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教育学叶绿素荧光分析技术与应用.pptx

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资源描述

1、叶绿素荧光分析技术与应用叶绿素荧光分析技术与应用1931193119311931年,年,年,年,KautskyKautskyKautskyKautsky和和和和HirschHirschHirschHirsch第一次用肉眼发现叶绿素荧光动力第一次用肉眼发现叶绿素荧光动力第一次用肉眼发现叶绿素荧光动力第一次用肉眼发现叶绿素荧光动力学现象(学现象(学现象(学现象(Kautsky effectKautsky effectKautsky effectKautsky effect)距今已有)距今已有)距今已有)距今已有80808080多年,但把叶绿素荧多年,但把叶绿素荧多年,但把叶绿素荧多年,但把叶绿素荧

2、光动力学作为一种技术应用于光合作用的研究中则是近光动力学作为一种技术应用于光合作用的研究中则是近光动力学作为一种技术应用于光合作用的研究中则是近光动力学作为一种技术应用于光合作用的研究中则是近20202020年年年年的事。叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光的事。叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光的事。叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光的事。叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作系统对光能的吸收、传

3、递、耗散、分配等方面具有独特的作用,与用,与用,与用,与“表观性表观性表观性表观性”的气体交换指标相比,叶绿素荧光参数更的气体交换指标相比,叶绿素荧光参数更的气体交换指标相比,叶绿素荧光参数更的气体交换指标相比,叶绿素荧光参数更具有反映具有反映具有反映具有反映“内在性内在性内在性内在性”特点。因此,叶绿素荧光动力学技术被特点。因此,叶绿素荧光动力学技术被特点。因此,叶绿素荧光动力学技术被特点。因此,叶绿素荧光动力学技术被称为测定叶片光合功能快速、无损的探针,并广泛应用于植称为测定叶片光合功能快速、无损的探针,并广泛应用于植称为测定叶片光合功能快速、无损的探针,并广泛应用于植称为测定叶片光合功能

4、快速、无损的探针,并广泛应用于植物生理学、生态学和农业科学研究中。物生理学、生态学和农业科学研究中。物生理学、生态学和农业科学研究中。物生理学、生态学和农业科学研究中。基本概念:基本概念:绿色植物或含叶绿素的部分组织在黑暗中适应片刻或用近红绿色植物或含叶绿素的部分组织在黑暗中适应片刻或用近红外光预照射,然后在可见光下激发,并用荧光仪检测,会发外光预照射,然后在可见光下激发,并用荧光仪检测,会发现植物绿色组织发出一种微弱的暗红色的、强度随时间不断现植物绿色组织发出一种微弱的暗红色的、强度随时间不断变化的荧光信号,这个过程称为叶绿素变化的荧光信号,这个过程称为叶绿素a荧光诱导动力学,简荧光诱导动力

5、学,简称为称为叶绿素荧光动力学叶绿素荧光动力学。荧光来源:荧光来源:由于叶绿素分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部振动上,由于叶绿素分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部振动上,辐射出的能量就小,根据波长与分子能量成反比的规律辐射出的能量就小,根据波长与分子能量成反比的规律(E=hv2),反射光的波长比入射光的波长要长一些。所以叶绿素,反射光的波长比入射光的波长要长一些。所以叶绿素溶液在入射光下呈绿色,而在反射光下呈红色。溶液在入射光下呈绿色,而在反射光下呈红色。绝大部分植物体内叶绿素荧光来自绝大部分植物体内叶绿素荧光来自PSII的天线色素系统,而的天线色素系统,而PSI色素系统基本不产生荧光。

6、色素系统基本不产生荧光。荧光来源:荧光来源:叶绿素分子吸收量子后,由最稳定的、最低能量的基态(常态)叶绿素分子吸收量子后,由最稳定的、最低能量的基态(常态)提高到一个不稳定的、高能状态的激发态。由于激发态不稳定,提高到一个不稳定的、高能状态的激发态。由于激发态不稳定,迅速向较低能态转变,能量有的以热量的形式散失,有的以光形迅速向较低能态转变,能量有的以热量的形式散失,有的以光形式散失。从第一单线态回到基态所发射的光就成为荧光。荧光的式散失。从第一单线态回到基态所发射的光就成为荧光。荧光的寿命很短,约为寿命很短,约为10-810-9 s。光合电子传递的”Z图”激发能激发能光化学反应光化学反应形成

