广藿香愈伤组织诱导和分化再生植株的研究.docx

广藿香愈伤组织诱导和分化再生植株的研究【摘要】 【目的】开展广藿香愈伤组织的诱导及分化再生植株的研究，建立高效的组织培养再生系统。【方法】以广藿香叶片、带节茎、不带节茎及根尖为材料进行离体培养，筛选影响愈伤组织诱导、增殖及分化的因素。【结果】6苄氨基嘌呤(BA)或N苯基N123噻二唑5脲(TDZ)与萘乙酸(NAA)配合有利于愈伤组织的诱导，BA的适宜浓度为0205mg/L；4种外植体中，带节茎及不带节茎较易诱导出愈伤组织。BA和NAA配合使用能较好地促进愈伤组织的增殖；培养30d的愈伤组织较60d的具有更强的增殖和分化能力。BA有利于愈伤组织的分化；叶片诱导的愈伤组织分化能力较强。【结论】建立了高效的广藿香愈伤组织诱导及分化再生植株的离体再生体系。【关键词】 广藿香/生长和发育；离体培养；愈伤组织Abstract: ObjectiveCallus induction and plantlets regeneration of Pogostemon cablin(Blanco)Benth. are studied to establish a highefficiency regeneration system for tissueleaf segments, nodular stem segments, stem segments and root tips from Pogostemon cablin(Blanco)Benth. were cultured in vitro. The factors which affect the induction，multiplication and differentiation of callus were studied. ResultsBenzylaminopurine (BA) or thidiazuron (TDZ) combined with naphthylacetic acid (NAA) was helpful to induce callus. The optimal concentrations of BA were 0205mg/L. Nodular stem segments and stem segments were the most suitable explants for callus induction. The medium containing BA and NAA promoted the multiplication of callus. The multiplication rate and differentiation rate of 30day callus were much higher than those of 60day callus. BA was helpful to induce callus differentiation. The callus from leaf segments exerted a higher differentiation rate. ConclusionA highefficiency regeneration system of callus induction and plant regeneration from Pogostemon cablin(Blanco) been established.Key words:POGOSTEMON CABLIN(BLANCO) BENTH./growth & development;INVITRO CULTURE;CALLUS广藿香Pogostemon cablin (Blanco) Benth.为唇形科刺蕊草属植物，以干燥地上部分入药，其性辛、微温。具有芳香化湿，开胃止呕，发表解暑的功效1。广藿香为广东道地药材，“十大广药”之一，是多种着名中成药“藿香正气丸”、“藿胆丸”等以及现代中药制剂“抗病毒口服液”的主要原料。广藿香原产于菲律宾、马来西亚等国，最早自宋代引入我国，栽培历史悠久。