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应用多重PCR技术检测慢性淋巴细胞白血病IgVH基因突变【摘要】 免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因突变是慢性淋巴细胞白血病(CLL)最重要的独立预后因素之一，为探讨CLL患者IgVH基因突变状态，应用多重PCR技术检测9例CLL患者的IgVH基因，纯化PCR扩增产物后直接测序，应用IMGT/V-QUEST工具分析，明确有无IgVH突变及突变位置。结果表明： 9例CLL患者皆扩增出395-465 bp区域(MIX I)或290-360 bp区域(MIX II)单克隆条带，测序结果显示5例患者有突变，IgVH基因分别为IGHV3-11*03、IGHV3-9*01、IGHV3-23*01、IGHV4-59*01和IGHV4-34*02；4例无突变，IgVH基因为IGHV3-53*01、IGHV3-23*03、 IGHV3-33*05和IGHV3-7*01。结论： PCR检测IgVH基因突变，简化了繁琐的实验过程，缩短了实验时间，解决传统PCR对IgVH基因突变检测的桎梏，值得在临床和科研中推广使用。【关键词】 多重PCR； IgVH； 基因突变Detection of IgVH Mutation Status in Patients with Chronic Lymphocytic Leukemia by Multiplex PCRAbstract IgVH mutation status is one of the most important independent prognostic factor of chronic lymphocytic leukemia (CLL). In order to evaluate IgVH mutation status in patients with CLL, IgVH mutation was detected by multiplex PCR in 9 CLL patients and purified PCR amplification products were directly sequenced, IgH somatic hypermutation and mutation site were analysed by IMGT/V-QUEST. The results showed that 5 patients had mutated IgVH, and IgVHs were IGHV3-11*03, IGHV3-9*01, IGHV3-23*01, IGHV4-59*01, IGHV4-34*02, respectively; whereas 4 others had unmutated IgVH, these IgVHs were IGHV3-53*01, IGHV3-23*03, IGHV3-33*05 and IGHV3-7*01. It is concluded that multiplex PCR is a rapid and easy method to detect IgVH mutation status, and it solves the limitations and pitfalls of routine PCR, and it is worth being extensively used both in clinic and scientific researches.Key wordsMultiplex PCR; IgVH; gene mutation慢性淋巴细胞白血病(CLL)是西方国家最常见的一种恶性淋巴细胞增殖性疾病，约占全部成人白血病的30%，主要发生在老年人，男女比例为1。我国发病率虽然低于西方国家，但随着人口的老龄化，发病率呈现逐年上升趋势。CLL患者的临床病程和转归呈高度异质性，部分患者生存同年龄、性别匹配的正常人相同，而部分患者即使接受了早期的积极治疗仍很快死亡1,2。因此，CLL预后因素的检测就显得尤为重要。近来多个研究组3-6证实，免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因突变是最重要的独立预后因素之一。本研究旨在应用多重RT-PCR技术研究CLL患者IgVH基因突变。材料和方法研究对象随机选取我院血液科住院或门诊的CLL患者，共9例，其中男7例，女2例，中位年龄55 (36-77) 岁。临床分期应用Binet分期，Binet A期2例、Binet B期5例、Binet C期2例。所有患者进行外周血常规、骨髓细胞形态学和多参数流式细胞术细胞免疫分型检测，诊断与分期均根据血液病诊断与疗效标准7确定。实验室检查:外周血WBC数10109/L，淋巴细胞比例50%，绝对值5109/L，骨髓增生活跃或明显活跃，淋巴细胞数40%，以成熟淋巴细胞为主；免疫表型： CD10-、CD19+、CD5+、CD23+、CD20+和FMC7-，并排除其他疾病。收集患者的外周血或骨髓标本，用淋巴细胞分离液收集单个核细胞。IgVH基因的多重PCR检测RNA抽提及逆转录采取TRIZOL一步法抽提RNA，并予以逆转录。