7、同化力形成同化力热耗散热耗散荧光荧光荧光测量基础:荧光测量基础:植物叶片所吸收的光能有植物叶片所吸收的光能有3个走向:光合驱动、热能、叶绿素荧光。个走向:光合驱动、热能、叶绿素荧光。3个过程之间存在竞争,其中任何一个效率的增加都将造成另外两个过程之间存在竞争,其中任何一个效率的增加都将造成另外两个产量的下降。测量叶绿素荧光产量,可以获得光化学过程与热个产量的下降。测量叶绿素荧光产量,可以获得光化学过程与热耗散效率的变化信息。耗散效率的变化信息。CO2CO2固定固定光呼吸光呼吸Mehler Mehler 反应反应N N代谢代谢荧光是研究光能分配的探针荧光是研究光能分配的探针叶绿素荧光叶绿素荧光:

8、植物吸收的一小部分光重新以光的形式发射出来植物吸收的一小部分光重新以光的形式发射出来P+D+F=1 F=1-P-D光化学的光化学的 和和 耗散性的耗散性的 荧光荧光 淬灭淬灭(F)(D)(P)活体叶绿素荧光是光合作用的有效探针活体状态下,叶绿素荧光几乎全部来源于PS II的Chl a(包括天线Chl a),活体叶绿素荧光提供的快速信息仅仅反映了PS II对激发能的利用和耗散情况光合作用过程的各个步骤密切偶联,因此任何一步的变化都会影响到PS II从而引起荧光变化,也就是说通过叶绿素荧光几乎可以探测所有光合作用过程的变化尽管叶绿素荧光产量仅占叶片吸收光能问题的尽管叶绿素荧光产量仅占叶片吸收光能问

9、题的12%,但测,但测量却非常简单。荧光光谱不同于吸收光谱,其波长更长,因量却非常简单。荧光光谱不同于吸收光谱,其波长更长,因此荧光测量可以通过把叶片经过给定波长的光线的照射,同此荧光测量可以通过把叶片经过给定波长的光线的照射,同时测量发射光中波长较长的部分光线的量来实现。时测量发射光中波长较长的部分光线的量来实现。叶绿素荧光测量是相对的,因为光线不可避免会有损失,因叶绿素荧光测量是相对的,因为光线不可避免会有损失,因此,所有分析必须把数据进行标准化处理,包括进一步计算此,所有分析必须把数据进行标准化处理,包括进一步计算的许多参数。的许多参数。将绿色植物或含叶绿素的部分组织,如叶片、芽、嫩枝条

10、、将绿色植物或含叶绿素的部分组织,如叶片、芽、嫩枝条、茎或单细胞藻类悬液放在暗中适应片别,或用近红外光预照茎或单细胞藻类悬液放在暗中适应片别,或用近红外光预照射,然后在可见光下激发,并用荧光计检测,结果就会发现射,然后在可见光下激发,并用荧光计检测,结果就会发现植物绿色组织会发出一种微弱的暗红色强度随时间不断变化植物绿色组织会发出一种微弱的暗红色强度随时间不断变化的荧光信号,这过程称为植物体内叶绿素的荧光信号,这过程称为植物体内叶绿素a荧光诱导动力学,荧光诱导动力学,简称为叶绿素荧光动力学。简称为叶绿素荧光动力学。绝大部分是来自叶绿体光系统绝大部分是来自叶绿体光系统II(PSII)的天线色素蛋

11、白复合体的天线色素蛋白复合体中的叶绿素中的叶绿素a分子,荧光发射波长范围约在分子,荧光发射波长范围约在650780nm,荧,荧光发射峰在光发射峰在685nm和和735nm,其荧光激发光谱与叶绿体的吸,其荧光激发光谱与叶绿体的吸收光谱近似,荧光激发峰在收光谱近似,荧光激发峰在438nm与与480nm左右。左右。根据现在国际上的统一命名,根据现在国际上的统一命名,可把荧光诱导曲线划分为:可把荧光诱导曲线划分为:O(原点原点)I(偏转偏转)D(小坑小坑)或或pl(台阶台阶)P(最高峰最高峰)S(半稳态半稳态)M(次峰次峰)T(终点终点)这几个相这几个相(phase)。有时在。有时在O和和I之间还可辨

