1、第 53 卷 第 2 期2023 年 2 月Vol.53 No.2Feb.2023165 日 用 化 学 工 业(中英文)China Surfactant Detergent&Cosmetics Hydrolysed zinc hyaluronan,a novel anti-acne candidateFanChen1,JunYang2,SupingYang3,YueWu1,*(1.Department of Research and Development,Bloomage Biotechnology Co.,Ltd.,Shanghai 200000,China;2.BIOHYALUX Bu
2、siness Division,Bloomage Biotechnology Co.,Beijing 100000,China;3.Department of Research and Development,Bloomage Biotechnology Co.,Ltd.,Beijing 100000,China)Abstract:In this study,the effects of hydrolysed zinc hyaluronan(HA-ZN)on lipid production and skin hydration were revealed.The HaCaT and SZ95
3、 cell lines were applied to evaluate the toxicity and beneficial effect of hydrolysed zinc hyaluronan.Pro-acne agents,arachidonic acid was used to induce the lipid production of SZ95 and the effect of hydrolysed zinc hyaluronan was detected.At the same time,in vitro antibacterial experiment against
4、acne-related bacteria and the expression of skin hydration involved proteins were estimated.At the identical concentration of zinc ion,hydrolysed zinc hyaluronan exhibits less toxicity than zinc chloride,suggesting a higher safe dosage of zinc ion.In addition,hydrolysed zinc hyaluronan possesses the
5、 ability of alleviating lipid production in SZ95,as well as inhibiting the growth of Propionibacterium acnes and Malassezia furfur in vitro.The expression of AQP3 and HAS2 is also augmented in hydrolysed zinc hyaluronan treated group.The results indicate that hydrolysed zinc hyaluronan might be a pr
6、omising drug candidate against acne vulgaris,averting the side effects of existing drugs such as dry skin.Key words:acne vulgaris;skin hydration;zinc salt;hydrolysed zinc hyaluronanReceived:July 21,2022;Revised:February 1,2023.*Corresponding author.E-mail:.DOI:10.3969/j.issn.1001-1803.2023.02.006HAS
