复合生物保鲜剂在大黄鱼保鲜中的应用研究.pdf

山东轻工业学院硕士学位论文复合生物保鲜剂在大黄鱼保鲜中的应用研究姓名：王玉婷申请学位级别：硕士专业：食品科学指导教师：邵秀芝2011-06-11山东轻工业学院硕士学位论文 I 摘 要摘 要 本课题从揭示大黄鱼腐败微生物的菌相分布、优势腐败菌的分离鉴定等基础研究出发，研究茶多酚、壳聚糖、聚赖氨酸、Nisin、丁香、桂皮、柠檬酸等几种天然安全防腐剂的抑菌性能，采用响应面法对其进行复配和优化，确定复合防腐剂的最佳配比，并研究了复合生物防腐剂对冷藏大黄鱼的保鲜效果。主要结论如下：1、从冷藏腐败大黄鱼中共分离到的 126 株菌中，腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefacens spp.）68 株，假单胞菌属（Pseudomonas spp.）27 株，黄杆菌属（flavobacterium spp.）9 株，产碱杆菌属（Alcaligenes spp.）7 株，未判断和未鉴定的总共 15 株。其中腐败希瓦氏菌和假单胞菌属是主要优势菌，分别占 54.0%和 21.4%。2、通过最小抑菌实验和滤纸片琼脂扩散实验得出：茶多酚、壳聚糖、聚赖氨酸、柠檬酸、丁香和桂皮浸提液对冷藏大黄鱼中主要腐败菌都有不同程度的抑菌作用。茶多酚、壳聚糖、聚赖氨酸、柠檬酸对菌株有较强的抑制作用，丁香和桂皮效果稍差，Nisin没有作用。3、通过单因素实验，确定了复合保鲜液的种类和浓度。应用响应面试验设计对 3种防腐剂进行优化配比，通过多元回归分析方程，经失拟项和决定系数检验，证明预测模型可靠性较好。结果表明，壳聚糖和柠檬酸之间存在显著的交互效应（P0.01），其它几种保鲜剂之间的交互效应不显著（P0.05）。复合防腐剂最佳配比为：茶多酚4.48g/L，壳聚糖 15.92g/L，柠檬酸 3.58g/L。4、通过微生物指标、理化及感官指标对复合防腐剂用于对大黄鱼的保鲜效果进行评定。空白对照组的大黄鱼 4贮藏的货架期为 6 天，用复合保鲜液浸泡处理的大黄鱼的货架期为 13 天，比对照组延长货架期 7 天。关键词：关键词：大黄鱼；生物防腐剂；货架期；茶多酚；壳聚糖 山东轻工业学院硕士学位论文 III ABSTRACT The paper analysed the bacterial phase and dominated spoilage bacteria at the end of shelf life of Pseudosciaena crocea,studied the antibacterial ability of tea polyphenols,chitosan,PL,Nisin,citric acid,the extraction of clove and cinnamon.The optimum combinations of the several preservatives were researched by using the response surface methodology.The effects of the optimum combination of the preservatives for the preservation of Pseudosciaena crocea were also researched,the results included several parts as follows:1.126 strains microorganisms of Pseudosciaena were isolated and preliminary identified.Including 68 strains Shewanella putrefacens,27 strains Pseudomonas,9 strains Flavobacterium,7 strains Alcaligenes and 15 strains unidentified.Shewanella putrefacens and Pseudomonas is dominated spoilage bacterial,of each accounted 54.0%and 21.4%.2.The result of the experiment of minimum inhibitory concentration and filter paper discagar