12、认出一个扔点之间还可辨认出一个扔点称为称为J相。其中相。其中OP相为荧相为荧光快速上升阶段光快速上升阶段(12s),从,从PT为荧光慢速下降为荧光慢速下降(猝灭猝灭)阶段阶段(45s),在此阶段,往),在此阶段,往往出现复杂的情况,有时没往出现复杂的情况,有时没有有M峰,有时出现几个渐次峰,有时出现几个渐次降低的峰,因叶片的生理状降低的峰,因叶片的生理状态不同而异。一般而言,遭态不同而异。一般而言,遭受环境胁迫的叶片受环境胁迫的叶片M峰消失,峰消失,而生理状态良好的叶片往往而生理状态良好的叶片往往在在P峰之后有几个峰出现。这峰之后有几个峰出现。这可能反映了同化力形成和使可能反映了同化力形成和使

13、用之间从不平衡到平衡的一用之间从不平衡到平衡的一个快速的调节过程。个快速的调节过程。叶绿素荧光诱导动力学叶绿素荧光诱导动力学OIDPSMT曲线曲线经暗适应的绿色植物样品突然受到可见光照射时,体内叶绿经暗适应的绿色植物样品突然受到可见光照射时,体内叶绿素分子可在纳秒素分子可在纳秒(ns)级时间内发出一定强度的荧光,此瞬时的级时间内发出一定强度的荧光,此瞬时的荧光诱导相位称为初相或荧光诱导相位称为初相或“O”相,此时的荧光称为固定荧光相,此时的荧光称为固定荧光(Fo),然后荧光强度增加的速度减慢,因而在,然后荧光强度增加的速度减慢,因而在Fo处形成拐点,处形成拐点,接着以毫秒级速度形成一个缓台阶,

14、称为接着以毫秒级速度形成一个缓台阶,称为“I”相和相和“D”相,相,数秒后荧光强度可达最高点,称为数秒后荧光强度可达最高点,称为“P”峰。若所用激发光强峰。若所用激发光强度达到或超过被测样品光反应的光饱和点时,度达到或超过被测样品光反应的光饱和点时,P峰即趋于或等峰即趋于或等于最大荧光于最大荧光(Fm)。荧光强度超过。荧光强度超过Fo那一部分的荧光称为可变那一部分的荧光称为可变荧光荧光(Fv)。在。在P峰之后,植物荧光通常经峰之后,植物荧光通常经12次阻尼振荡次阻尼振荡(称较称较大峰大峰“M1”和和“M 2”),才降到接近,才降到接近Fo的稳定的的稳定的“T”相终水平。相终水平。荧光强度下降的

15、过程现称为荧光猝灭。根据植物材料和暗适荧光强度下降的过程现称为荧光猝灭。根据植物材料和暗适应时间的不同,上述荧光诱导动力学过程要延续应时间的不同,上述荧光诱导动力学过程要延续36分钟左分钟左右。右。叶绿素荧光动力学的测量可采用调制式与非调制式两种不同方法叶绿素荧光动力学的测量可采用调制式与非调制式两种不同方法:非调制式荧光计的结构比较简单,它仅需要一个强连续光源,此光非调制式荧光计的结构比较简单,它仅需要一个强连续光源,此光源既作为激发光,又作为测量光,但是为了能够捕捉到植物荧光信源既作为激发光,又作为测量光,但是为了能够捕捉到植物荧光信号上升前沿中的拐点,要求整个系统的时间分辨率达到毫秒号上

16、升前沿中的拐点,要求整个系统的时间分辨率达到毫秒(ms)级。级。在光源与样品之间,通常加有蓝色的长波截止滤光片和毫秒级电子在光源与样品之间,通常加有蓝色的长波截止滤光片和毫秒级电子快门。现在国外也有用亮度较大的发光二极管作为光源的,由于发快门。现在国外也有用亮度较大的发光二极管作为光源的,由于发光二极管光源的上升前沿较快,这样就可省去电子快门。光电转换光二极管光源的上升前沿较快,这样就可省去电子快门。光电转换接收器可用光电倍增管或光电三极管,它们的光谱响应要选择与植接收器可用光电倍增管或光电三极管,它们的光谱响应要选择与植物荧光发射波长范围相吻合。在接收器之前通常加有红色的短波截物荧光发射波长

17、范围相吻合。在接收器之前通常加有红色的短波截止滤光片,以完全滤掉激发光。毫秒级记录设备可用瞬态记录器、止滤光片,以完全滤掉激发光。毫秒级记录设备可用瞬态记录器、记忆示波器或带有记忆示波器或带有A/D转换的计算机等。在控制电子快门与记录荧转换的计算机等。在控制电子快门与记录荧光信号之间要有一个同步触发装置或同步程序,以保证取样和记录光信号之间要有一个同步触发装置或同步程序,以保证取样和记录过程与电子快门动作相同步。为了减少样品对荧光的重复吸收,通过程与电子快门动作相同步。为了减少样品对荧光的重复吸收,通常是把接受器与入射的激发光安排在样品的同一侧。常是把接受器与入射的激发光安排在样品的同一侧。叶