7、2AQP3HaCaT cellsSZ95 cellsHA-ZNLipidprodution50m166第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业(中英文)痤疮(Acne vulgaris)是最常见的皮肤疾病之一,以黑头、白头、粉刺、丘疹、脓疱、结节和囊肿为基本特征,好发于面部、颈部、上背部、肩部等区 域1。痤疮还会引起一系列的后遗症,例如色素沉着、疤痕等等,严重地影响患者的生理和心理健康,降低患者的生活质量2,3。痤疮的产生是多因素的,可由激素水平的改变、心理压力以及营养状况的改变等引起46。研究7表明,油脂的过度产生和其成分的改变是导致痤疮产生的主要原因之一。油脂是由皮脂腺分泌的非极性脂质
8、的混合物,其主要的生理作用是覆盖于皮肤表面,起到维持皮肤水分,保持体温的作用8。然而,当皮脂腺受到一些例如炎症因子、雄激素等因子的刺激时,会导致其功能亢进,从而产生过多的油脂,进而导致痤疮的发生9。同时,过多的油脂给有害菌群的定殖和繁殖提供了一定条件。而这些有害菌群(例如痤疮丙酸杆菌和马拉色菌)的代谢产物也会引起皮肤的免疫反应,刺激单核细胞和其他细胞释放例如IL-1,IL1-,IL-6,IL-8,IL-12,TNF-等炎症介质,导致痤疮进一步加重,引发恶性循环10。尽管治疗痤疮有许多高效的药物,例如异维甲酸等,但是它们都存在着一定的副作用4。比如使用异维甲酸治疗痤疮会导致唇炎和皮肤干燥的产生等
9、11,这可能是因为抑制了皮脂腺功能而导致的屏障功能受损。因此,开发一款安全、高效的治疗痤疮的化合物是极其重要的。锌作为辅因子参与了超过1 000种的生化反应,影响着细胞的生长和分化12。含锌的化合物通常被用作治疗皮肤疾病,尤其是抗痤疮的产品中。氯化锌软膏、氧化锌软膏常被作治疗痤疮,但因具有水溶性差的特点,所以其能添加的剂型较为局限。水解透明质酸锌(HA-ZN)是将透明质酸钠加入至含乙酸锌的乙醇置换液中,在一定pH条件下进行置换和水解反应,反应一定时间得HA-ZN粗品,随后进行洗涤、脱水、干燥即得HA-ZN产品。HA-ZN易于在水中分散,可应用的剂型范围较广。本文在人角质形成细胞系中比较氯化锌和
10、HA-ZN的细胞毒性,并通过构建花生四烯酸诱导皮脂腺细胞(SZ95)产生油脂的模型,模拟由炎症因子刺激而产生的痤疮,利用油红对SZ95细胞中产生的油脂进行染色,检测HA-ZN对油脂生成的影响。利用体外抑菌实验,检测HA-ZN对痤疮丙酸杆菌和糠秕马拉色菌的抑菌作用。同时,利用角质形成细胞(HaCaT)对HA-ZN的保湿功能进行检测。以期探究HA-ZN的控油保湿的功效及其可能存在的机理。1 实验部分1.1 主要材料、试剂与仪器油红染色试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司;DMEM培养基、胎牛血清,美国赛默飞世尔科技公司;异丙醇,上海泰坦科技股份有限公司;人皮脂腺永生化细胞(SZ95)、永生化人角质形
11、成细胞(HaCaT),青旗(上海)生物技术发展有限公司;花生四烯酸、噻唑蓝,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;HAS2 antibody、AQP3 antibody,英国Abcam公司;HA-ZN,华熙生物科技股份有限公司。DMi1型光学显微镜、DM2500 LED型荧光显微镜,水解透明质酸锌的抗痤疮功效研究陈 帆 1,杨 君 2,杨素萍 3,吴 越 1,*(1.华熙生物科技股份有限公司 上海护肤品研发中心,上海 200000;2.华熙生物科技股份有限公司 个人消费品事业群,北京 100000;3.华熙生物科技股份有限公司 研发中心,北京 100000)摘要:探究了水解透明质酸锌(HA-ZN
12、)在控油与保湿方面的体外生物活性。通过MTT法检测了不同质量浓度的HA-ZN对SZ95和HaCaT的细胞活性的影响,利用油红染色法检测HA-ZN对SZ95细胞内的油脂含量的影响,并且利用体外抑菌实验检测了HA-ZN的抑菌作用。同时,利用免疫荧光法检测HaCaT细胞中HAS2和AQP3表达的变化。结果表明,HA-ZN可以提升锌的安全用量。0.2 mg/mL和0.225 mg/mL的HA-ZN可以抑制SZ95细胞的油脂生成。5 mg/mL的HA-ZN可以抑制痤疮丙酸杆菌和糠秕马拉色菌的生长。同时,0.225 mg/mL的HA-ZN可促进HaCaT细胞表达HAS2和AQP3。HA-ZN具有较好的控油