diffusion showed that tea polyphenols,chitosan,PL,nisin,citric acid,the extraction of clove and cinnamon showed the different degrees of antibacterial ability.The growth of spoilage bacteria could be effectively inhibited by tea polyphenols,chitosan,PL and citric acid,the extraction of clove and cinnamon taked second place,while nisin couldnot inhibite the growth of spoilage bacteria.3.The species and concentration of preservatives were determined by single factor experiments.The optimization of the combination of the preservatives was focused on the preservation of fish by Response surface methodology.Quadratic polynomial equation was obtained through multiple regression analysis.The predicted model was proved adequate when tested by the lack of fit and coefficient of determination.There was a significant synergy between chitosan and citric acid(P0.01).The results of regression analysis showed that the optimum proportion of the combination of tea polyphenols,chitosan and citric acid was 4.48g/L,15.92g/L and 3.58g/L.4.The effects of the optimum combination of the three preservatives for the preservation of Pseudosciaena crocea were evaluated with microbial qualities,physical and chemical qualities and sensory qualities.The fish stored at 4 and treated using the compound preservative was 13 days respectively,while the contrast could preserve 6 days.Key words:Pseudosciaena crocea;biological preserbatives;shelf life;tea polyphenols;chitosan 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。论文作者签名：日期：年 月 日 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山东轻工业学院。论文作者签名：日期：年 月 日 导 师 签 名：日期：年 月 日 山东轻工业学院硕士学位论文 2第 1 章 绪论 大黄鱼 Pseudosciaena crocea（Richardson），石首鱼科黄鱼属，为暖温性近海中下层集群洄游鱼类，是我国重要的经济鱼类之一，素有“国鱼”之称，广泛分布于黄海、东海、台湾海峡等处。大黄鱼中蛋白质、微量元素和维生素，对人体有很好的补益作用，对体质虚弱和中老年人来说，食用黄鱼会收到很好的食疗效果；黄鱼含有丰富的微量元素硒，能清除人体代谢产生的自由基，能延缓衰老，并对各种癌症有防治功效。20 世纪 70 年代，因过分捕捞，大黄鱼野生资源破坏严重。1986 年大黄鱼人工育苗的成功，为大黄鱼养殖业的发展奠定了基础。