逆转录反应体系： RNA 2 g，oligo dT 1 l ( g/ l) ，5Buffer 8 l， dNTP (40 mmol/L) 2 l，AMV 10 U(1 l)，RNasin 40 U (1 l)，DTT (100 mmol/L) 1 l，加DEPC水至40 l，70 , 10分钟；冰上至少10分钟；42，1小时；95，5分钟；冰浴5分钟，-80保存。PCR引物IgVH片段由3个框架区(framework, FR)和两个抗原互补决定区(complementarity-determining regions, CDR)组成(图1)。IgVH基因引物由InVivoScribe公司提供(InVivoScribe, USA)，定购该公司编号为5-1010010的IGH Somatic Hypermutation Assay for Gel Detection试剂盒，其中有两种混合引物：MIX I和MIX II，前者扩增领头区(leader)和JH之间的基因，后者扩增FR1与JH间的基因。以GAPDH为内参照，上游引物： 3-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-5，下游引物： 3-GAAGATGGTGATGGGATTTC-5，扩增片断为230 bp。PCR反应体系MIX I或MIX II 45 l，Taq DNA聚合酶 1 U ( l)，cDNA模板5 l，共50 l反应体系。反应条件是： 94 7分钟后， 94 45秒；60 45秒；72 90秒扩增35个循环后，72 10分钟。以相同条件扩增试剂盒中提供的阳性和阴性参照。2%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察到7例慢淋患者扩增出395-465 bp区域(MIX I)单克隆条带，2例标本扩增出290-360 bp区域(MIX II)单克隆条带。PCR产物序列分析未纯化PCR原液由上海生工纯化后直接测序。测序结果应用IMGT/V-QUEST数据库分析(http:/)，明确有无IgVH突变及突变位置。IgVH碱基突变率=错配碱基数可变区总碱基数，IgVH碱基突变率2%定为体细胞突变标准4,5。结果9份标本皆先用MIX I进行扩增，其中7个扩增出395-465 bp区域的单克隆条带(标本号为1、2、4、5、7、8、9)，3号和6号标本未扩增出特异性条带，再用MIX II扩增，扩增体系和反应条件同MIXI，结果扩增出290-360 bp区域的单克隆条带(图2)。测序结果应用IMGT/V-QUEST数据库分析(图3)。5例患者有体细胞突变，3例处于Binet B期，2例处于Binet C期，IgVH基因分别为IGHV3-11*03、IGHV3-9*01、IGHV3-23*01、IGHV4-59*01和IGHV4-34*02；4例无突变，2例Binet A期，2例Binet B期，IgVH基因分别为IGHV3-53*01、IGHV3-23*03、IGHV3-33*05和IGHV3-7*01。IgVH突变分析见表1。Table . IgVH mutation status analysis of 9 CLL patients讨论CLL是淋巴细胞克隆性增殖为特征的高度异质性恶性血液系统疾病。其预后的异质性使得CLL预后因素的检测就显得尤为重要，其中有无IgVH基因体细胞突变已被证实是目前为止与预后相关最为密切的因素。CLL根据有无IgVH基因体细胞突变分成两种类型。无IgVH基因突变型：起源于生发中心前B细胞，为生发中心前期肿瘤，病情进展快、生存期短，临床分期多为晚期；IgVH基因突变型：起源于记忆B细胞，为生发中心后期肿瘤，病程进展缓慢，生存期很长，临床分期多在早期3,6。本组9例患者，4例无IgVH基因突变患者2例处于Binet A期，2例处于Binet B期；5例IgVH基因突变型患者3例处于Binet B期、2例Binet 处于C期。但9例患者至今皆只随访2年左右，病情尚无变化。由于随访时间短，病例数少，IgVH突变情况无法与分期形成有效统计，这有待于我们在今后的研究中进一步增加病例数，延长随访时间，观察疾病进展情况以作出准确判断。正常和恶性B细胞中最常见的VH家族是VH3(30%-50%)和VH4(20%-30%)，其次是VH1(10%-20%)家族，占总数的75%-95%；在Precursor B-ALL中VH6也多见8。本研究中9例标本的IgVH基因有7例属于VH3，2例属于VH4，与报道相符。但Tobin等9报道，IgVH基因突变型患者以VH3-21多见，无IgVH基因突变型患者以VH1-69多见。但本组9例标本均未见以上两种IgVH基因类型。每一个B细胞都有自己长度和序列特异的由可变区(V)、多变区(D)和结合区(J)片段重排形成的位于14q32、大约1250 bp IgH基因。IgH基因包括7个VH家族(现已发现52个有功能的VH片段，30个无功能的VH片段)、7个DH家族(现已发现27个有功能的DH片段)、6个JH家族(现已发现6个有功能的JH片段)。不同V、D、J区的排列组合大约有2106，而基因重组过程中的核苷酸的随机缺失和插入，使得排列组合的数目剧增，超过至1012。淋巴细胞的Ig分子要经过生发中心的体细胞高度突变才能成为成熟的B细胞(因此生发中心或生发中心后期起源的成熟的B细胞恶性肿瘤中存在有体细胞突变)，而这一过程同时扩大了Ig排列组合的数目8,10。