13、,抑制痤疮相关的菌群的作用,同时具有一定的保湿效果,提示其具有一定的抗痤疮的功效。关键词:痤疮;皮肤保湿;锌盐;水解透明质酸锌中图分类号:TQ658 文献标识码:A 文章编号:1001-1803(2023)02-0165-06167第 2 期开发与应用陈 帆,等:水解透明质酸锌的抗痤疮功效研究 德国Leica公司;MULTISKAN Sky型酶标仪,美国赛默飞世尔科技公司。1.2 实验方法1.2.1 细胞毒性实验取HaCaT细胞或SZ95细胞用10%FBS DMEM培养基在T75的培养瓶里培养,待细胞密度约80%进行消化,接种于96孔板中,在37、5%CO2条件下培养备用。HA-ZN用水溶解、
14、ZnCl2用DMSO溶解后用2%FBS DMEM稀释至测试浓度。24 h后吸掉上清液,加入制备好的样品及对照组,每孔200 L。置于37、5%CO2培养箱孵育24 h。吸弃上清,使用PBS洗一遍,每孔加入200 L质量浓度为0.5 mg/mL的MTT溶液孵育3 h。孵育完毕,弃上清,加入100 L DMSO,于550 nm处测定OD值。通过以下公式计算细胞活力(Cell viability):1.2.2 油红染色测定细胞内脂质含量取SZ95细胞用10%FBS DMEM培养基在T75的培养瓶里培养,待细胞密度约80%进行消化,接种于24孔板种,在37、5%CO2条件下培养备用。24 h后吸掉上清
15、液,加入制备好的样品及对照组,每孔1 mL,同时每孔加入50 mol/L的花生四烯酸。置于37、5%CO2培养箱孵育48 h。吸弃上清,使用PBS洗一遍,每孔加入300 L 4%的多聚甲醛固定15 min。弃上清,PBS洗一遍,使用油红染色试剂盒对细胞进行染色,染色完毕置于显微镜下拍照。然后使用异丙醇溶液溶解细胞内被染色的油脂,于500 nm处测定OD值。通过以下公式计算相对脂质含量(Lipid content):1.2.3 HA-ZN抑菌功效测试本实验方法参考QB/T 27382012日化产品抗菌抑菌效果的评价方法。根据使用菌种的不同配制相应的培养基,然后灭菌。在无菌环境中,分别取糠秕马拉色
16、菌和痤疮丙酸杆菌的24 h新鲜斜面培养物,用灭菌后的PBS冲洗后制备两种菌悬液备用,菌悬液要求浓度为:取0.1 mL菌悬液滴于5.0 mL PBS中,回收菌数为11049104。将HA-ZN使用无菌PBS稀释至5 mg/mL备用。吸取5 mg/mL HA-ZN溶液5.0 mL,放入灭菌试管中,20 恒温5 min。吸取菌悬液0.1 mL加入含5.0 mL样品的试管中,迅速混匀,并计时2,4和8 h。作用至设定时间后,取混合液0.5 mL加入含对照组OD值-溶剂对照OD值样品组OD值-溶剂对照OD值细胞活力(%)=100%对照组OD值-溶剂对照OD值样品组OD值-溶剂对照OD值相对脂质含量(%)
17、=100%4.5 mL灭菌后的PBS的试管中,充分混匀。放置10 min后,吸取混合液1.0 mL置于灭菌后的平皿内,两种菌和3个时间均接种2个平行平皿。用凉至4045 的琼脂培养基15 mL作倾注,转动平皿使其充分混匀,待琼脂凝固后翻转平皿,根据菌种的培养温度置于恒温培养箱中,培养48 h后做活菌菌落计数。使用PBS代替样品,同时按以上步骤操作,作为对照样品。实验重复3次,求平均值后计算抑菌率。式中:表示对照样品平均菌落数;表示试验样品平均菌落数。结果判定:抑菌率50%90%,判有抑菌作用;抑菌率90%,判有较强抑菌作用。1.2.4 荧光染色实验取HaCaT细胞用10%FBS DMEM培养基
18、在T75的培养瓶里培养,待细胞密度约80%,接种于带有盖玻片的24孔板,在37、5%CO2条件下培养备用。24 h后吸掉上清液,加入制备好的样品及对照组。置于37、5%CO2培养箱孵育72 h,吸去上清液,使用PBS漂洗细胞两遍,使用冰甲醇于-20 下固定细胞,接着加入HAS2和AQP3一抗4 孵育过夜,第二天用PBS洗3遍,加入相应二抗后避光室温孵育1.5 h,用抗荧光衰减封片剂(含DAPI)封片,随后在荧光显微镜下观察拍摄照片。用Image J软件定量分析照片的荧光数据,得到平均荧光强度Mean值。通过以下公式计算相对荧光强度(Normalized intensity):1.2.5 数据分