近几年大黄鱼无论从产量还是产值上，都呈上升趋势。据统计，2004 年，大黄鱼出口额达 1.4 亿美元。现在每年的年产量都在 5万吨以上。除了冷冻包装、腌渍、干制等处理，大黄鱼大多以冰鲜形式出口周边国家和销往上海、山东、北京等地。如何经济、有效的延长冰鲜大黄鱼的货架期，变得越来越重要。1.1 水产品的腐败 鱼贝类死后发生僵硬，后又解僵，与此同时微生物开始繁殖，到僵硬期结束时，随着微生物的活跃，水产品原有的形态和色泽发生变化，并产生异味，变得感官不可接受，到了货架期的终点，这个过程称为腐败。水产品比一般的高蛋白食物更容易腐败，这是由其理化特性决定的。鱼贝类结缔组织少、肉质柔软、水分含量较高，蛋白质分解而生成的大量低分子代谢物和游离氨基酸容易被细菌利用；鱼体内所含酶类在常温下活性较强，如内脏中的蛋白质、脂肪等分解酶，肌肉中的三磷酸腺苷分解酶等，造成了腐败的加速；鱼贝类脂肪中的脂肪酸多为不饱和脂肪酸，如 EPA、DHA、棕榈油酸、油酸等，由于不饱和脂肪酸中含有双键，在高温和光照条件下不稳定，易被氧化，分解成的醛、酮等物质导致鱼肉风味的改变，影响感官品质导致腐败；鱼类除消化道外，鳃及体表也附有各种细菌，体表的黏液更是起到培养基的作用，成为细菌繁殖的好场所，且其表面组织脆弱、鳞片易于脱落，容易遭受细菌侵入。鱼贝类的腐败微生物通常包括以下几种：Pseudomonas(假单胞菌属)、Shewanella(希瓦氏菌)、Phosphoreum(磷发光杆菌)、Lactic acid bacteria(乳酸菌)、Vibrionaceae(弧菌科)、Alcaligenes(产碱杆菌属)、Moraxella(莫氏杆菌属)、Aeromonas(气单胞菌属)等。根据鱼贝类所处的环境以及贮藏条件的不同而不同。山东轻工业学院硕士学位论文 3 1.2 鱼类保鲜技术研究进展 鱼类产品的防腐保鲜通常是通过物理或化学方法抑制腐败菌的生长、延缓鱼贝类的生理变化，保持其新鲜的状态与品质。1.2.1 物理保鲜法 1.2.1.1 低温保鲜 低温保鲜是水产品主要的保鲜手段。主要分为冰藏、冷冻、冷海水或冷盐水保鲜、微冻保鲜等，近来还发展了超冷保鲜技术。低温保鲜原理是通过降低温度抑制鱼体微生物的繁殖以及生物化学变化，通常与其他的保鲜方法结合使用。冰藏保鲜 冰藏保鲜是历史最悠久的传统保鲜方法，也是目前渔船作业最常用的保鲜技术。用冰保鲜的优点是对人体无毒，成本低，便于携带运输等优点。但是冰藏保鲜也存在着鱼与冰接触不严、下层的鱼易压烂等缺点。冷海水保鲜 冷海水保鲜是把渔获物保藏在-10的冷海水中，从而达到保鲜的目的。此种保鲜方法适用于活动能力强的红肉鱼，优点是鱼体降温快，操作简单迅速，不足之处是需要制冷装置，贮藏时间一长，鱼体开始变咸、变色等。微冻保鲜 微冻保鲜是将鱼保藏在其细胞汁液冻结温度以下（-3 左右）的一种轻度冷冻的保鲜方法。微冻保鲜技术是 20 世纪 60 年代以来开始研究和使用的一种保鲜方法，其原理是在微冻温度下，鱼体内和微生物体内的部分水分都发生了冻结，限制了微生物的繁殖。微冻保鲜比冷冻保鲜耗能少，解冻时汁液流失少，表面色泽好，而与冷藏保鲜相比，它能延长保鲜期 1.52 倍。但是微冻保鲜也有操作技术性高、对温度控制严格、具体的鱼类具体分析等应用限制。超冷保鲜 超冷保鲜是一种新型保鲜技术。它将鱼即杀死和初期的急速冷却同时实现，它能抑制鱼体死后的微生物变化，避免了憋闷死亡、肉质氧化、K 值上升等鲜度指标下降的现象，最大限度地保持鱼体原本的鲜度和鱼肉品质。超冷保鲜技术是一个技术性很强的保鲜方法，对鱼种及其大小、鱼体初温、环境温度、盐水浓度等需做大量基础的研究，规范整个操作程序及操作参数，以求有更强的实用性。1.2.1.2 气调保鲜 气调保鲜是通过改变包装环境的气体含量，破坏微生物的生存环境，以抑制微生物的生长达到保持鲜度的目的的一种保鲜方法，所用到的气体通常为 CO2、O2和 N2。气调保鲜效果的主要影响因素有贮藏温度、气体体积、气体浓度等。其中 CO2的浓度是关第 2 章 冷藏大黄鱼中微生物的分离与初步鉴定 4 键因素，其浓度的高低根据所保鲜产品的化学性质以及腐败菌种和保鲜目的来选择，高CO2含量用于新鲜鱼制品可能会导致包装塌陷和鱼块液汁的流失1。周冬香2对草鱼段气调包装的研究表明：气体配比为 50%CO2、10%O2、40%N2时有较好的储藏效果。刘扬3以俄罗斯鲟鱼为原料,采用气调包装保鲜技术,并辅以臭氧、紫外线等预处理,将其货架期延长至 2729d。