18、绿素荧光动力学的测量方法叶绿素荧光动力学的测量方法调制式动力学荧光计至少应具有两束光:调制的弱测量光和连续的调制式动力学荧光计至少应具有两束光:调制的弱测量光和连续的强化光。为了使测量光本身完全不被接收器直接检出,测量光中和强化光。为了使测量光本身完全不被接收器直接检出,测量光中和接收器前使用的滤光片应完全无交叉重叠的光谱成分。光化光对接接收器前使用的滤光片应完全无交叉重叠的光谱成分。光化光对接收器信号的干扰,可用折光转盘来解决。为了能够精确地测定收器信号的干扰,可用折光转盘来解决。为了能够精确地测定Fo值,值,经验证明测量光到达样品表面时的强度要小于经验证明测量光到达样品表面时的强度要小于1

19、0ergscm-2 s-1。由。由于该强度在室温下不足以引起还原态于该强度在室温下不足以引起还原态QA的积累,因而荧光强度将始的积累,因而荧光强度将始终保持在较低的、恒定的终保持在较低的、恒定的Fo水平上。此时若在照有测量光的样品上水平上。此时若在照有测量光的样品上再叠加一束饱和光化光,植物荧光才迅速上升,并达到再叠加一束饱和光化光,植物荧光才迅速上升,并达到P峰,这就峰,这就是是Fv部分,此后荧光猝灭过程与前述非调制荧光猝灭过程相似。应部分,此后荧光猝灭过程与前述非调制荧光猝灭过程相似。应该着重指出的是,由于调制式动力学荧光计采用了选频或锁相放大该着重指出的是,由于调制式动力学荧光计采用了选

20、频或锁相放大技术,使它只检出与测量光具有相同频率和固定相位差的植物荧光技术,使它只检出与测量光具有相同频率和固定相位差的植物荧光调制信号,而对其他背景光的干扰不放感。调制信号,而对其他背景光的干扰不放感。所谓调制技术,就是说用于激发荧光的测量光具有一定的调制(开/关)频率,检测器只记录与测量光同频的荧光,因此调制荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光,包括背景光很强时。正是由于调制技术的出现,才使得叶绿素荧光由传统的“黑匣子”(避免环境光)测量走向了野外环境光下测量,由生理学走向了生态学。所谓饱和脉冲技术,就是打开一个持续时间很短(一般小于1 s)的强光关闭所有的电子门(光合作用被暂时抑制),从而

21、使叶绿素荧光达到最大。饱和脉冲(Saturation Pulse,SP)可被看作是光化光的一个特例。光化光越强,PS II释放的电子越多,PQ处累积的电子越多,也就是说关闭态的电子门越多,F越高。当光化光达到使所有的电子门都关闭(不能进行光合作用)的强度时,就称之为饱和脉冲。打开饱和脉冲时,本来处于开放态的电子门将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热,F达到最大值。经过充分暗适应后,所有电子门均处于开放态,打开测量光得到Fo,此时给出一个饱和脉冲,所有的电子门就都将该用于光合作用的能量转化为了荧光和热,此时得到的叶绿素荧光为Fm。根据Fm和Fo可以计算出PS II的最大量子产量Fv/Fm

22、=(Fm-Fo)/Fm,它反映了植物的潜在最大光合能力。在光照下光合作用进行时,只有部分电子门处于开放态。如果给出一个饱和脉冲,本来处于开放态的电子门将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热,此时得到的叶绿素荧光为Fm。根据Fm和F可以求出在当前的光照状态下PS II的实际量子产量Yield=PSII=F/Fm=(Fm-F)/Fm,它反映了植物目前的实际光合效率。在光照下光合作用进行时,只有部分电子门处于关闭态,实时荧光F比Fm要低,也就是说发生了荧光淬灭(quenching)。植物吸收的光能只有3条去路:光合作用、叶绿素荧光和热。根据能量守恒:1光合作用叶绿素荧光热。可以得出:叶绿素荧光