19、析用Graphpad Prism绘图软件进行图片处理,结果表示为“MeanSD”。组间比较采用t检验,*p0.05表示有统计学差异,*p0.01表示有显著性统计学差异,*p0.001表示有极其显著的统计学差异。2 结果与讨论2.1 HA-ZN的细胞毒性Abendrot等13对比了氯化锌,葡萄糖酸锌等锌盐在HaCaT细胞上的细胞毒性,其中氯化锌的毒性较小。因此,本研究中,在HaCaT细胞中通过MTT检测法对比了HA-ZN和氯化锌的细胞毒性。HA-ZN和氯化锌对SZ95细胞和HaCaT细胞的活性影响如-抑菌率(%)=100%对照组Mean值样品组Mean值相对荧光强度(%)=100%168第 53
20、 卷开发与应用日 用 化 学 工 业(中英文)图1所示。当细胞活性小于80%时被定义为有细胞毒 性14。如图1A所示,横坐标为HA-ZN或ZnCl2中锌元素质量浓度的对数值,纵坐标为细胞活力,在锌元素的质量浓度一致的情况下,氯化锌的最大无毒剂量低于HA-ZN,根据曲线以锌元素质量浓度计算IC50值,得出HA-ZN和ZnCl2的IC50分别为和35.479 6 和13.610 2 g/mL。说明HA-ZN具有更高的安全使用 剂量。同时,检测了HA-ZN在SZ95细胞中的细胞毒性。如图2B所示,HA-ZN在质量浓度为1 mg/mL时对SZ95细胞具有一定的毒性,在质量浓度小于等于0.25 mg/m
21、L 时,无细胞毒性。2.2 HA-ZN抑制花生四烯酸诱导的SZ95细胞分泌皮脂的作用痤疮发病的最显著特征之一就是皮脂的过度产生。为了模拟这一过程,本文利用前炎症因子花生四烯酸(AA)来刺激SZ95细胞内的油脂生成4,15。图1 HA-ZN对HaCaT和SZ95细胞的毒性作用Fig.1 The effects of HA-ZN on cell viability of SZ95 and HaCaT cells结果显示,0.2和0.225 mg/mL的HA-ZN均能显著抑制AA诱导的SZ95细胞内的油脂生成(图2A)。同时通过油红染色观察胞内的脂滴产生情况,棕红色圆形液滴即为被染色的脂滴。我们发现
22、,在HA-ZN处理后,SZ95胞内脂滴变小,说明HA-ZN可以减少皮脂腺细胞的终末分化,抑制其油脂的释放16(图2B)。2.3 HA-ZN对痤疮丙酸杆菌和糠秕马拉色菌的抑制作用皮肤上寄生着数百种微生物,它们占据不同的皮肤环境龛位,形成不同的群落17。当正常菌群受到干扰或宿主免疫防御减弱时,机会性微生物可能会引发或加重某些皮肤病18。痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)是引起痤疮的病原菌之一。痤疮丙酸杆菌通过影响皮脂腺的活性,促进粉刺的形成和引发宿主的免疫反应来引起痤疮的产生。马拉色菌(Malassezia)被认为是引起痤疮的另一种致病 菌19。研究表明,在使用抗真菌药
23、物后,患者的200150100*500HA-ZNABZnCl21501005000.51.0lg(Zn)/(g/mL)(HA-ZN)/(mg/mL)1.52.02.51.000 00.250 00.062 50.015 6对照组细胞活力/%细胞活力/%50 mol/L AA(HA-ZN)/(mg/mL)-+0.2+-+0.22550 mol/L AA(HA-ZN)/(mg/mL)50mB图2 HA-ZN对SZ95细胞内脂质含量的影响Fig.2 Inhibitory effect of HA-ZN on AA-induced lipid production in SZ95 cells15010