1.2.1.3 辐照保鲜 辐照保鲜是利用电离辐射产生的射线及电子束处理产品以达到保鲜的一种方法。其原理是通过干扰微生物的代谢、破坏微生物细胞膜从而导致细菌的死亡。辐照保鲜的优越性表现在其过程和使用的剂量可以调节；不改变食品原有特性；方便、快捷、节能4。水产品中的腐败菌经过辐照处理大多能被杀灭，尤其是肠道病原菌。崔生辉5等研究结果表明 2.5kGy 的辐照可以降低鲤鱼细菌总数 4 个数量级，1.0kGy 的剂量使大肠菌减小了 800 倍，显示了良好的杀菌效果。1.2.1.4 超高压保鲜 超高压技术是在密闭容器内用高压（2001000MPa 以上）处理食品，达到灭菌、保藏的目的。超高压技术是近年来发展的一种新技术，与传统的食品加工技术相比，有着很多的优点，比如能更好的保持食品中固有的营养品质、质构、风味、色泽、新鲜程度等。目前，超高压保鲜已经在水产品保鲜中得到广泛的应用。徐阳6选取带鱼为实验对象，进行超高压保鲜的研究。以加工压力、保压时间、预处理时间为实验因素，进行三因素三水平正交试验，得到了超高压处理带鱼的最优加工工艺，为预处理 30s 后加压到350 MPa 保压 15min，灭菌率达 99以上，并使加工后的带鱼在常温条件下的保质期达到了 15d。曹科武7研究了超高压对缢蛏的最佳保鲜条件，当压力在 300Mpa 以上有非常显著的杀菌效果。菌落总数总体上都减小 23 个数量级，大肠杆菌已经无法检出。综合评定结果得出：缢蛏在 4普通包装条件的货架期为 4d，经 500 Mpa，20，15min超高压处理后的货架期为 89d。1.2.1.5 干燥保鲜 干燥保鲜包括热风干燥、真空冷冻干燥、微波干燥以及远红外干燥等。真空冷冻干燥是在真空条件下使水分从固体状态直接升华到蒸汽状态，保留了水产品中的多孔性骨架结构，在避免了高温处理和与氧气的接触，保持了食品的颜色和营养成分的同时保证了水产品良好的复水性；微波和远红外干燥的特点是速度快，节省能耗且脱水彻底。1.2.2 化学保鲜法 化学保鲜就是在水产品中加入对人体无害的化学添加剂，以延长其保鲜时间、保持其品质的方法，常用的方法有盐腌、烟熏、添加食品保鲜剂等。山东轻工业学院硕士学位论文 5 1.2.2.1 盐藏保鲜 盐藏保鲜的原理是利用食盐使鱼体和微生物脱水，在鱼体内形成的高渗透压溶液抑制了大部分致病菌和致腐性微生物的生长。盐藏保鲜包括干腌法、湿腌法和混合腌法。干腌法是直接将盐洒在鱼体上，操作简便，处理量大，缺点是用盐不均匀，油脂氧化严重，比较适合低脂鱼的腌制。湿腌法是用过饱和食盐溶液进行保鲜，不易引起氧化的同时不会使鱼过度的脱水，缺点是需要设备，食盐用量也较多。混合腌法避免了两者的缺点。1.2.2.2 烟熏保鲜 烟熏保鲜的原理是在升高温度的同时释放的多种具有抑菌作用的化合物（如甲醛），且随着水产品表面的水分大量蒸发，降低了水分活度，抑制了微生物的生长繁殖，从而达到了保鲜的目的。熏烟中释放的化合物除了具有防腐作用外，还可以抗氧化，赋予制品特殊的香味。熏烟的发生量、熏烟时间、熏烟温度、原料含水量、表面积以及 pH 等，都对保鲜有较大的影响。烟熏方法主要有三种：冷熏、热熏和无烟的液熏，其中液熏时间短，便于实行熏制过程的机械化和连续化，可广泛用于水产品中。1.2.2.3 食品保鲜剂保鲜 添加化学合成或天然的食品防腐保鲜剂是食品保鲜的重要手段之一，因其价格低廉、不需配备额外的设备、容易操作等优点越来越受到人们的关注。化学合成保鲜剂 水产品中使用的化学保鲜剂主要是山梨酸钾及其盐类、抗坏血酸、尼泊金酯等。山梨酸钾毒性较低、抑菌谱广且不会在人体内积累，被世界上大多数国家所广泛使用。邹玉萍8研究了尼泊金酯及山梨酸钾对鱼制品腐败菌的抑制效果,得到山梨酸钾对包括假单胞菌属细菌外的其他腐败菌都具有很好的防腐效果。宋智9将鲤鱼用含山梨酸钾和柠檬酸的冰中冰藏，并设置普通冰为对照，通过感官、细菌总数、TVBN、K 值等指标进行评定，复合保鲜剂对鲤鱼冰藏的保鲜期为 20d，比对照组至少延长了 8d。董杰10研究表明添加了山梨酸钾的鱼糕保质期为 28d，比对照组延长了 17d。生物保鲜剂 生物保鲜剂包括植物源、动物源和微生物源保鲜剂。植物源保鲜剂 植物源保鲜剂涞源广泛，价格低廉，有广阔的发展空间。目前用于水产品保鲜的植物源保鲜剂主要有茶多酚、蜂胶、香辛料（丁香提取物、桂皮提取物、大蒜提取物等）。茶多酚 茶多酚(Tea polyphenols,TP)，存在与茶叶中，是多酚物质的总称。其中儿茶素的数量最多，约占 60%-80%，是茶多酚抗氧化和保鲜作用的主要成分。