均一化的、扣除杂交cＤNA文库.
4。扣除cDNA的基本原理是什么?
扣除杂交技术（ｓuｂｔracｔｉｖe　ｈｙbrｉdization)
将含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为待测样本(tester），将基因表达谱相似或相近但不含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为对照样本(drｉver）。将teｓter和dｒｉveｒ的ｃDNＡ进行多次杂交，去掉在二者之间都表达的基因，而保留两者之间差异表达的基因，使低丰度基因在文库中的比例大大提高，筛选到差异表达的基因的可能性也大大提高。
···5。全长cDNA文库构建的原理？
６。酵母双杂交的基本原理?
酵母双杂交系统简称双杂交系统(ｔｗo—hｙbriｄ ｓｙｓtｅm）,也叫相互作用陷阱(interaｃtion tｒaｐ)，是根据真核生物转录调控的特点创建的一种体内鉴定基因的方法。其筛选的基因不是探针的直接编码物，而是能够与其相互作用的蛋白质的编码基因，即筛选与已知基因的产物发生相互作用的蛋白的编码基因.
·酵母双杂交系统的基本原理
来自酵母转录激活因子（ｔranscｒiｐtioｎaｌ actiｖator)ＧＡＬ4是一种典型的转录因子，有两个功能域:
一是ＤNA结合结构域(DNA　bｉnding domａｉn, BD）
靠近羧基端,含有几个锌指结构,可与DNＡ序列中半乳糖苷酶的上游激活序列(ｕpstreａm activaｔｉng　sｅqueｎｃe， ＵAＳ)结合；
二是转录激活结构域（ａctiｖaｔiｏｎ domａin, AD）,
可与RNＡ聚合酶或转录因子ＴFＩI相互作用,提高RＮA 聚合酶的活性。这两个结构域的功能是独立的.
酵母双杂交系统利用融合蛋白的策略,将要筛选的“探针”蛋白X与ＢD融合为BD-X（通常称为诱饵, baｉt)；
将所要筛选的对象Y与ＡD构建成融合蛋白的ＡD—Y ｃDNA文库（即将目的ｃＤNA与ＡD基因构建融合基因文库),通常称ＡＤ—Y为猎物(prｅy)；
将它们导入酵母细胞中共表达,如果X与Y相互作用，则会导致ＢD和AD在空间上接近形成一个有功能的转录激活因子，激活下游报告基因的表达.
第十三章植物基因工程
1．植物基因转化受体系统具备的条件？
ａ.高效稳定的再生能力
ｂ。较高的遗传稳定性
c．具有稳定的外植体来源
d。对选择抗生素敏感
e.对农杆菌有敏感性
f．是否具有经济价值或有潜在的生产应用价值

２.植物基因工程常用的受体系统有哪些?
a.愈伤组织再生系统
b。直接分化再生系统
c．原生质体再生系统
ｄ．生殖细胞受体系统

3.植物基因转化方法有哪些？
a。原生质体介导法
包括：
PEG介导的基因转化
脂质体介导基因转化
电激法介导基因转化
显微注射介导的基因转化
激光微束介导的基因转化
b。基因枪法
c.根癌农杆菌介导法
···４.农杆菌转化的基本原理?
5．什么是二元载体？和一元载体比有什么优点？
二元载体(bｉnａry ｖectｏｒ)系统是指由两个分别含Ｔ-DNA和Vir区的相容性突变质粒构成的双质粒系统
因为其Ｔ-DＮA与Ｖiｒ基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移，故称之为反式载体(trａns　veｃtｏr).
二元载体较一元载体有更多的优点：
a.首先，二元载体的构建较为方便；而一元载体还需在根癌农杆菌中进行共整合，构建效率相对较低。
ｂ。其次，二元载体的外源基因的转化效率要高于一元载体。
所以目前在植物基因工程研究中主要使用二元载体系统。

6．植物转化常用的选择基因和报告基因有哪些？报告基因有什么特点?
植物基因工程中的选择标记基因主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因.
选择基因:与外界存在的筛选压力如抗生素等相互作用,以筛选出被转化的细胞；
最常用的有新霉素抗性基因(neor）、庆大霉素抗性基因（gｅntｒ)、潮霉素磷酸转移酶(HPT）基因（hpt）,以及膦丝菌素乙酰转移酶基因（ｂaｒ）等。