23、1光合作用热。也就是说,叶绿素荧光产量的下降(淬灭)有可能是由光合作用的增加或热耗散的增加引起的。由光合作用的引起的荧光淬灭称之为光化学淬灭(photochemical quenching,qP);由热耗散引起的荧光淬灭称之为非光化学淬灭(non-photochemical quenching,qN或NPQ)。光化学淬灭反映了植物光合活性的高低;非光化学淬灭反映了植物耗散过剩光能为热的能力,也就是光保护能力。体内叶绿素荧光动力学有两个显著的特点:一是它可将植物发出的体内叶绿素荧光动力学有两个显著的特点:一是它可将植物发出的荧光区分为性质上完全不同的两个部分荧光区分为性质上完全不同的两个部分固定

24、荧光固定荧光(Fo)部分和可部分和可变荧光变荧光(Fv)部分。固定荧光部分。固定荧光(Fo)代表不参与代表不参与PSII光化学反应的光能光化学反应的光能辐射部分;可变荧光辐射部分;可变荧光(Fv)代表可参与代表可参与PSII光化学反应的光能辐射部光化学反应的光能辐射部分。因而根据可变荧光分。因而根据可变荧光(Fv)在总的最大荧光在总的最大荧光(Fm=Fv十十F。)中所占的中所占的比例(比例(FvFm),即可简便地得出植物,即可简便地得出植物PSII原初光能转换效率,另原初光能转换效率,另一个特点是,荧光动力学是测定植物从暗中转到光下,其光合作用一个特点是,荧光动力学是测定植物从暗中转到光下,其

25、光合作用功能从休止钝化状态转为局部活化状态,直到全部正常运转状态过功能从休止钝化状态转为局部活化状态,直到全部正常运转状态过程中的荧光动态变化,因而它包含着十分丰富的光合信息,这远不程中的荧光动态变化,因而它包含着十分丰富的光合信息,这远不是一般静态焚光测量所能比拟的。是一般静态焚光测量所能比拟的。在体内叶绿素荧光动力学测定中,当样品的叶绿素浓度和荧光计的在体内叶绿素荧光动力学测定中,当样品的叶绿素浓度和荧光计的激发光强恒定时,激发光强恒定时,PS II原初电子受体原初电子受体QA的氧还状态是决定体内叶的氧还状态是决定体内叶绿素荧光强弱的主要因素。当植物经一段时间暗适应,或用优先为绿素荧光强弱

26、的主要因素。当植物经一段时间暗适应,或用优先为光系统光系统I(PSl)所利用的长波光照射后,其体内所利用的长波光照射后,其体内PSII的的QA和随后的电和随后的电子受体子受体QB和和PQ库等均完全失去电子而被氧化,这时库等均完全失去电子而被氧化,这时PS II反应中心反应中心可接受光电子,即处于可接受光电子,即处于“开放开放”状态,这时荧光强度最弱,即为状态,这时荧光强度最弱,即为Fo,或处于,或处于“O”初始相;当植物被饱和光激发,使初始相;当植物被饱和光激发,使PSII电子受体电子受体QA、QB和和PQ库等完全被还原时,库等完全被还原时,PSII反应中心不再接受光电子,即处反应中心不再接受

27、光电子,即处于于“关闭关闭”状态,这时荧光强度最强,即为状态,这时荧光强度最强,即为Fm,或处于,或处于“P”峰相。峰相。植物经短暂照光达到植物经短暂照光达到“P”峰后,由于一些光合酶系逐渐被活化,峰后,由于一些光合酶系逐渐被活化,使使PSI开始运转,而将开始运转,而将PSII还原侧的还原态电子受体还原侧的还原态电子受体QA-、QB-和和PQH2等再氧化,从而引起荧光强度的猝灭,这称为等再氧化,从而引起荧光强度的猝灭,这称为qQ猝灭;植物猝灭;植物在光的持续照射下,紧接着在光的持续照射下,紧接着qQ猝灭的增加,在光合膜的两侧逐渐建猝灭的增加,在光合膜的两侧逐渐建立起质子梯度和形成膜高能态。试验

28、证明,它们也可造成荧光猝灭,立起质子梯度和形成膜高能态。试验证明,它们也可造成荧光猝灭,这种猝灭称为能量猝灭,或这种猝灭称为能量猝灭,或qE淬灭。淬灭。qQ和和qE灭是植物在正常生理条件下的两个最主要的猝灭成分。灭是植物在正常生理条件下的两个最主要的猝灭成分。qQ猝灭因为是由猝灭因为是由QA-等再氧化所造成,因而它与光合电子传递、光合等再氧化所造成,因而它与光合电子传递、光合放氧等过程直接相关;而放氧等过程直接相关;而qE猝灭因为是由质子梯度和膜高能态所引猝灭因为是由质子梯度和膜高能态所引起,因而它只与起,因而它只与ATP的形成、积累以及与光合膜的状态有关,而与的形成、积累以及与光合膜的状态有