此外还有黄酮、酚类和花青素几类化合物。茶多酚的抑菌机理是能特异性地凝固细菌蛋白、破坏第 2 章 冷藏大黄鱼中微生物的分离与初步鉴定 6 细菌细胞膜结构、与细菌遗传物质 CDE 结合等，从而改变细菌生理抑制其生长。茶多酚的抑菌谱广且抑菌作用强，对 12 个类群近百种细菌均有抑制作用，最小抑制浓度（MIC）一般仅为每千克数百毫克。将茶多酚用于用于鲜鱼的保鲜可以明显地延缓鲜鱼腐败变质的时间。Fan11等用 0.2%的茶多酚保鲜鲢鱼，使白鲢鱼的货架期延长了 7d，达到了 35d。汪兴平12等用 0.6的茶多酚进行浸泡鲜鱼片，置于 5贮藏的货架期也达到了 35d，虽与 Fan 的处理方法不同，但是结果相同。蓝蔚青13等在带鱼段中添加了 6g/L的茶多酚，冷藏，在贮藏了 10d 后仍能达到二级鲜度，与对照组相比延长了 3d。有研究将茶多酚用于鱼糜中可以提供鱼丸的凝胶性能。刘焱14等将茶多酚与 Vc，柠檬酸复合添加到鱼糜中显示了良好的成胶性能，酸价、过氧化值以及挥发性盐基氮都偏低。王朝瑾15等用 1.60的茶多酚处理南美对虾，通过测定挥发性盐基氮值和 pH 值，发现该浓度的茶多酚对虾肉保存时间为 8d，起到了良好的保鲜效果。香辛料 香辛料是一类能够使食品呈现各种香、辛、甜、苦等典型风味的天然食用植物香精的简称。植物香辛料不仅具有调味增香作用,其中许多经报道含有各式各样的抗菌成分，对许多细菌微生物具有较强的抗菌能力。玛丽珍16等的研究结果表明丁香乙醇提取物对假单胞菌、大肠杆菌、乳酸菌等具有较强的抑菌效果。张雁南17等研究了丁香和甘草的协同抑菌作用，复配液对细菌的最小抑制浓度为 3.125 mg/mL，在较低质量浓度即达到了较好的抑菌效果。吴涛18等将大蒜提取液用于白鲢鱼肉的保鲜，结果表明：大蒜提取液能有效的降低鱼肉的 pH 值、挥发性盐基氮、TBA 和细菌总数，延长了货架期。蜂胶 蜂胶是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树脂，混入其上颚腺、蜡腺的分泌物加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。蜂胶所含有的丰富而独特的生物活性物质，使其具有抗菌、消炎、止痒、抗氧化、增强免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤等多种功能，对人体有着广泛的医疗、保健作用。沈慧亭19等通过实验证明，蜂胶对 20 个菌种，包括链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等有明显的抑制作用，并且不受实验方法的影响。用蜂胶乙醇提取液处理对虾可以延长保质期 2-3 倍，且对白鱼也有良好的防腐保鲜效果20。蜂胶液还可以在抑制干鱿鱼微生物繁殖的同时，保持其原有的水分、风味和品质不变21。动物源保鲜剂 壳聚糖 壳聚糖又称为脱乙酰甲壳素、甲壳胺，其原料甲壳素大量存在与海洋节肢动物的甲壳中和低等动物的细胞膜中，分布十分广泛。壳聚糖对不同微生物的抑菌作用可能不同，其抑菌机理可能是进入细胞内干扰微生物细胞的正常的生理功能、吸附于细胞膜上阻止营养物质的运输、改变细胞膜的通透性、螯合金属离子等。壳聚糖对假单胞菌、大肠杆菌等的抑菌作用比苯甲酸钠强22。Sagoo 等认为壳聚糖对大多数细菌的最小山东轻工业学院硕士学位论文 7 抑菌浓度在 0.01%1.0%之间。基于其良好的抑菌效果，壳聚糖被广泛的用于水产品的保鲜。杨胜平23等研究了不同浓度壳聚糖对带鱼冷藏保鲜效果的研究，结果表明 1%壳聚糖将带鱼的一级鲜度延长 23d,二级鲜度延长 67d。吴涛24等研究了不同分子量的壳聚糖对于白鲢鱼丸的货架期品质的影响，得到结论：两种分子量的壳聚糖（30 万和 1万）均表现出显著的抗菌能力，且它们的混合物的抗菌能力更强。溶菌酶 溶菌酶又称胞壁质酶，主要从鸟类和家禽的蛋清中提取得到，其作用是切断细胞壁外膜的 N-乙酰胞壁酸和乙酰葡萄糖胺之间的-1,4 糖苷键，起到杀菌的目的。溶菌酶作为天然的蛋白质，能被人体吸收，不会残留，是一种安全很高的保鲜剂、营养保健品。陈舜胜25将溶菌酶作为主要成份，将其与其他保鲜剂复合使用，用于虾、带鱼段、扇贝和柔鱼条的保鲜中，可以延长保鲜期一倍的时间。一些新鲜水产品（虾、鱼等）用溶菌酶、甘氨酸和食盐复合处理后 5保藏 9d 无异味26。溶菌酶与 Nisin 等几种防腐剂复合保鲜蚌肉，延长保鲜期约一倍的时间，溶菌酶对于控制细菌的增长和减缓 TVBN的上升起到了及其重要的作用27。