广藿香生产中面临青枯病的危害，该病由青枯菌侵染所致，为典型的维管束病害23。在我国产区栽培的广藿香，罕见开花结实4，长期以来，生产上采用扦插繁殖，病原体通过无性繁殖传递，且逐代积累，危害越来越严重，迫切需要进行抗病品种的选育。近年来，基因转移及人工诱变等改良药用植物农艺性状的技术，为广藿香抗病育种提供了可能，而要开展相关的研究，首先要建立高效的组织培养再生系统。本文以广藿香多种外植体为材料，筛选影响广藿香愈伤组织诱导、增殖及分化的多种因素，以期建立高效的愈伤组织诱导及分化再生植株的离体再生系统，为遗传转化及人工诱变育种奠定基础，现报道如下。1材料和方法11材料试验材料采自广州中医药大学药圃，选择生长健壮、无病虫害的广藿香单株，取其顶芽、带节茎及叶片；经蒸馏水冲洗干净后，用体积分数为70%乙醇浸泡30s，转入1g/L的HgCl2溶液浸泡消毒10min，再用无菌水漂洗58次，把残留HgCl2漂洗干净，接种于 Murashge and Tucker+02mg/L 6苄氨基嘌呤(BA)培养基上，诱导丛芽的生成，待丛芽长出后将其移至MT培养基中培养，试管苗长至57cm时即可作材料使用。12方法121外植体培养取广藿香试管苗的叶片、带节茎、不带节茎及根尖为外植体进行培养。外植体在培养基中的放置方式为：叶片及根尖平放，带节茎及不带节茎为形态学下端下插。每种处理接种外植体数为30块左右，设置3次重复。122愈伤组织的诱导增殖以广藿香叶片及带节茎等诱导愈伤组织，选取未分化出芽的愈伤组织接种至增殖培养基中。每种处理一般接种30块愈伤组织，设置3次重复。诱导及增殖培养基即以MT培养基为基础，根据试验要求添加不同浓度的6苄氨基嘌呤(BA)、萘乙酸(NAA)、N苯基N123噻二唑5脲(TDZ)及二氯苯氧乙酸(24D)等植物激素组成。123愈伤组织的分化以实验中诱导的愈伤组织为材料，接种至分化培养基中培养。每种处理一般接种30块愈伤组织，设置3次重复。分化培养基以MT为基础培养基，根据试验要求添加不同浓度的BA、6糠氨基嘌呤(KT)、NAA、3吲哚乙酸(IAA)、TDZ及24D等植物激素。124无根苗的诱导生根及移栽将愈伤组织分化获得的再生苗接种至生根培养基MT+ 02mg/LIBA中，进行诱导生根，生根后进行炼苗和移栽。13培养条件培养室温度保持，每天光照12h，光照强度为2 5003 000Lx。2结果与分析21愈伤组织的诱导以广藿香试管苗的叶片及带节茎等为材料，成功诱导出愈伤组织，并考察了不同植物激素及不同BA浓度对愈伤组织诱导的影响，同时，观察了不同外植体诱导愈伤组织能力的差异，以找出适合广藿香愈伤组织诱导的培养基及外植体种类。211不同植物激素对愈伤组织诱导的影响以广藿香的带节茎和不带节茎为材料，设置不同植物激素及不同激素组合进行试验。结果显示，不添加任何植物激素及单独使用细胞分裂素未能诱导出愈伤组织，单独使用生长素诱导出的愈伤组织灰白色，呈水浸状，其生长势较差。细胞分裂素与生长素结合，能成功诱导出愈伤组织，愈伤组织呈乳白色或灰白色，半透明、疏松状，生长势较好。如BA和NAA结合，培养10d后，100的外植体产生愈伤组织；BA和24D配合使用时，10d后愈伤组织诱导率达85%以上，15d后诱导率为100；TDZ和NAA或24D配合使用，10d后愈伤组织诱导率为80%以上，15d后诱导率均为100，含有24D的培养基中愈伤组织的生长势较含有NAA处理者稍好，愈伤组织颜色更深，为灰白色。带节茎和不带节茎培养，均能成功诱导出愈伤组织，在培养10d时，带节茎愈伤组织诱导率略高于不带节茎，其生长势亦较好。添加24D诱导的愈伤组织，在愈伤组织培养一段时间后，会出现褐化现象，且部分死亡。因此愈伤组织诱导时，采用BA或TDZ与NAA结合较好，结果见表1。表1不同植物激素对愈伤组织诱导的影响注： 无愈伤组织，+ 差，+ 一般，+ 较好，+ 旺盛212不同浓度BA对愈伤组织诱导的影响以广藿香带节茎为材料，设置不同浓度的BA(0、01、02、05mg/L)与05mg/LNAA配合使用，诱导愈伤组织，统计接种15d后的愈伤组织诱导率和生长势，比较不同BA浓度对愈伤组织诱导的影响。