报告基因是指其编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是否成功地导入受体细胞(器官或组织），是否启动表达的一类特殊用途的基因。
提供一种快速测定外源基因是否成功导入的检测手段，它的应用不依赖于外界选择压力的存在。
理想的报告基因具备的基本要求
①报告分子不存在于宿主中或易于与内源性基因相区别;
②应有一个简单、快捷、灵敏及经济的分析方法；
③报告基因的分析结果应具有很强的线性范围，便于分析启动子活性的大小变化;
④报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物体生理活动.
最常用的报告基因
β—葡萄糖甘酸酶基因（gus）
氯霉素乙酰转移酶基因(cａt）
荧光素酶基因(luc
绿色荧光蛋白（GFP）基因(gfp)等。

7。转基因植株的鉴定方法有哪些,作为一组完整的转基因植株鉴定数据至少应包含哪些参数？
a。PCR检测外源基因的整合
b。Southｅrn杂交检测外源基因的整合
c．RT-PCＲ 检测外源基因的表达
d．Nortｈern杂交检测外源基因的表达
e.Weｓteｒｎ杂交检测外源基因表达的产物

第十四章动物基因工程
···１.简述反转录病毒在动物基因工程中的作用。
2。试述基因敲除与基因敲入的区别.
3．质粒载体与病毒载体有何异同？
表达载体:
（1)带有原核复制区
（2）带有选择性标记基因
保证重组DNＡ分子能够在大肠杆菌中扩增
(3)必须包括能在真核细胞表达的相关组件
一般包括转录外源DNＡ序列的启动子元件、转录产物有效地加上pｏｌｙ（Ａ)尾巴所必需的信号序列、真核细胞中的选择性标记，以及一些附加元件，如增强子、内含子、剪接供体与受体点，以保证外源基因的高效表达.
·病毒载体：
①携带外源基因并能包装成病毒颗粒;
②介导外源基因的转移与表达；
③对机体不致病。

4。简述转基因小鼠的制备过程.
·DNA显微注射法制备转基因小鼠
·胚胎干细胞法制备转基因小鼠

DＮＡ显微注射法制备转基因小鼠
⑴超数排卵
对年轻、健康未孕母鼠（４-5周龄）注射促性腺激素，诱导超数排卵，与种公鼠合笼交配。从输卵管的壶腹部收集原核期受精卵,排卵率一般可达30枚以上，但具体排卵多少受激素种类和小鼠品种影响较大.
⑵基因准备
从整合率上看线形ＤNA分子要好于环形DNA,而环形DNA在细胞内的半衰期较长，适用于瞬间表达与基因治疗。
尽管载体ＤＮＡ序列不影响外源DＮA的整合效率,但载体序列能抑制转基因的表达，因此应尽量去除转基因结构中的载体部分。
⑶显微注射
（１)外源DNA进入原核
(2）培养液中培养
（3）进行冷冻保存，或直接用于移植，或继续培养发育到囊胚后再移植.

⑷胚胎移植
胚胎：囊胚期或囊胚期之前的胚胎，可依据早期胚胎的发育阶段和物种的不同决定移植的部位。
注射后的单细胞至桑葚期的胚胎应移植到0．5ｄ
假孕鼠的输卵管内，而达到囊胚期的胚胎则须转移至2。5 d假孕鼠子宫内。
未经注射的新鲜胚胎的移植成功率为50%－7０％，注射胚胎移植后的受胎率有所下降，仅为10%—30%。
⑸转基因个体鉴定
接受胚胎移植的假孕鼠产下的幼鼠是否含有外源基因？
（１）分子鉴定，判定其基因组内是否整合了外源基因
（2）目的蛋白表达与否和表达水平测定
(３)产物的分离纯化及生物活性检测

2．胚胎干细胞法制备转基因小鼠
胚胎干细胞(embrｙonic　stem cells， ＥSCs)： 从早期胚胎内细胞团(ｉnneｒ cｅｌl
mａss, ＩCM)中分离出的未分化、具有正常二倍体染色体和发育全能性的细胞。
当将胚胎干细胞人工注入宿主早期胚胎的囊胚腔内(又称内细胞团注射)后,所注入的胚胎干细胞可以同宿主内细胞团细胞共同发育,分化成成体动物的各种组织（包括生殖细胞），形成嵌合体。
a.转基因胚胎干细胞的获得
b.囊胚注射
c。嵌合体的检测和育种

5.转基因动物的鉴定方法有哪些？
a。标记筛选法利用正负筛选标记
b．分子鉴定法:PCR扩增、斑点杂交、Soutｈｅrn杂交、荧光原位杂交
c．表达水平检测:报告基因检测、 Northern杂交、　RT-ＰＣR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、 Western杂交、目的蛋白的生物活性检测
判定是否产生出转基因动物的重要标准是检查外源基因是否整合到动物的生殖系统中,即是否能够稳定遗传。