随着科技的发展和人们生活水平的提高，溶解酶将更广泛的用于水产品保鲜中。微生物源 乳酸链球菌素 乳酸链球菌素（Nisin）是由乳酸链球菌发酵产生的多肽类物质，在人的消化道内很快被分解，无任何毒副作用，是一种高效、安全而有营养的天然食品保鲜剂。Nisin 主要对革兰氏阳性菌起作用，但是如有 EDTA 和柠檬酸盐等 Mg2+螯合剂的存在也可使革兰氏阴性细菌对其敏感。因此 Nisin 在水产品保鲜中具有骑在的应用价值。顾仁勇28等将 Nisin 与溶菌酶及抗坏血酸复合添加到半点叉尾鱼片中去，冷藏保鲜，在确定了最佳的配比：0.5%Nisin，0.3%溶菌酶，3.0%抗坏血酸，最佳配比处理结合真空包装可以使斑点叉尾鱼0下保鲜21d。蓝蔚青29将不同浓度的Nisin用于带鱼冷藏保鲜，以 pH 值、TVBN 值、菌落总数和感官品质考察保鲜效果，取得了较好的结果，Nisin 的最适浓度为 0.5g/L。乳酸链球菌素用于鱼丸中，保持了较好的滋味、气味和色泽，保鲜效果较好。-聚赖氨酸 -聚赖氨酸（-PL）是由白色链霉菌发酵产生的由赖氨酸分子之间的酰胺键连接而成的多聚体，有 20-30 个赖氨酸单体组成。它是一种天然的代谢产物，有很广的抑菌范围和良好的热稳定性，在食品的保鲜中有巨大的应用潜力。在日本，-PL的微生物发酵已实现工业化，并被批准用于方便米饭、熟菜、酱类、面条、饼干、寿司等食品的保鲜防腐。-PL 常用的制剂有酒精、有机酸、甘油酯、甘氨酸等，它们可以对其产生协同增效的作用，增强抑菌能力。倪清艳30等通过 5L 发酵罐生产-PL，测定了其对常见菌的抑菌特性，并将其与醋酸和甘氨酸复合添加到鱼糜中去，结果表明：-PL的 0.1%醋酸复合物抑菌效果好，0.1%的甘氨酸复合物效果次之，对延长鱼糜的保鲜期第 2 章 冷藏大黄鱼中微生物的分离与初步鉴定 8 起到很好的效果。1.3 研究的内容及意义 众所周知，水产品是极易腐败变质的物品，且冷冻水产品在解冻过程中要损失部分水分，所以水产品保鲜剂对渔业经济发展的作用已越来越受到重视。生物防腐剂不但对人体健康无害,有的还具有一定的营养价值,是今后开发的方向。未来水产品的保鲜将朝着以开发天然无毒无害的保鲜剂为主，以其他保鲜方式为辅的方向发展。由于导致鱼肉腐败变质的细菌种类繁多，性质各异，一种防腐剂抑菌性能有限，很难得到较好的保鲜效果；在腐败菌确定的基础上，通过一定的方法选择合适的防腐剂和浓度，才能更科学，更有针对性。本文研究大黄鱼腐败微生物的分布、分离鉴定了优势腐败菌，为有针对性的选择合适的抑菌剂提供依据；研究茶多酚、壳聚糖、聚赖氨酸、Nisin、丁香、桂皮、柠檬酸等几种天然安全防腐剂的抑菌性能，并采用响应面法对其进行复配和优化，优选出复合防腐剂的最佳配比，同时研究复合生物防腐剂对冷藏大黄鱼的保鲜效果。以期为生鱼防腐保鲜问题的解决提供一条新思路，同时也为开发天然无毒安全的新型防腐剂提供了理论基础。山东轻工业学院硕士学位论文 9 第 2 章 冷藏大黄鱼中腐败微生物的分离与初步鉴定 海产鱼贝类容易腐败变质，品质极不稳定，造成这一现象的主要原因有微生物、自溶酶、脂肪氧化等，而影响最大的是微生物。在鱼类储藏的过程中，增加对其致腐败微生物情况的了解，寻求细菌菌群动态变化规律，运用能有效抑制细菌生长的保鲜方式对保证水产品的品质和延长货架期是非常重要的；探求导致产品变质的优势腐败菌可以为靶向抑制鱼腐败新技术的研发提供强有力的基础，同时为开发养殖大黄鱼优势腐败菌生长动力学模型和产品货架期预测模型，优化大黄鱼冷藏链技术参数和快速预测产品品质提供帮助。本章实验对货架期终点的大黄鱼腐败菌进行分离鉴定，通过革兰氏染色、观察其运动性以及各种生理生化实验，确定优势腐败菌的种类和比例，以便于有针对性的选择防腐剂，改善大黄鱼的贮藏，延长大黄鱼的货架期。2.1 实验材料与仪器设备 2.1.1 样品的采集与处理 大黄鱼购自济南海鲜市场，按照 GB-T 18108-2008鲜海水鱼31标准取样，选用大小基本一致的个体（大于或等于 15cm/尾），冰水保存运抵实验室。用无菌水将鱼体清洗、去鳞、去内脏，从每尾鱼中切取 2.5cm 厚的 3 个横截面鱼片（一片在胸鳍之后，一片在胸鳍和肛门之间，一片在肛门之后），用灭过菌的新鲜保鲜袋包装，放置于 4贮藏。每隔一天取出进行感官鲜度评价、挥发性盐基氮(TVBN)及菌落总数(TVC)的测定。