29、关,而与光合电子传递和光合气体交换无直接的联系。光合电子传递和光合气体交换无直接的联系。以上对荧光动力学中两种猝灭成分的分析称为以上对荧光动力学中两种猝灭成分的分析称为Q分析,它对于正确分析,它对于正确理解和分析叶绿素荧光动力学猝灭过程的光合生理意义及其与其他理解和分析叶绿素荧光动力学猝灭过程的光合生理意义及其与其他光合参数,特别是与气体交换的关系,是十分重要的,它消除了过光合参数,特别是与气体交换的关系,是十分重要的,它消除了过去看起来似乎是相互矛盾的一些试验结果,从而为叶绿素荧光动力去看起来似乎是相互矛盾的一些试验结果,从而为叶绿素荧光动力学在理论上的进一步深入研究和在实际中的广泛应用扫清

30、了障碍,学在理论上的进一步深入研究和在实际中的广泛应用扫清了障碍,这是近年来荧光动力学在理论研究方面的重要新进展。这是近年来荧光动力学在理论研究方面的重要新进展。根据上述根据上述Q分析理论,西德分析理论,西德Schreiber博土设计了一种新型的脉冲调博土设计了一种新型的脉冲调制荧光计,该仪器在过去一般调制荧光计的基础上,又增加一束强制荧光计,该仪器在过去一般调制荧光计的基础上,又增加一束强饱和闪光饱和闪光(2000Wcm-2),它以约,它以约5秒一次的频率,与一般段调制荧秒一次的频率,与一般段调制荧光计原有的强连续光化光一起,共同照射激发植物样品,以瞬时完光计原有的强连续光化光一起,共同照射

31、激发植物样品,以瞬时完全消除全消除qQ猝灭,结果在原来荧光动力学的曲线上,便形成许多叠加猝灭,结果在原来荧光动力学的曲线上,便形成许多叠加的锯齿状荧光脉冲,这样从原有的荧光动力学曲线和锯齿状荧光脉的锯齿状荧光脉冲,这样从原有的荧光动力学曲线和锯齿状荧光脉冲包络线中,就可计算出冲包络线中,就可计算出qQ和和qE两个成分。此外,该仪器还具有两个成分。此外,该仪器还具有不怕其他强光源干扰的优点,甚至可拿到光下现场操作。此类荧光不怕其他强光源干扰的优点,甚至可拿到光下现场操作。此类荧光计的代表性产品是西德计的代表性产品是西德Walz公司生产的叶绿素荧光测定系统公司生产的叶绿素荧光测定系统(PAM)。(

32、1)compact basic device(2)external rechargeable battery(3)battery charger(4)PC-HP-200(5)special fiberoptics(6)leaf-clip holder permits simultaneous PAR and C measurements(7)external halogen lamp(8).dark leaf clip(9)distance leaf-clip(10)separate micro quantum/temperature sensor(11)compact tripod,used

33、 to mount basic device,leaf-clip holder and external halogen lamp(12).transport case Measuring light source:Red LED,650 nm,standard intensity 0.1 mol ms PAR;modulation frequency 0.6 or 20 kHz;Auto 20 kHz functionActinic light sources:Red LED-array,665 nm,max.600 mol ms PAR and far-red LED,730 nm,max

34、.15 W mHalogen lamp:8 V/20 W,blue-enriched,710 nm);selective window amplifier(patented)Measured parameters:Fo,Fm,Fm,F,Fo,Fv/Fm(max.Yield),F/Fm(Yield),qP,qN,NPQ,PAR and C(using Leaf-Clip Holder 2030-B or Micro Quantum/Temp.-Sensor 2060-M),ETR(i.e.PAR x F/Fm)User interface:IBM/IBM-compatible PC(80286

35、upwards)or HP-200/P Palmtop PC;connection via RS 232,19200 baud;keyboard operation;monitor screen displayData acquisition:Via PC using DA-2000 softwareData output:Display and printout via PC;analog output 0 to 2.5 VPower supply:Internal rechargeable battery 12 V/1.2 Ah,providing power for up to 500

