不同初始浓度的单增李斯特菌在营养肉汤中生长预测模型的建立.pdf

173不同初始浓度的单增李斯特菌在营养肉汤中生长预测模型的建立萨仁高娃1，胡文忠2，*，高春红2，姜爱丽2，冯可3，马杰4(1.大连工业大学食品学院，辽宁大连 116034;2.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连 116600;3.大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁大连 116024;4.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州 730070)摘要:研究环境温度和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes LM)悬浮液初始浓度对 LM 生长的影响，实验设计 4、26和 36三种温度、102、103、104cfu/mL 三种 LM 初始浓度，建立了 LM 在营养肉汤中的生长预测模型。采用 Matlab 软件拟合不同初始浓度的 LM 悬浮液在不同温度下的 Gompertz 和 Logistic 模型，获得了相应的模型参数，即最大比生长速率(U)、延滞期(LPD)和最大细胞密度(MPD)。结果表明:运用 Gompertz 模型拟合较好，相关系数均在 0.98 以上。温度越高，LM 生长越迅速，延滞期越短，最大细胞密度越大;相同温度下，最大比生长速率随着初始菌浓度的增加而减小，4下的延滞期随着初始菌浓度的增加而延长，而 26、36下的延滞期随着初始菌浓度的增加而缩短，初始菌浓度对最大细胞密度没有明显影响。关键词:单增李斯特菌，温度，浓度，预测模型Predictive modeling of the growth ofListeria monocytogenes on nutrient brothSA EN Gaowa1，HU Wenzhong2，*，GAO Chunhong2，JIANG Aili2，FENG Ke3，MA Jie4(1.College of Food Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China;2.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China;3.College of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024，China;4.College of Food Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China)Abstract:Predictive growth models of Listeria monocytogenes on nutrient broth were established，in order toinvestigate the effect of temperature and initial concentration of L.monocytogenes suspension on the growth of L.monocytogenes.We chose different temperatures(4，26，and 36，respectively)as incubation temperature andconcentration(102，103and 104cfu/mL，respectively)as initial concentration in this research.Gompertz model andLogistic model was used to fit the growth curve by Matlab software.The corresponding parameters from themodels，such as maximum specific growth rate(U)，lag phase(LPD)，and maximum population density(MPD)，were obtained from above two models.The result demonstrated that the curves fitted by Gompertz model showed ahigh correlation at all temperature and initial concentration(2 0.98).There was a positive correlation betweentemperature and the growth rate of L.monocytogenes.The lag phase was negative correlated with