2.1.2 仪器与设备 恒温培养箱 上海福玛实验设备有限公司 电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9140A 上海精宏实验设备有限公司 恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司 电子天平 YP3001N 上海精密科学仪器有限公司 电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 水平层流单人净化工作台 HS-840u 苏州净化设备有限公司 立式电热压力蒸汽灭菌器 LDZX-50KB 上海申安医疗器械厂 显微镜 CX31RTSF OLYMPUS 冰箱 BCD-247EI 伊莱克斯 第 2 章 冷藏大黄鱼中微生物的分离与初步鉴定 10 2.2 实验方法 2.2.1 菌落总数测定和分类 样品菌落总数的测定按照 GB/T4789.2-2008食品卫生微生物菌落总数测定 32进行测定。当样品达到贮藏的货架期终点，以无菌操作随机取鱼样，用以灭菌的研钵碾碎鱼肉，取 10g 加入装有 100mL 生理盐水和玻璃珠的三角瓶内，30振荡 20min。进行梯度稀释，选取合适的稀释度（根据样品的新鲜度）进行涂布平板计数，取 0.05mL 涂布于营养琼脂培养基上，适当放置后，30恒温倒置培养 48h，菌落计数。从菌落计数培养基选取菌落数在 30300 的平板，分离整个平板一半的菌株或整个平板的所有菌株。肉眼观察菌落特征完全相同的菌落，分类并计数，每一类分别挑取一株菌，采用营养琼脂划线纯化，革兰氏染色，观察细菌的个体形态及做生理生化鉴定实验，将菌种分类到属。2.2.2 挥发性盐基氮（TVBN）测定 准确称取研碎鱼肉 10g 于 100mL 蒸馏水中，用玻璃棒搅匀，不断振摇，浸渍 30min后过滤，滤液按照 GB/T5009.44-2003挥发性盐基氮的测定33进行测定。每个样品和对照做 2 个平行。2.2.3 细菌群体特征观察 观察记录菌落的形态，包括大小、表面形状、是否隆起、颜色、透明与否、是否光泽等。2.2.4 细菌个体特征观察 细菌染色观察：所用的菌种为幼龄细菌（培养 24h），进行革兰氏及芽孢染色，观察细菌形态、排列方式、革兰氏染色结果以及芽孢的有无。运动性观察：将待测菌种穿刺接种于半固体培养基中，观察运动的情况，如有晕圈，为阳性。2.2.5 细菌生理特征实验 2.2.5.1 荧光素色素 培养基：蛋白胨 20g，琼脂 15g，甘油 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO47H2O 1.5g，pH：7.2，水：1000mL，121灭菌 20min。以幼龄的培养物接种于上述培养基，置于 30培养 1d，3d，5d 后，于紫外灯下观察有无荧光现象。2.2.5.3 碳源利用 山东轻工业学院硕士学位论文 11 培养基：（NH4）2SO4 2.0g，CaCl2 H2O 0.1g，MgSO47H2O 0.2g，NaH2PO4 H2O 0.5g，K2HPO4 0.5g，水 1000mL。被测底物包括葡萄糖、果糖、甘露醇、麦芽糖、丙二酸等，过滤灭菌，终浓度糖醇类为 1%。以菌悬液接种，连续 3 代移种，生长者为阳性。2.2.5.4 生长温度和耐热性 以液体培养物（24h 培养物）一环接入营养液体培养基，置于 4、65培养，连续 3 代移种，生长者为阳性。2.2.6 细菌生化特征实验 2.2.6.1 氧化酶实验 试剂：1%盐酸二甲基对苯二胺溶液于茶色瓶中在冰箱中储存。实验方法：用玻璃棒取被测细菌，涂抹在已滴有上述试剂的滤纸上，如果在 10s内出现红色，为阳性；1min 以上变红或不变色的为阴性。2.2.6.2 接触酶实验 试剂：3%H2O2。实验方法：将 3%过氧化氢滴加在载玻片上，取菌种涂抹在上面，仔细观察有无气泡，有者为阳性，没有的为阴性。2.2.6.3 葡萄糖氧化发酵 培养基：蛋白胨 2 g，NaCl 5 g，K2HPO40.3 g，葡萄糖 10 g，0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12mL，琼脂 4 g，水 1000 mL，pH7.2，121 灭菌 20 min。实验方法：取培养 1824h 的菌种穿刺接种于上述培养基中，每株 4 支，其中支为开管，2 支为闭管。闭管：用灭菌的凡士林油（2/3 凡士林、1/3 液体石蜡）封试管（约0.51cm 厚）用于隔绝空气；不用凡士林油的为开管，用不接种的闭管和开管作对照。30培养 1d,3d,5d,7d,14 d 观察结果。