36、yield measurements;external 12 V battery;Battery Charger 2020-LDimensions:20 cm x 10.5 cm x 8.5 cm(L x W x H)Weight:2 kg(incl.battery)以反应常数表示三种反应的速度以反应常数表示三种反应的速度kP 光化学反应光化学反应 photo-reactionkF 发射荧光发射荧光 fluorescencekD 热耗散热耗散 Energy dissipation荧光产额可表示为:荧光产额可表示为:F=kF/(kF+kP+kD)F=kF/(kF+kP+kD)光合光合量子产额可表

37、示为:量子产额可表示为:P=kP/(kF+kP+kD)P=kP/(kF+kP+kD)热耗散产额热耗散产额可表示为:可表示为:D=kD/(kF+kP+kD)D=kD/(kF+kP+kD)PSIIPSII作用中心完全开放时,作用中心完全开放时,kPkP最大,最大,kFkF最低,此时的荧光称为初始荧光最低,此时的荧光称为初始荧光Fo;Fo;PSIIPSII作用中心完全关闭时,作用中心完全关闭时,kP=0kP=0,kFkF最大,此时的荧光称为最大荧光最大,此时的荧光称为最大荧光Fm;Fm;Fm Fm 与与 FoFo之差(之差(Fm-Fo=Fv)Fm-Fo=Fv)是因为光化学反应进行而猝灭的荧光,称为可

38、变荧光是因为光化学反应进行而猝灭的荧光,称为可变荧光Fv.Fv.显然,光化学反应的最大潜能可表示为:显然,光化学反应的最大潜能可表示为:P=(P=(Fm-Fm-Fo)/Fo)/Fm=(Fm-Fo)/Fm=Fv/FmFm=(Fm-Fo)/Fm=Fv/Fm Fv/Fm Fv/Fm 是反映光合效率的重要指标是反映光合效率的重要指标 分析:分析:Fm Fm 下降、下降、Fv/FmFv/Fm下降、下降、FoFo上升的原因上升的原因叶绿素荧光动力学的生物学意义叶绿素荧光动力学的生物学意义信号记录信号记录饱和光饱和光光化光光化光测量光测量光远红光远红光光电检测器光电检测器反应杯反应杯信号扩大器信号扩大器长波

39、截止滤光长波截止滤光片片670 nm 短波截止滤光片短波截止滤光片 700 nm 光导纤维光导纤维PAM结构示意图结构示意图光合光合作用作用光化学光化学RCLHC热热MRFo光合光合作用作用光化学光化学RCLHC热热MRFmSR打断!打断!光合光合作用作用光化学光化学RCLHC热热MRFAR光合光合作用作用光化学光化学RCLHC热热MRFmSR打断!打断!AR1234叶绿素荧光诱导动力学曲线origininflection(intermediate)peakdippeakquasi-steady state a maximum terminal steady state PAM测量的荧光曲线饱

40、和脉冲法SP叶绿素荧光术语术术 语语 意意 义义 Fo 初始荧光初始荧光,也称基础荧光,是在暗适应状态下当,也称基础荧光,是在暗适应状态下当PS II的所有反应中心的所有反应中心处于完全开放状态(处于完全开放状态(qP=1)并且所有的非光化学过程处于最小时)并且所有的非光化学过程处于最小时(qN=0)的荧光产量的荧光产量 Fm 最大荧光最大荧光,是在暗适应状态下当,是在暗适应状态下当PS II的所有反应中心处于完全关闭状的所有反应中心处于完全关闭状态态(qP=0)并且所有的非光化学过程处于最小时并且所有的非光化学过程处于最小时(qN=0)的荧光产量的荧光产量 Fv 暗适应状态下当所有的非光化学

41、过程处于最小时的暗适应状态下当所有的非光化学过程处于最小时的最大可变荧光最大可变荧光,Fv=Fm-Fo Fp 暗适应状态下打开光化光后的最大荧光产量(暗适应状态下打开光化光后的最大荧光产量(Kautsky曲线中的曲线中的P点点)Fm 在光适应状态下当在光适应状态下当PS II的所有反应中心处于关闭态(的所有反应中心处于关闭态(qP=0)并且所有)并且所有的非光化学过程处于最优态时(的非光化学过程处于最优态时(qN0)的荧光产量)的荧光产量 Fo 在光适应状态下当在光适应状态下当PS II的所有反应中心处于开放态(的所有反应中心处于开放态(qP=1)并且所有)并且所有的非光化学过程处于最优态时(

