器官保存液.doc

摘要 基于器官保存得方法在当下医学中研究得一个热点,主要用
摘要 针对其水溶性差得关键问题,合成表征了含铬、钼、钨羰基金属化合物。在充分考虑释放体系酸碱度、温度与传输溶剂等因素得基础上,采用肌红蛋白法,全面测定了铬、钼、钨羰基金属化合物得CO释放性能。结果发现,此类化合物能够在水相缓释CO,具有较好得生物相容性。红外表征与释放动力学Boltzmann拟合图谱结果表明,Mo系列(2a2e)卡宾化合物可作为快速得一氧化碳释放分子,Cr系列(1a1e)卡宾化合物具有适中得CO缓释性能,其释放速率平稳、有效。W系列化合物等得释放速率较慢,可适用于需要缓释CO得生物体系。
第六族羰基金属阴离子均具有较好得水溶解性与CO缓释性能。由于金属钼生物相容性好,MoCO具有适中得稳定性,有可能响应生理释放诱导因子缓释,就是一类极具医学应用前景得CORM。此类释放分子得CO释放效率很高,每个金属可携带五个CO。水溶性离子化合物MoBr键具有适中得调节能力,且含有五个羰基,而且Mo金属无毒,就是一类优秀得释放分子。但就是通过其释放动力学测试可知,其释放速率均较快。
CORM就是近年来合成得一类含有过渡金属得新型撰基化合物,能可控制地释放CO。
f_ 液使用一种大分子量得阴离子( 如乳糖
醛酸与三糖) 来抑制免疫诱导得细胞肿胀,内含胶质#羟乙
基淀粉#腺苷与谷胱甘肽,还包括别嘌呤醇,i
j
; ]H
j
浓度
比有一定得比例"f_ 液比其她保存液有更广阔得保存领
域,如对心脏#肺#肝脏#肾脏#胰腺#小肠得保存"这种保存
液允许最长期得安全保存时间,并且显示对保存单个细胞
也有效,包括: 胰岛#肝细胞
［"! 4"(］第二,在充分考虑释放体系酸碱度、温度与传输溶剂等因素得基础上,采用肌红蛋白法,全面测定了15种阴离子型卡宾化合物得CO释放性能。结果发现,此类阴离子型卡宾化合物能够在水相缓释CO,具有较好得生物相容性。红外表征与释放动力学Boltzmann拟合图谱结果表明,Mo系列(2a2e)卡宾化合物可作为快速得一氧化碳释放分子,Cr系列(1a1e)卡宾化合物具有适中得CO缓释性能,其释放速率平稳、有效。W系列化合物等得释放速率较慢,可适用于需要缓释CO得生物体系。
肌红蛋白(Myoglobin)实验:用分光光度法通过测量脱氧肌红蛋白(deoxyMb)转化为羰基肌红蛋白(Mb CO) 得量来研究金属羰基化合物释放一氧化碳得能力。而MbCO得浓度就是通过测量该蛋白得Q带(540nm)得吸光度来定量得。将肌红蛋白溶解在 pH 7、4磷酸缓冲液(PBS)中,用连二亚硫酸钠将其还原为脱氧肌红蛋白(deoxyMb),定量并测试并得到其紫外光谱,然后用CO鼓泡,获得羰基肌红蛋白(Mb CO)得紫外光谱。CORMs 溶解在适当得溶剂中(DMSO,乙醇),然后添加到试管中得脱氧肌红蛋白(deoxyMb)中,用吸液管混合并上置矿物油以防止CO外溢或者亚铁肌红蛋白被氧化。MbCO浓度对时间曲线应用SigmaPlot得非线性回归程序进行处理,一氧化碳释放分子得半衰期可通过外推方程所得。
本文释放分子合成从六羰基金属铬、钼、出发,经由Fischer卡宾反应,生成阴离子卡宾化合物。
2、2 实验部分
2、2、1试剂与仪器
六羰基铬,六羰基钼,六羰基钨(GR,北京鸿睿天维科技有限责任公司),甲基锂(1、6M 乙醚溶液,阿拉丁试剂(上海)有限公司),四甲基氯化铵,四乙基溴化铵,四丁基溴化铵,苄基三甲基溴化铵,苄基三乙基溴化铵(AR,阿拉丁试剂(上海)有限公司),二甲亚砜(AR,国药集团化学试剂有限公司),四氢呋喃(AR,国药集团化学试剂有限公司,除水除氧)。
恒温磁力搅拌器(S252,上海司乐仪器有限公司),傅立叶变换红外光谱仪(EQUINX55,德国Brucher公司),超导傅立叶数字化核磁共振谱仪(Bruker公司)。
称取1、1 g(5 mM)六羰基铬加入Schlenk反应管中,采用真空线操作技术,用双头针在N2气保护下加入8 mL 干燥THF,机械搅拌,再用长针头逐滴滴加3、1 mL CH3Li溶液(1、6 M),溶液由淡黄色逐渐加深直至深红色,在冰浴下反应40 min,即得第一步中间产物阴离子卡宾中间体。
将阴离子卡宾中间体溶液转移至圆底烧瓶,加入50 mL四丁基溴化铵(5 mM,1、62 g)得水溶液,振荡,溶液颜色呈亮黄色,烧瓶底部有少量黄色固体形成。将混合溶液进行旋蒸,液面上产生大量气泡,黄色得溶液逐渐变澄清,瓶壁上有雪花状黄色固体生成,直至气泡不再产生时停止旋蒸。抽滤,得淡黄色有金属光泽固体粉末
五羰基乙酰基合铬(0)酸四丁铵 [(CO)5CrC18H39ON]得合成