第十五章酵母基因工程
2。作为一个酵母表达载体,包括那些基本元件？
典型的酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的穿梭质粒。
·原核部分：大肠杆菌中ori和抗生素抗性序列。
·酵母部分：维持复制的元件,如附加型的２μm质粒复制起点序列,或染色体的自主复制序列(autｏ—ｒｅplicatiｏn sequｅnce， ARS）,或整合型载体的整合介导区;酵母转化子的筛选组分以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。
·分泌型表达载体还要带有信号肽序列
酵母表达载体主要元件
①启动子
最常用的启动子是基因AＯＸ1的启动子,在它控制下的外源基因在甲醇诱导时能得到高效表达.
PGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)：在毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子，在它控制下的β-LaｃZ基因表达率比甲醇诱导下的以PＡOＸ1启动的产量更高。
PGAP不需要甲醇诱导，发酵工艺更为简单，又因其产量很高，所以成为代替ＰAOX1的最具潜力的启动子。
②选择标记
常用HIS4，以及ＡRG4、ＴRＰ1或URＡ3作选择标记的载体。
巴斯德毕赤酵母不能利用蔗糖，所以可用来源于酿酒酵母的蔗糖酶基因SUC2作为选择标记。
抗性选择标记有抗生素G4１８抗性基因和Ｚeｏcｉn抗性基因（一种强诱变剂)。
leｕ-作为酵母载体的选择标记基因
③信号肽序列
表达外源蛋白分胞内表达和分泌表达。
毕赤酵母本身基本不分泌内源蛋白，所以外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
如果自身信号肽序列效果不佳,可用α-交配因子引导序列引导外源蛋白的分泌。在巴斯德毕赤酵母载体中还使用过蔗糖酶基因　SUC２的信号肽序列、酸性磷酸酶基因PHＯ1的信号肽序列等。
···3。叙述附加型表达载体和整合型表达载体用在表达外源基因上的区别.
···4.如何提高基因在染色体上的拷贝数来提高异源基因的表达量？

附
什么是蓝白斑筛选法? 
答:这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体.主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β-半乳糖苷酶(ｌaｃ）的基因片段，携带有laｃ基因片段的载体转入ｌac-宿主菌后,在含有X-ｇal平板上形成浅蓝色的菌落或噬菌斑。外源基因插入ｌaｃ（或ｌａｃ基因部分被取代）后,重组的菌体或噬菌斑将丧失分解的能力，转入lac－宿主菌，在含有Ｘ—gal平板上形成白色的菌落或噬菌斑,非重组的菌落或噬菌斑则为蓝色.