24、0500*A50 mol/L AA+-(HA-ZN)/(mg/mL)-0.20.225相对脂质含量/%169第 2 期开发与应用陈 帆,等:水解透明质酸锌的抗痤疮功效研究 痤疮有明显的减少20。因此,马拉色菌可能是难治性痤疮产生的主要原因之一。糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)在痤疮,尤其是丘疹脓疱型痤疮皮损中有较高的感染率21。通过体外抑菌实验,考察了5 mg/mL的HA-ZN对痤疮丙酸杆菌和糠秕马拉色菌的抑菌作用。结果显示(图3),HA-ZN对痤疮丙酸杆菌和糠秕马拉色菌具有明显的抑制作用。2.4 HA-ZN增加HaCaT中HAS2和AQP3含量的作用在分泌正常的情况下,油脂
25、的主要作用是覆盖在皮肤表面以防止皮肤水分散失22。而大多数的抗痤疮的药物其作用机制都为抑制皮脂腺的功能而减少油脂的分泌,因此它们通常会导致干性皮肤的产生23。因此,使用了细胞免疫荧光实验来检测HA-ZN处理后HaCaT中保湿相关的标志物:水通道蛋白3(AQP3)和透明质酸合成酶2(HAS2)的表达。内源性透明质酸是表皮层中最主要的糖胺聚糖,它是表皮层中主要结合水分、储存水分的物质24。内源性透明质酸的含量增加则可以侧面反应表皮层水合能力的增加。HAS2是皮肤中最主要的透明质酸合成酶,参与大片段的透明质酸合成。同时,由于表皮层没有毛细血管,因此水分及营养物质的运输主要依赖于一些细胞膜表面的受体。
26、水通道蛋白(AQP),是表皮细胞运送水分的细胞膜表面受体。AQP3是皮肤中最主要的水通道蛋白25。因此,检测以上两个标志物在HaCaT细胞中的表达,可以在一定程度上反应表皮的保湿能力。图4A,B和C,D分别为HaCaT细胞中AQP3和HAS2的含量和荧光显微镜照片。由图4可知,在加入图3 HA-ZN的体外抑菌实验Fig.3 The inhibition effect of HA-ZN on microorganism in vitro抑制率/%0248020406080Malassezie furfurPropionibacterium acnes时间/hHA-ZN后,HaCaT细胞中HAS2
27、和AQP3的含量均显著上升,提示HA-ZN可以提升表皮的保湿能力。图4 HA-ZN对HaCaT细胞中AQP3和HAS2含量的影响Fig.4 Th e augmented expression of AQP3 and HAS2 in HaCaT cells by HA-ZN0.225 mg/mL HA-ZN对照组50mD200AbCd*1501005000.225 mg/mL HA-ZNAQP3对照组对照组0.225 mg/mL对照组相对荧光强度/%200AbCd*1501005000.225 mg/mL HA-ZN0.225 mg/mLAQP3对照组对照组0.225 mg/mL对照组相对荧光强
28、度/%200*1501005000.225 mg/mL HA-ZNHAS2对照组相对荧光强度/%对照组0.225 mg/mL HA-ZN50mB3 结论HA-ZN可能具有保湿,抗痤疮的功效。HA-ZN相较于ZnCl2而言,具有更高的安全使用剂量,且其水溶性较好。HA-ZN能抑制花生四烯酸诱导的皮脂腺的油脂生成,抑制痤疮丙酸杆菌和糠秕马拉色菌的生长,可能具有一定的控油,抗痤疮的作用。同时,HA-ZN能增加角质形成细胞中水通道蛋白3和透明质酸合成 170第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业(中英文)酶2的含量,可能起到一定的促进表皮水合的作用。HA-ZN可以作为控油,抗痤疮的活性物添加于化
29、妆品中。但HA-ZN抑制油脂生成的分子机制尚不清楚,还需进行进一步的研究。参考文献:1 Sitohang I B S,Yahya Y F,Simanungkalit R,et al.Efficacy and tolerability of topical nicotinamide plus antibacterial adhesive agents and zinc-pyrrolidone carboxylic acid versus placebo as an adjuvant treatment for moderate acne vulgaris in indonesia:a multi
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