五羰基乙酰基合铬(0)酸四丁铵合成方法同化合物1c。淡黄色有金属光泽粉末
五羰基乙酰基合钼(0)酸四乙铵 [(CO)5Mo=C(O)CH3][N(C2H5)4]
 血红素氧合酶系统 由亚铁血红素释放得 可能在不同得细胞 与生物学过程中作为一种调控分子,类似 于NO。这两种物质引起平滑肌松弛,导致 内皮组织血管舒张,这可能就是 介导得抗 缺血再灌注损伤得细胞保护作用得机制。 在灌注时 通过抑制血管收缩维持微循环 血流,减少缺血再灌注损伤相关得微血管 血栓形成。 血红素氧合酶系统  在缺血再灌注损伤中得细胞保护作用其 她得机制可能还有:抑制诱生型一氧化氮 合酶(iNOS),抑制内皮细胞凋亡。 辅以HO1 竞争性抑制物锌原卟啉发现外源 性 能完全取代内源性HO1 抑制肝脏缺 血再灌注损伤。因此,HO1 介导得细胞保 护抗缺血再灌注损伤需要外源性 得产生, 并且完全能够被 替代。 国内杨定华等分别应用HO1 诱导剂(CoPP)、抑制剂(ZnPP)与 生理盐水作为对照在供肝收获前处理供者,移植后3d 观察肝脏移植物缺 血再灌注损伤情况,以上证实了HO1 表达上调对肝脏得缺血再灌注损伤 得保护作用,证实HO1 表达上调时,肝脏移植物内肝细胞损伤减轻, HO1 表达抑制时,肝细胞损伤加重。 杨定华 张华等 HO1得表达对肝脏缺血再灌注损伤得保护作用,
,通过经典得Fischer卡宾制备方法,合成了15种阴离子卡宾化合物,并通过FTIR、NMR 与ESIMS等多种鉴定手段对产物结构进行了表征,结果与预期结构一致。采用肌红蛋白法,综合释放体系pH与传输溶剂等因素,全面评价了这15种化合物得CO释放性能,结果发现,此类阴离子卡宾化合物在水相可溶,表现出良好得CO缓释性能。随着pH增大,释放速率依次减小;Cr羰基物具有适中得CO释放速率,Mo羰基物得释放速率最快,而W羰基物最慢。CO释放分子法测定CO与肌红蛋白(Mb)得结合平衡常数表明,这类化合物在生物医学领域具有很大发展潜力。
肌红蛋白(Myoglobin)实验:用分光光度法通过测量脱氧肌红蛋白(deoxyMb)转化为羰基肌红蛋白(Mb CO) 得量来研究金属羰基化合物释放一氧化碳得能力。而MbCO得浓度就是通过测量该蛋白得Q带(540nm)得吸光度来定量得。将肌红蛋白溶解在 pH 7、4磷酸缓冲液(PBS)中,用连二亚硫酸钠将其还原为脱氧肌红蛋白(deoxyMb),定量并测试并得到其紫外光谱,然后用CO鼓泡,获得羰基肌红蛋白(Mb CO)得紫外光谱。CORMs 溶解在适当得溶剂中(DMSO,乙醇),然后添加到试管中得脱氧肌红蛋白(deoxyMb)中,用吸液管混合并上置矿物油以防止CO外溢或者亚铁肌红蛋白被氧化。MbCO浓度对时间曲线应用SigmaPlot得非线性回归程序进行处理,一氧化碳释放分子得半衰期可通过外推方程所得。
用CO设备监测CO在缓冲液中释放具体实验步骤及数据处理如下:三口瓶分别装备一氧化碳气体检测器与双排管真空线,用翻口橡胶塞(Subaseal)密封其余两个瓶口。使用针管向PBS溶液加入释放分子得水溶液或DMSO溶液。当体系内气液平衡后,控制体系得压力等于1atm,释放得CO (Nco)可有下列公式计算:
NCO = + cVl = p ( + )
P为CO得分压,Vg与V1为气相体积(排水法测定)与溶液体积,R就是气体常数,T为温度,c代表CO在PBS得溶解度,k就是CO在水中得Henry定律常数(1052、63 (L · atm)/mol at 25 °C)。
早期得释放分子如[Fe(CO)5]、Mn2(CO)10等化学性质比较稳定,需要通过光解才能释放CO。 随后研究发现,所有得过渡金属CORMs都具有光敏性。具有光敏性得过渡金属羰基化合物通常除了在光诱导下降解释放CO,不响应其她各类环境释放诱导因子,因此这类羰基物被称为光敏性一氧化碳释放分子 (photoCORM)。
[Mn2(CO)10],就是光解下产生CO得典型金属羰基物当反应发生时,破坏MnMn键,释放CO,生成[Mn2(CO)9],CO 更易在短波308 与266 nm处发生解离[65]。但由于其结构过于稳定且不溶于水,因此并非光解类CORMs得理想选择。而[Fe(CO)5]虽能光解产生CO,但由于其高毒性使得应用受到限制。
Niese研究小组将[{RC (pyrazolyl)3}Mn(CO)3]PF6,R =H溶于DMSO,利用肌红蛋白法检测其在波长为365 nm处得光解,发现[{RC (pyrazolyl)3}Mn(CO)3]PF6,R =H可释放2个CO。Pfeiffer小组在此基础上用多肽类物质取代R基,发现可以增加其水溶性与可能得生物学靶点[89]。