the maximumpopulation density.The U value decreased as the initial concentration increased at the same temperature.At 4 thelag phase extended as the initial concentration increased，while lag phase shorten as the initial concentrationincreased under the both of 26 and 36.The initial concentration was not significant influence on the maximumcell density at all temperatures.Key words:Listeria monocytogenes;temperature;concentration;predictive modeling中图分类号:TS201.3文献标识码:A文 章 编 号:10020306(2013)17017304收稿日期:20130128*通讯联系人作者简介:萨仁高娃(1987)，女，硕士研究生，研究方向:食品科学。基金项目:国家科技支撑计划项目(2012BAD38B05);国家自然科学基金项目(31172009);大连市科技计划项目(2012E13SF106);大连市金州新区科技计划项目(2012A1049)。单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes，LM)是一种常见的人畜共患的食源性致病菌，能引起人畜的李斯特菌病1，广泛存在于自然界的土壤、水、植物和反刍动物、人的粪便中，这种菌主要通过污染畜禽产品、蔬菜等食物而引起人类感染致病。由于该菌在 4下的环境中仍可生长与繁殖，冷藏食品成为174引发食 源 性 疾 病 的 主 要 病 源2。预 测 微 生 物 学(predictive microbiology)是一门结合微生物学、化学、数学、统计学和应用计算机技术的交叉性学科，它采用数学的方法描述不同环境条件下，细菌数变化和外部环境因素之间的响应关系，并对微生物的生长动力学做出预测3。国外根据预测微生物学开发了多种预测模型软件，其中，PMP(Pathogen ModelingProgram)是由美国农业部农业研究所开发的关于食品中微生物的生长预测软件，操作简捷，可用作微生物预测模型数据比较分析。目前，我国初步建立了LM 的生长预测模型，大多数简单建立 LM 在营养肉汤、冷鲜畜禽肉及其制品上的生长预测模型。国外研究较广泛，建立了 LM 在畜禽及其制品，水产品和乳制品上的生长模型，近几年国外多次暴发因果蔬被 LM 污染而引起的食源性疾病，因此开始建立 LM在新鲜果蔬(如西瓜、木瓜4、卷心生菜5、芦笋6 等)上的生长预测模型。虽然研究范围扩大，但国内外对初始浓度对单增李斯特菌生长的影响较少。本研究旨在建立不同温度下不同初始浓度 LM 在营养肉汤中的生长预测模型，探究温度和 LM 初始浓度对生长的影响。1材料与方法1.1材料与仪器菌株LM 标准菌株来自辽宁省疾病控制中心;牛津琼脂(OXA)基础青岛海博生物技术有限公司，取 5.85g OXA，加热溶解于 100mL 蒸馏水中，121高压灭菌 15min，冷至 50时，加入 1 支牛津琼脂添加剂(多粘菌素 E 2mg、放线菌酮 40mg、吖啶黄素 0.5mg、头孢双硫唑甲氧 0.2mg、磷霉素 1mg)，混匀，倾入无菌平皿，备用;营养肉汤(NB)青岛海博生物技术有限公司，称取 18.0g NB，加热溶解于1000mL 蒸馏水中，分装三角瓶或试管，121 高压灭菌 15min，备用;含 0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA YE)青岛海博生物技术有限公司，称取51.0g TSAYE，加热溶解于 1000mL 蒸馏水中，121高压灭菌 15min，倾入无菌平皿，备用;实验用水均为蒸馏水。1300 系列 A2 型二级生物安全柜美国 ThermoFisher Scientific 公司;H40IIA2 二级生物安全柜青岛海尔特种电器有限公司;MLS3020 全自动高压蒸汽灭菌器日本 SANYO 公司;PL2002 分析天平瑞士 METTLE TOLEDO 公司;Acolsuper 全自动菌落计数仪英国 synbiosis 公司;DNP9052 电热恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司;HYC326A医用冷藏箱青岛海尔特种电器有限公司;YLE1000 电热恒温水浴锅北京东方精瑞科技发展有限公司。