植物氨态氮测定.doc

植物组织氨基酸含量得测定(改良得茚三酮比色法）
一、实验原理
　 植物吸收得氮主要就就是氨态氮与硝态氮,后者经过还原过程形成氨,前者经同化后形成谷氨酰胺与谷氨酸,然后形成其她氨基酸与蛋白质。测定氨态氮得方法有多种，本实验为改良得茚三酮比色法。
α-氨基酸与水合茚三酮溶液一起加热,经氧化脱氨变成相应得α－酮酸，酮酸进一步脱羧变成醛，水合茚三酮则被还原,在弱酸环境中，还原型茚三酮，氨与另一分子水合茚三酮反应,缩合生成蓝紫色物质。根据蓝紫色得深浅,在580nm波长下测定吸光值。本实验中在茚三酮试剂中添加乙二醇并补加正丁醇与丙醇,可以克服茚三酮得不稳定性。
二、仪器设备
研钵、烧杯、漏斗、量筒、具塞试管、三角瓶、容量瓶、移液管、天平、沸水浴锅、可见分光光度计
三、试剂
1、 10％醋酸(10０mＬ)
2、　1% 抗坏血酸(100ｍL)
3、 5μg/mL　亮氨酸或丙氨酸溶液(0.０0５g定容至1０00mL）
4、　ｐH5、４醋酸缓冲液：８、8mL　0、2ｍoｌ/Ｌ 醋酸(冰醋酸11、5５mL稀释至１00０mL)加41、２ｍL ０、2mol/Ｌ醋酸钠(醋酸钠16．4g或三水醋酸钠27.2g 配成1０00mL）。
5、 水合茚三酮试剂：１.1g茚三酮放到烧杯中,加入15ｍＬ正丙醇，摇匀，溶解,后加入30ｍl正丁醇与6０ｍl乙二醇,混匀,再加9ｍL pH5、4醋酸缓冲液,混匀。保存于棕色瓶中,冰箱保存,适用期限1０天。
四、操作步骤
1、　 标准曲线得绘制
以下表所示量从5μg/mL 亮氨酸或丙氨酸溶液中分别取溶液并在每个试管中加蒸馏水至2mL,对照仅加2mL 蒸馏水,后在各试管中加入３mＬ　水合茚三酮试剂与0、１mL 1%抗坏血酸,摇匀。盖上试管塞，于沸水中加热15分钟，取出后搅拌冷却15分钟。冷却后得有色溶液中加无水乙醇至１0mL,在波长５8０ｎm 处测吸光值,以氨态氮浓度（μｇ／mL)为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
试管号 　 　１ 　 　 2 3 　 　　 4　　　 5 　 　６ 　　　 ７
试剂（mL）　 　0　　 　 　0、２ 　 0、４ 　　 0、8 　　　 １、2 　 　1、6 　 １、８
氨态氮浓度 　　 0 　　 　 　０、５ 　　１ 　 　　 　２ 　 3　　 　　 4 　 　　 ５
(μg/mL)
2. 称取０.5g 新鲜植物材料，放入研钵中,加入５mL　10%醋酸,研磨后以蒸馏水稀释至1０0mL ,混匀,通过滤纸过滤,弃去最先滤下得一部分滤液后过滤到10０mＬ三角瓶中。
3. 从剩下得滤液中取２mＬ　放入试管中，加3mL 水合茚三酮试剂与０、1mL 1％抗坏血酸,摇匀。盖上试管塞,于沸水中加热15分钟。同时将盛有对照溶液(提取液用蒸馏水代替)得试管加热。
4. 取出后搅拌冷却15分钟。加热形成得红色茚三酮试剂被氧氧化而褪色,茚三酮与氨基酸形成得蓝紫色反应产物仍然存留并变得更加鲜明。冷却后得有色溶液中加无水乙醇至10mL ，混匀。在波长58０nm 处测光密度值,根据标准曲线查得数值代入以下公式计算氨态氮含量。
（10-6×10０×Ｃ)
X(１00g　样品中得氨态氮毫克数）= 　　　 　 　 　 　　×100
　　 n
C:比色液中氨态氮浓度(μg/ｍL)
n：样品重量(ｇ)
1０0：分析溶液总体积(ｍL）
5、实验结果与分析
氨态氮含量标曲:
序号
１
2
3
4
5
6
7
氨态氮浓度
0
０、5
1
２
3
４
５
OD值
0、15２
0、2３7
0、31８
0、41５
0、48４
0、607
0、７１8

方程:ｙ=0、10７3X+０、１81
测定样品液得OD580值为:０、939 　
标曲查得：0、　939＝0、１073Ｃ－0、１81 　 C=１0、3８μg/ｍL
(０、1×1０×10、38μｇ／ｍL)

X(100ｇ 样品中得氨态氮毫克数）＝　 　 　 　 　　 　 ×1０0=１0、３8mg/100g
(２×0、5）
故:该植物中氨态氮得含量为10、３8mg/100g。