IgVH基因片段中FR序列相对保守，而CDR即使在同一VH家族中也高度不同，是生发中心期体细胞突变的高发区，尽管FR不易发生体细胞突变，但可发生核苷酸置换，尤其易发生在高度突变的B细胞。现在在一些实验室开展的PCR技术检测IgVH基因是应用单个VH通用引物，与三个FR中的一个通常是FR3的序列互补，这种通用引物不能以相同效率扩增所有VH片段；而且由于体细胞突变并不是局限于CDR，也会发生在FR，如果FRs区域发生了基因突变，就会阻碍通用引物和FR的目的序列结合，导致克隆PCR产物检测失败。由于IgH基因的多态性，CLL IgVH突变状态应用常规PCR方法检测所需引物众多，技术繁杂，标本需求量大，耗时久，费用高，在普通的实验室难以开展，且容易产生假阴性或假阳性结果。因此虽然早在10多年前就提出IgVH体细胞突变与CLL预后有密切关系，但大部分实验室无常规开展此工作的条件。本研究小组曾在1年前应用上述方法检测IgVH突变状态，在近30份标本中仅1份扩增出特异性片段，每份标本需进行36次PCR过程，由于其耗时低效而终止研究。而本次研究采用多重PCR检测IgVH基因突变，简化了繁琐的实验过程，缩短了实验时间，而且由于InVivoScribe 公司提供的试剂盒中提供阳性和阴性参照，减少了假阴性假阳性结果出现的几率，使实验结果更加可信。多重PCR解决了传统PCR对IgVH基因突变检测的桎梏,值得在临床和在科研中推广。现在国内外大量实验证实，IgVH基因突变与ZAP-70、CD38、细胞遗传学异常、sCD23、胸苷激酶、LPL等一系列CLL预后指标都有一定的相关性6,11。我们将进一步进行IgVH基因突变与上述CLL指标的预后关系，以便共同评价预后，指导治疗。【参考文献】 1 Shanafelt TD, Geyer SM, Kay NE. Prognosis at diagnosis: integrating molecular biologic insights into clinical practice for patients with CLL. Blood, 2004;103:1202-1210 2 Chiorazzi N, Rai KR, Ferrarini M. Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med,2005;352: 804-8153 陈丽娟,李建勇. 慢性淋巴细胞白血病IgV(H)基因突变研究进展. 国外医学输血及血液学分册, 2003;26:155-1564 Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, et al. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood,1999;94:1848-18545 Damle RN, Wasil T, Fais F, et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood,1999;94:1840-18476 Montillo M, Hamblin T, Hallek M, et al. Chronic lymphocytic leukemia: novel prognostic factors and their relevance for risk-adapted therapeutic strategies. Haematologica,2005;90: 391-3997 张之南,沈悌. 血液病诊断及疗效标准. 第二版, 科学出版社. 北京: 1998: 228-2368 van Dongen JJM, Langerak AW, Bruggemann M, et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: Report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia,2003;17:2257-23179 Tobin G, Thunberg U, Johnson A, et al. Somatically mutated Ig VH3-21 genes characterize a new subset of chronic lymphocytic leukemia. Blood, 2002;99:2262-226410 Matthews C, Catherwood M, Morris TC, et al. Routine analysis of IgVH mutational status in CLL patients using BIOMED-2 standardized primers and protocols. Leuk Lymphoma, 2004; 45:1899-190411 vant Veer MB, Brooijmans AM, Langerak AW, et al. The predictive value of lipoprotein lipase for survival in chronic lymphocytic leukemia. Haematologica, 2006;91:56-63