结果判定：氧化型：开管产酸变黄；发酵型：开管和闭管均产酸变黄；产碱型：开管和闭管均不变。2.2.6.4 糖、醇类发酵 培养基：以糖、醇（1%）代替 2.2.6.3 中的葡萄糖。实验方法：将幼龄菌种穿刺接种于上述培养基，30培养 1d、3d、5 d 后观察。阳性：变黄；阴性：不变或变蓝。2.2.6.5 硝酸盐 培养基：营养琼脂培养基（液体），KNO3 1g，pH7.2，121 灭菌 20 min。试剂：二苯胺试剂和格里斯试剂。实验方法：将幼龄菌种接种于硝酸盐培养基中，置于 30 培养，另留两管不接第 2 章 冷藏大黄鱼中微生物的分离与初步鉴定 12 种作对照，每株作二个平行。将培养液倒入两支干净试管中，各加 1 滴 A 液和 B 液，观察结果。结果判定：阳性：溶液变成红色、橙色、棕色等；阴性：溶液不变色，加 2 滴二苯胺试剂，变成蓝色。如果没有变成蓝色，按硝酸盐阳性处理。2.2.6.5 产硫化氢 培养基：蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，牛肉膏 10 g，半胱氨酸 0.5 g，水 1000 mL，pH7.2，121灭菌 20 min。实验方法：将剪成 0.51 cm 宽的滤纸条（长度根据试管与培养基高度而定）用5%醋酸浸透，烘干，放于培养皿中灭菌备用；接种幼龄菌种于试管液体培养基中，用无菌镊子夹取一条试纸于液面上方固定，适温培养 3d、7d、14 d 观察结果。阳性：纸条变为黑色；阴性：纸条颜色不变。2.2.6.6 明胶液化 培养基：明胶 150g，蛋白胨 5g，水 1000 mL，pH7.2，121灭菌 20 min。实验方法：取幼龄菌种穿刺接种上述培养基中，留两支不接种为空白对照。培养2，7，10 和 14 d，在 20以下观察。如果观察到细菌生长，明胶表面无凹陷而且是稳定的凝块，则为明胶水解阴性；如果细菌生长同时明胶表面凹陷或有液体出现，则为阳性；若菌未生长，则是培养基不适合或不在明胶培养基上生长。2.2.6.7 酯酶（Tween 80、Tween 20）培养基：蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，CaCl2 H2O 0.1 g，琼脂 9 g，水 1000 mL，pH 7.2，121 灭菌 20 min。实验方法：冷却培养基于 45，加 Tween80 及 Tween20 至终浓度为 1%，倒平板。划线接种幼龄培养物于平板，培养 7 d，在生长的周围有模糊的晕圈者为阳性，没有晕圈者为阴性。2.2.6.8 鸟氨酸脱羧 本实验用的是鸟氨酸生化鉴定管，在无菌条件下打开西林瓶，取幼龄菌种接种于西林瓶中，敞开放置，恒温培养。每种被检菌同时接种氨基酸对照管一支，1824 小时后未见阳性结果，继续培养 4d，再做最终结果判定。接菌管蓝绿色对照管变黄为阳性，接菌管与对照管均变黄为阴性。2.2.6.9 精氨酸双水解酶 培养基：蛋白胨 1 g，酚红 0.01 g，NaCl 5 g，L-精氨酸盐 10 g，K2HPO4 0.3 g，水 1000 mL，琼脂 6 g。实验方法：取幼龄菌种穿刺接种，并用凡士林油封管，培养 3、7、14 天，有不含精氨酸空白对照。培养基变红者为阳性，不变者为阴性。山东轻工业学院硕士学位论文 13 2.2.6.10 脲酶 将培养至 3d 或者 7d 的菌苔悬浮成菌悬液，滴入酚红试剂，分作两份，一份加少许尿素，一份不加。几分钟后变红者为阳性，不变的为阴性。2.3 结果与分析 2.3.1 菌落计数和挥发性盐基氮 新鲜大黄鱼菌落总数为 2.4103cfu/g，TVBN 为 7.01mg/100g。4贮藏 6d 时，达到了货架期终点，菌落总数为 7.1107cfu/g，挥发性盐基氮为 24.92 mg/100g。表 2.1 大黄鱼品质变化 时间（d）TVBN（mg/100g）菌落总数(cfu/g)0 7.01 2.4103 6 24.92 7.1107 2.3.2 细菌菌落特征 根据分离获得的 126 株细菌形态特征分为 13 组，如表 2.2 所示，大部分菌落形态为圆形、隆起、表面光滑、半透明，少数形态不规则；菌落颜色各异，多为黄色、白色和粉色。表 2.2 细菌菌落特征 组别 菌落 颜色 菌落 形状 菌苔 形状 菌落隆起菌落 边缘 菌落表面菌落光泽菌落 质地 透明度 01 白色 圆形 扩展状 微隆不整齐 光滑有 湿润 不透明 02 白色 圆形 扩展状 微隆不整齐 光滑有 湿润 半透明 0