基因工程　　 学案
【考纲内容】1、基因工程的诞生 　Ⅰ　 　　 　 　 2、基因工程的原理及技术 Ⅱ
3、基因工程的应用 Ⅱ　　 　　 　　　　 ４、蛋白质工程 Ⅰ
【基础知识梳理】
一、基因工程的概念：按照人们的愿望，进行严格的设计,并通过__＿_______＿_和________等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的____＿＿___＿__和_____＿_____＿.由于基因工程在＿__＿___分子水平上进行设计和施工的,因此又叫做______＿_________。
二、DNA重组技术的基本工具
１、限制酶（全称：____________＿_＿＿）
(1）来源:主要从_＿__________中分离纯化出来
(２)特点:识别_＿_＿_＿＿_____分子的_______＿____＿_＿＿_，并且使每一条链中特定部位的_______＿＿_＿_之间的＿_______＿___键断开。
(３)结果：产生黏性末端或平末端
２、DＮA连接酶（１）类型：根据酶的来源不同，可分为____＿___＿_＿______和____＿＿___＿_＿____＿_，
（２）作用：连接双链DNＡ片段，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的______＿______＿__。
３、载体
(1）种类:通常利用_____＿_＿____作为载体，另外还有_＿＿_______＿__＿__、_＿________＿＿等
质粒的化学本质：___＿_____＿______＿＿___＿__分子
（2）特点：能_＿＿_＿__＿___＿、有____＿__＿_____＿_＿_＿＿__＿＿_、有__＿___＿_____
三、基因工程的基本操作程序
1、＿____＿_＿_＿__的获取
(1）目的基因: 编码蛋白质的结构基因 。
（2)获取目的基因的方法：
______＿____＿＿_____＿_____＿＿_、＿_____＿＿_＿_＿________＿＿____、___＿_____＿_＿____＿＿＿＿＿＿_____＿。
（3）ＰCＲ技术扩增目的基因
①原理：___＿＿____＿__＿_＿__
②过程:第一步:加热至9０～95℃ＤＮA__＿______；
第二步:冷却到5５~60℃，_＿___＿_____＿结合到互补DＮA链;
第三步：加热至7０～75℃，________＿_＿___＿__酶从引物起始互补链的合成。
2、__＿____＿_____＿＿＿＿的构建
是实施基因工程的第二步，也是基因工程的＿_______＿___。
(1）目的:使目的基因在受体细胞中＿__＿_______＿__＿__，并且可以_____________＿＿＿_，使目的基因能够_＿_____＿＿___＿__＿_。
(２）组成:______＿__＿__＿__＋__＿__＿______＿+＿_____＿______+＿＿_＿_____＿__（如抗生素基因)
①启动子：是一段有特殊结构的_＿__＿＿＿_＿片段，位于____＿___＿＿____，是_＿__＿__＿＿__酶识别和结合的部位，能驱动基因＿＿__＿＿____＿_＿＿_，最终获得所需的蛋白质。
②终止子:也是一段有特殊结构的_＿____＿＿_________,位于＿________＿____＿。
③标记基因的作用：_＿___＿_________________＿__＿＿_＿___________＿_＿__________＿_＿＿＿____＿＿__。
常用的标记基因是抗生素基因.
３、将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
__＿_＿_＿___＿＿_＿_________＿______
____＿__＿_＿_______
__________＿_＿____
受体细胞
体细胞
__＿＿__________＿__
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti质粒的
T-ＤＮA上→______＿＿＿＿__→导入
植物细胞→整合到受体细胞
的DNA→表达
将含有目的基因的表达载
体提纯→取卵（受精卵)
→＿_____＿＿→受精卵发育
→获得具有新性状的动物
____处理细胞→微生物细
胞壁的通透性增加→重组
质粒与＿__＿____＿混合→
感受态细胞吸收_＿__＿____＿
4、目的基因的检测与鉴定
（1)利用_________＿______检测目的基因的有无；
(2）利用_＿_____＿＿___＿_＿_检测目的基因的转录;
（3)利用＿_______＿_＿_____检测目的基因的翻译；
（4）利用_＿__＿＿_____生物学水平的检测鉴定重组性状的表达。
四、基因工程的应用
1、植物基因工程
（1）主要用于提高农作物的抗逆能力(如_________、＿_＿＿____、＿_______、_＿____＿_和_＿＿____＿＿)。
（2)改良农作物的_＿＿＿＿＿_____。
（3）利用植物生产＿___＿__＿等方面。
２、动物基因工程(1)用于提高动物_＿__＿__速度.
（2)用于改良畜产品的_＿＿__＿＿__＿_。
(３）建立___＿＿＿__，用转基因动物生产__＿_＿___＿＿.
（4)用转基因动物作＿_____＿__＿_的供体。
3、基因治疗(1）概念：把________＿＿__导入病人体内，使该基因的表达产物___＿_＿＿_＿__。
(2）效果:治疗_＿________＿的最有效的手段。
（3）分类:_______＿__和__＿＿_＿__＿_。
４、基因工程药物：_________＿_、_________、______＿____、激素等。
五、蛋白质工程
1、概念理解: ①基础:蛋白质分子的_____＿＿_＿__＿＿及其与__＿_____＿___＿_的关系.
②操作:_＿_____＿__＿___或_＿__＿___＿_＿__。
③结果：＿__＿＿__＿_＿__＿________＿__＿____＿___＿。
④目的：满足人类的生产和生活的需求。
（２)操作过程:_________＿＿_____＿_______＿___→设计预期的蛋白质结构→____________＿__＿__＿→__＿＿_＿___________＿__＿________→合成DNA→基因表达→产生需要的蛋白质。
判断正误:(1）E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端（ 　)
(2)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体( ）
(3)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达(　 )
(4）抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达(２０14·江苏，２3D）（　 ）
(5）应用ＤNＡ探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达(201１·四川，5D)(　　)
(6)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株(　　)
(7）由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用(　　）
(8）利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品,如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中( 　)
(9）蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作,定向改变分子的结构（ 　)
（10）目前在抗菌性和溶血性均较强的多肽Ｐ1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽（２013·广东3C）( ）
（11）为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体（　　)
(12）目前，植物基因工程技术主要应用于提高农作物的抗逆性、生产某些天然药物、改良农作物的品质、作器官移植的供体( 　）
（13）基因工程药物主要来源于转基因动物生产( 　)
【课后习题】１．如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是（ ）
Ａ.①②③④B。①②④③
C．①④②③D.①④③②
2．下列关于载体的叙述中，错误的是( 　）
A.载体与目的基因结合后,实质上就是一个重组DNA分子
B。对某种限制酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点
C。目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒
D。载体具有某些标记基因，便于对其进行切割
3．若要利用某目的基因(见图甲)和P１噬菌体载体（见图乙)构建重组DNA（见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ（A↓GATCＴ）、EｃoRⅠ(G↓AATTＣ)和Ｓaｕ3AⅠ(↓GATC）。下列分析合理的是（　　)