1.2实验方法1.2.1原菌液的制备在无菌室的生物安全柜里以无菌操作取 TSAYE 斜面上的标准菌株，在 TSAYE无菌平板上平行划线，36 培养 2448h 活化，挑取单菌落接种于含有 150mL 无菌 NB 的三角瓶中，充分混匀，将三角瓶放入 36 培养箱，培养 2448h 至初始菌落数大致为 105cfu/mL，即原菌液，4 保存备用。1.2.2营养肉汤中 LM 计数在无菌室中以无菌操作将原菌液充分混匀，取 10mL 加入到 90mL 无菌营养肉汤中，制得菌液浓度大致为 104cfu/mL，再从 104cfu/mL 中取 10mL 菌液加到 90mL 无菌营养肉汤中，制得菌液浓度大致为 103cfu/mL，同样方法，将菌液梯度稀释 102cfu/mL。将三个稀释度的菌液均放入36培养，每隔 2h 将三个稀释度菌液取出，摇匀后用涂布平板培养法7 计活菌数，平板用全自动菌落计数仪分析计数，重复三次。按下列公式计算每毫升样品中的含菌量:每毫升样品中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度 3 次重复的平均菌落数 稀释倍数 10。同样方法将原菌液稀释成 104、103、102cfu/mL 三个稀释度，分别放入 4 和 26 培养，用平板涂布培养法计数。其中 4 每隔 24 或 48h 取一次计数，26每隔 5h 取一次计数。1.2.3初级模型构建初级模型利用 Matlab 软件建立 Gompertz 模型和 Logistic 模型，选择最合适的模型得出不同浓度 LM 菌悬液在不同温度下的生长曲线，并得到相应的初级模型参数。生长曲线和模型参数均与 PMP 预测软件进行比较。Gompertz 模型:Nt=A+Cexp(exp(B(tM)式(1)Logistic 模型:Nt=A+C/(1+exp(4B/C(Mt)+1)式(2)U=BC/e式(3)LPD=M1/B式(4)MPD=A+C式(5)式中:t 表示时间(h)，Nt表示 t 时的菌数，A 表示初始菌数 N0(lg cfu/mL)，C 表示最大菌数 Nmax与初始菌数 N0的差值(lg cfu/mL)，B 为在时间点 M 时的相对最大生长速率(h1)，M 表示达到最大生长速率所需的时间(h)，U 表示微生物生长的最大比生长速率(lg cfu/mL h)，LPD 表示微生物生长的延滞期(h)，MPD 表示微生物生长的最大细胞密度(lg cfu/mL)，e=2.71828。2结果与讨论2.1LM 在营养肉汤中生长的初级模型的选择不同浓度 LM 菌悬液的 Gompertz 模型在不同温度下的拟合很好，相关系数均在 0.98 以上，Logistic模型拟合也较好，均在 0.96 以上，结果见表 1。结果显示，不同浓度 LM 菌悬液在不同温度下的生长情况均能用 Gompertz 模型描述，因此选用 Gompertz 模型建立初级模型。2.2不同温度下不同浓度 LM 在营养肉汤中的生长曲线4下，Gompertz 模型拟合的不同浓度 LM 在营养肉汤中的生长曲线见图 1。可以看出，初始菌浓度越低，菌的延滞期越短，较快进入对数期，随着初始菌浓度的增高，曲线趋于平缓，则延滞期时间增加。初始菌数为 102、103cfu/mL 的生长曲线分别在约 26、28h 后进入对数期。对数期 LM 的生长速率随着初175表 1不同浓度 LM 菌悬液的 Gompertz 模型和 Logistic 模型在不同温度下的相关系数(2)Table 1The correlation coefficients(2)of Gompertz model and Logistic model of the growth ofL.monocytogenes under different temperatures and initial concentrations温度()42636浓度(cfu/mL)102103104102103104102103104Gompertz 模型0.98050.99350.99070.99040.98740.99830.99680.99610.9835Logistic 模型0.96400.98820.99050.98880.98690.99500.99620.99220.9628始菌浓度的增加而减慢。最大菌体密度达到约104cfu/mL。图 14下 Gompertz 模型拟合的不同浓度 LM 在营养肉汤中的生长曲线Fig.1Gompertz model curve of the growth of L.monocytogeneson nutrient broth under different concentrations at 426下，Gompertz 模型拟合的不同浓度 LM 在营养肉汤中的生长曲线见图 2。菌的延滞期随初始菌浓度的增加而缩短，初始菌浓度为 102cfu/mL 的曲线在约 5h 进入对数期，而 103和 104cfu/mL 的生长曲线分别在约 3 和 2h 后就进入了对数期。和 4时一样，进入对数期的 LM，生长速率随着初始菌浓度的增加而减慢，初始菌浓度越低，对数期菌数增加速率越快。25h 后，三个不同菌浓度的生长曲线达到最大菌体密度，约为 105cfu/mL。