结果表明，不添加植物激素或单独使用细胞分裂素BA未能产生愈伤组织，适当浓度的BA和NAA配合，则能较好地诱导出愈伤组织，BA的适宜浓度为：0205mg/L，其中，浓度为02mg/L时，愈伤组织的生长势最好。213不同外植体诱导愈伤组织能力的差异将广藿香试管苗的4种不同外植体：叶片、带节茎、不带节茎及根尖，接种至MT+ 02mg/LBA +05mg/LNAA培养基中，观察不同外植体诱导愈伤组织能力的差异。结果表明：一般接种15d后4种外植体均能产生愈伤组织，愈伤组织诱导率均达100。但不同外植体诱导的愈伤组织生长势表现明显的差异。带节茎诱导的愈伤组织生长势旺盛，愈伤组织黄白色，疏松；不带节茎诱导的愈伤组织生长势较好，愈伤组织黄白色，疏松；叶片诱导的愈伤组织生长势一般，颜色为浅绿色，致密；根诱导的愈伤组织生长势较差，愈伤组织灰白色，硬脆。在愈伤组织的分化实验中还观察到，叶片诱导的愈伤组织在短时间内分化出大量的芽；带节茎和不带节茎诱导的愈伤组织分化出芽的时间较晚，培养一段时间后可获得量较多的愈伤组织；根诱导的愈伤组织不分化出芽，培养时间超过30d后即出现褐化现象。22愈伤组织的增殖广藿香外植体培养能成功诱导出愈伤组织，但由于原代培养获得的愈伤组织的量较少，为了能够在较短的时间内获得较多的愈伤组织，以便能分化出广藿香外植体诱导愈伤组织，再经体胚发生再生植株的研究，已有成功的报道，张家明等5以广藿香的叶片为外植体诱导愈伤组织，研究了广藿香愈伤组织的悬浮培养，获得了大量的试管苗。肖省娥等6采用广藿香的叶片及带节茎诱导愈伤组织，获得了再生植株。现有的研究主要是以叶片和带节茎为材料，且对于影响愈伤组织诱导及分化的因素缺乏系统的研究，同时有关愈伤组织增殖方面的研究还未见报道。本试验以叶片、带节茎、不带节茎及根尖为材料，系统地研究了影响愈伤组织诱导及分化的因素，同时考察了不同因素对愈伤组织增殖的影响，结果表明，取带节茎或不带节茎接种于含BA和NAA的培养基中较易诱导出愈伤组织。同时，BA和NAA配合使用能较好地促进愈伤组织的增殖。培养天数为30d的愈伤组织具有较强的增殖和分化能力。在愈伤组织的分化实验中，BA有利于愈伤组织的分化；叶片诱导的愈伤组织分化能力较强。通过本实验，我们建立了广藿香高效的愈伤组织诱导和分化再生植株的体系。大多数的高等植物的各种器官，离体后在适当的环境下都能产生愈伤组织7。愈伤组织是指植物局部创伤后或在组织培养中，当已分化的细胞恢复了细胞分裂能力，而增殖形成的无组织结构、无器官分化的薄壁细胞团。在植物组织培养中，愈伤组织可由外植体诱导产生，在一定条件下，可再分化出具一定结构及功能的器官，如根、茎、胚状体或重新形成完整的植株。研究表明，植物离体培养中通过器官发生和体细胞胚胎发生再生植株，通常被认为是单细胞起源的8。因此，广藿香离体器官经遗传转化或诱变试验处理后，再经愈伤组织诱导再生的植株，由于是单细胞起源的，可避免嵌合体的产生，从而可能为新品种选育提供有价值的种质材料。【参考文献】 1国家药典委员会.中华人民共和国药典M.北京：化学工业出版社，2005：30. 2文衍堂.海南岛广藿香、沙姜青枯病病原菌的鉴定J.热带作物学报，1984，5:113.3卢同.我国作物细菌性青枯菌的研究发展J.福建农业学报,1998，13：33.4李薇，徐鸿华.广藿香规范化栽培技术M.广州：广东科技出版社,2003：35-38.5张家明，郑学勤，孙雪飘.广藿香体细胞培养植株再生的研究J.热带作物学报，1994，15：73.6肖省娥，贺红，徐鸿华.广藿香组织培养与植株再生研究J.中药材，2001，24：391.7李浚明.植物组织培养教程M.北京：中国农业大学出版社，2002：39，26.8Swartz HJ. Postculture behavior: genetic and epigenetic effects and related problems. In: Debergh P C,Zimmerman R H. MicropropagationM. Netherlands：Kluwer Academic Publishers, 1991:95.