A。用ＥcoＲⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B.用BglⅡ和EcoＲⅠ切割目的基因和Ｐ1噬菌体载体
C．用BglⅡ和Sau３ＡⅠ切割目的基因和P１噬菌体载体
D．用ＥｃoＲⅠ和Sａu3ＡⅠ切割目的基因和Ｐ1噬菌体载体
4.右图表示用化学方法合成目的基因Ⅰ的过程。据图分析，
下列叙述正确的是(　 ）
A．过程①需要DＮＡ连接酶
B。过程②需要限制性核酸内切酶
C．目的基因Ⅰ的碱基序列是已知的
D.若某质粒能与目的基因Ⅰ重组，则该质粒和目的基因Ⅰ的碱基序列相同
5.下列用于判断目的基因是否转移成功的方法中，不属于分子检测的是（　　)
A．通过害虫吃棉叶看其是否死亡Ｂ．转基因生物基因组DNA与DNA探针能否形成杂交带
Ｃ。转基因生物中提取的mRNＡ与ＤNA探针能否形成杂交带
D．转基因生物中提取的蛋白质能否与抗体形成杂交带
6．将ａda（腺苷酸脱氨酶基因）通过质粒pＥT28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶.下列叙述错误的是（ 　)
A.每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒 　 B.每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点
C。每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada D．每个插入的adａ至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子
７．在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中,下列操作错误的是()
A。用限制性核酸内切酶切割烟草茶叶病毒的核酸 B．用ＤNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体
Ｃ．重组DNA分子导入原生质体 　 　 　Ｄ.除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞
8。2０08年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白“的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是
A．追踪目的基因在细胞内的复制过程 　 　 B．追踪目的基因插入到染色体上的位置
C。追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布 　 　　D.追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构　
9．抗菌肽对治疗癌症有一定作用,下图表示抗菌肽合成过程。下列有关叙述错误的是（ 　）
⇨⇨⇨⇨⇨
A。用PCR克隆目的基因不需要DNＡ解旋酶 B．基因表达载体含有启动子和终止子
C.筛选菌种时用基因探针检测相关蛋白质 D。分离纯化的目的是获得较纯净的抗菌肽
非选择题：1．回答有关基因工程的问题：
（1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNＡ后,可能产生黏性末端,也可能产生末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接,则应选择能使二者产生(相同、不同）黏性末端的限制酶.
(2）利用大肠杆菌生产人胰岛素时,构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等,其中启动子的作用是。在用表达载体转化大肠杆菌时,常用处理大肠杆菌,以利于表达载体进入;为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNＡ，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mＲNＡ杂交，该杂交技术称为。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成，常用抗原—抗体杂交技术。
（3）如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Tｉ质粒的中，然后用该农杆菌感染植物细胞,通过DNＡ重组将目的基因插入植物细胞的上.
（4）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了。
2。科学家从预期人的生长激素的功能出发,推测相应的脱氧核苷酸序列，并人工合成了双链DNA片段,获得双链DNA。科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的质粒进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是－G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是 -↓GAＴＣ-。据图回答：
（1）获得生长激素基因的方法有＿_＿_＿__________＿＿＿____＿____＿__＿＿_＿_＿__。用PCＲ技术扩增基因时用到的耐高温酶通常是指＿_＿____＿______＿_＿____＿_＿_；步骤②用到的酶有_____＿_______＿_________。
(2）构建基因表达载体时，必须有_＿_＿______、目的基因、终止子以及_＿_＿______。　
(３)为了精确地获取图中的目的基因，应用__＿__＿__＿_切割质粒，用__＿__切割目的基因。
(4）将基因表达载体导入细菌B之前，要将细菌B放入一定浓度的＿＿＿_____＿_＿_＿