图 226下 Gompertz 模型拟合的不同浓度 LM 在营养肉汤中的生长曲线Fig.2Gompertz model curve of the growth of L.monocytogeneson nutrient broth under different concentrations at 2636下，Gompertz 模型拟合的不同浓度 LM 在营养肉汤中的生长曲线见图 3。三个不同初始菌浓度的生长曲线均在约 12h 后进入对数期，LM 的生长延滞期随初始菌浓度的增加而缩短。进入对数期后，初始菌浓度越低，LM 的生长速率越快。约在 8h后进入稳定期，细胞密度达到最大值，约 107cfu/mL。图 336下 Gompertz 模型拟合的不同浓度 LM 在营养肉汤中的生长曲线Fig.3Gompertz model curve of the growth of L.monocytogeneson nutrient broth under different concentrations at 362.3LM 在营养肉汤中生长的初级模型的模型参数由 Matlab 软件拟合 LM 在营养肉汤中生长的Gompertz 模型，得到相应的生长参数:最大比生长速率 U(lg cfu/mL h)、生长延滞期 LPD(h)和最大细胞密度 MPD(lg cfu/mL)，结果见表 2。可以看出 LM 在 4的最大比生长速率(0.0236，0.0078，0.0016)小 于 在 26 的 最 大 比 生 长 速 率(0.3169，0.1111，0.0595)，26 的最大比生长速率小于 36 的最大比生长速率(1.3046，0.9287，0.7024)，证明随着温度升高，LM 生长速度加快。4下，最大比生长速率随着初始菌浓度的增加(102，103，104)而降低(0.0236，0.0078，0.0016)，26、36也显示同样的趋势，结果证明，在相同温度下，初始菌浓度越低，LM生长越迅速。随着温度的升高，生长延滞期 LPD(h)缩短。LM 在不同温度下生长延滞期顺序为:4(25.6811，27.3143，33.7437)26(4.8442，3.3708，2.3458)36(1.7875，1.1932，0.6915)。在相同温度下，生长延滞期的趋势并不明显，26，36 下，延滞期随着初始菌浓度的增加而降低，而 4 下，延滞期随着初始菌浓度的增加而延长，因为温度较高时(26，36)，初始菌浓度越大，进入对数期就越快，延滞期越短;而温度较低时(4)，初始菌浓度越大，越接近最大细胞密度，因此延滞期越长。从最大细胞密度 MPD(lg cfu/mL)可以看出，随着温度升高，MPD 增大，LM 在不同温度下的最大生长密度顺序为:36(7.7559，7.7709，7.7536)26(5.6839，5.7218，5.7076)4(4.0969，4.0453，4.0492)。LM 在营养肉汤中生长的生长曲线于 PMP 软件176表 2不同浓度 LM 菌悬液的 Gompertz 模型在不同温度下的生长参数Table 2Gompertz model parameters of the growth of L.monocytogenes under different temperatures and concentrations温度()42636浓度(cfu/mL)102103104102103104102103104最大比生长速率 U(lg cfu/mL h)0.02360.00780.00160.31690.11110.05951.30460.92870.7024生长延滞期 LPD(h)25.681127.314333.74374.84423.37082.34581.78751.19320.6915最大细胞密度 MPD(lg cfu/mL)4.09694.04534.04925.68395.72185.70767.75597.77097.7536表 3LM 生长参数的实测值和 PMP 预测值的比较(初始浓度为 103cfu/mL)Table 3Comparison of observation and PMP predictive values on L.monocytogenes growth parameters温度()42636实测值预测值实测值预测值实测值预测值最大比生长速率 U(lg cfu/mL h)0.00780.0260.11110.4920.92870.796生长延滞期 LPD(h)27.314366.403.37083.971.19321.91最大细胞密度 MPD(lg cfu/mL)4.04539.575.72189.577.77099.57进行比较，MPD 较低，但总体趋势相同。初始浓度为103cfu/mL 的 LM 生长参数的实测值和 PMP 预测值的比较见表 3。可以看出，U 和 LPD 的实测值和预测值趋势相同，都是随着温度的升高，U 增快，LPD 缩短。MPD 的实测值和预测值差别较大，可能原因是实验选择菌株的不同和单一造成的，该菌株可能受温度影响较大，所以 MPD 达不到预测值，且随着温度降低，MPD 减小。3结论本实验利用 Matlab 丰富的函数资源，成功拟合出不同温度和不同 LM 浓度在营养肉汤中的生长初级模型。微生物生长的初级模型一般通过 S 形曲线描述，主 要 模 型 有:Gompertz 模 型、Logistic 模 型、ichards 模型和 Baranyi 模型等910。多数微生物生长预测模型研究表明，Gompertz 模型能很好描述微生物的生长，Zhou11 拟合了热杀索丝菌(Brochothrixthermosphacta)的生长曲线，发现 Gompertz 模型最合适，其次是 Baranyi 模型，最后是 Logistic 模型。本文分别拟合了 Gompertz 模型和 Logistic 模型，比较相关系数发现，Gompertz 模型的 2均在 0.98 以上，所以认为 Gompertz 模型能更好的拟合本实验的数据。基于前人的研究，本实验选择了三个不同温度，36为 LM 最适生长温度，26为室温，4为食品冷藏温度，研究结果具有指导意义。三个温度下 LM 的生长曲线与 PMP 预测软件比较发现，实测值与预测值存在一定差别，但总体趋势相同。近年来，较多研究都致力于建立不同温度下 LM的生长预测模型，如郑丽敏12 等建立了不同温度下即食凉拌菜中单增李斯特菌的生长模型，而很少有研究初始菌浓度对 LM 生长的影响。本实验基于目前生长预测模型研究的基础，建立了不同初始浓度在不同温度下 LM 在营养肉汤中生长的初级模型，明晰了 LM 增殖规律，为进一步研究鲜活农产品物流过程中 LM 的生长动态，研发综合防控技术奠定了基础。参考文献 1 金伟平，黄志强，刘群群，等.顶空固相微萃取气质联用法分析单增李斯特菌污染冷藏牛肉的挥发性物质 J.食品科学，2012，33(2):243247.2 丁甜，董庆利，相启森，等.Listeria monocytogenes 在经高氧化还原电位酸性水处理的鲜食莴苣上预测模型的建立 J.食品工业科技，2010，31(3):8794.3 王军，董庆利，丁甜.预测微生物模型的评价方法 J.食品科学，2011，32(21):268272.4Ana L P，Mauro F F L.Growth of Listeria monocytogenes inmelon，watermelon and papaya pulpsJ.International Journal ofFood Microbiology，2004，92(1):8994.5 Shigenobu K，Seiichiro I.Growth of Listeria monocytogenes oniceberg lettuce and solid mediaJ.International Journal of FoodMicrobiology，2005，101(2):217225.6 A M Castillejo，E Barco A，M Garcia G，et al.Growthmodelling of Listeria monocytogenes in packaged fresh greenasparagus J.International Journal of Food Microbiology，2000，17(4):421427.7 李平兰，贺稚非.食品微生物学实验原理与技术M.北京:中国农业出版社，2005:4244.8 唐晓阳，赵勇，孙晓红，等.冷却猪肉中假单胞菌生长预测模型的建立与验证 J.湖南农业科学，2010(1):128131.9Whiting C，Buchanan L.A classification of modles forpredictive J.Food Microbiol，1993，10:175177.10 Guentzel J L，Lam K L，Callan M，et al.eduction of bacteriaon spinach，lettuce，and surfaces in food service areas usingneutral electrolyzed oxidizing waterJ.International Journal ofFood Microbiology，2008，25:3641.11Zhou K，Fu P，Li P L，et al.Predictive modeling andvalidation of growth at different temperatures of Brochothrixthermosphacta J.Journal Food Saf，2009，29:460473.12 郑丽敏，董庆利，丁甜，等.即食凉拌菜中单增李斯特菌生长模型的建立J.食品科学，2013 http:/www spkx netcn/CN/abstract/abstract30611 shtml.