42、的非光化学过程处于最优态时(qN0)的荧光产量。)的荧光产量。Fv 任意光适应状态下的最大可变荧光,任意光适应状态下的最大可变荧光,Fv=Fm-Fo Fs 稳态荧光产量,当外界条件保持恒定时,照射光化光后达稳定值时的稳态荧光产量,当外界条件保持恒定时,照射光化光后达稳定值时的荧光产量(荧光产量(qP0,qN0)Fv/Fm:PS II的最大光化学量子产量(Maximum quantum yield of PS II photochemistry),又叫原初光化学的最大产量,PS II光化学反应的潜在产量,PS II潜在最大量子产量等。反映了当所有的PS II反应中心均处于开放态时的量子产量。Fv

43、/Fm=(Fm-Fo)/Fm;0Fv/Fm1 高等植物 0.8320.004;藻类稍低叶绿素荧光参数叶绿素荧光参数当植物或藻类受到胁迫(当植物或藻类受到胁迫(Stress)时,)时,Fv/Fm显著下降显著下降!Fv/Fm,qP,qN,NPQ,Fv/Fm,PS II,ETR等等 qP:光化学淬灭(Photochemical quenching)即激发能被开放的反应中心捕获并转化为化学能而导致的荧光淬灭,反映了光适应状态下PS II进行光化学反应的能力。qP=(Fm-Fs)/Fv=1-(Fs-Fo)/(Fm-Fo);0qP1叶绿素荧光参数qN:可变Chl荧光的非光化学淬灭 qN=(Fv-Fv)/F

44、v=1-(Fm-Fo)/(Fm-Fo);0qN1NPQ:Chl荧光的非光化学淬灭 NPQ=(Fm-Fm)/Fm=Fm/Fm-1;0NPQ+不需测定Fo,适合野外调查叶绿素荧光参数叶绿素荧光参数非光化学淬灭(非光化学淬灭(Non-photochemical quenching):):qN or NPQFv/Fm:PS II光化学的有效量子产量(Effective quantum yield of PS II photochemistry)Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm=1-Fo/Fm;0 Fv/Fm 1由于在光适应状态下非光化学过程得到活化,因此Fv/Fm往往小于Fv/Fm 叶绿素荧光参数叶绿

45、素荧光参数叶绿素荧光参数PS II:PS II光化学能量转换的有效量子产量(Effective quantum yield of photochemical energy conversion in PS II)也叫PS II(线性)电子传递的实际量子产量,PS II复合体吸收的每个光量子引起电子传递的效率,PS II光化学能量转换的总量子产量,PS II能量转换的实际效率,PS II光化学的量子效率,用于PS II光化学的能量占PS II天线系统吸收的总光能的比例,以及PS II有效光化学量子产量 PS II=(Fm-Fs)/Fm=F/Fm=qPFv/Fm;0PS II 1不需暗适应,不需测

46、定Fo,适合野外调查 rETR:相对电子传递速率(relative electron transport rate)ETR=PARPS II0.840.5 ETR随PAR的变化图即为光响应曲线叶绿素荧光参数叶绿素荧光参数 荧光参数的意义荧光参数的意义Fv/Fm 最大光化学效率最大光化学效率PSII=PSII=(FmFs)/Fm PS实际光化学效率实际光化学效率Fv/Fm PS最大天线转化效率最大天线转化效率P=PSII PSII PFD 光化学反应速度光化学反应速度NPQFm/Fm1 非光化学猝灭非光化学猝灭qp=(FmF)/(FmF0)光化学猝灭系数光化学猝灭系数qN=(FmF0)/(FmF

47、0)非光化学猝灭系数非光化学猝灭系数D=1Fv/Fm 吸收光能通过热耗散消耗的部分吸收光能通过热耗散消耗的部分Fo:固定荧光,初始荧光固定荧光,初始荧光(minimal fluorescence)。也称基础荧。也称基础荧光,光,0水平荧光,是光系统水平荧光,是光系统II(PSII)反应中心处于完全开放反应中心处于完全开放时的荧光产量,它与叶片叶绿素浓度有关。时的荧光产量,它与叶片叶绿素浓度有关。Fm:最大荧光产量:最大荧光产量(maximal fluorescence),是,是PSII反应中心处反应中心处于完全关闭时的荧光产量。可反映通过于完全关闭时的荧光产量。可反映通过PSII的电子传递情的

48、电子传递情况。通常叶片经暗适应况。通常叶片经暗适应20min后测得。后测得。F:任意时间实际荧光产量任意时间实际荧光产量(actual flourescence at any time)Fs:稳态荧光产量稳态荧光产量(fluorescence in stable state)。Fm/Fo:用来反应用来反应PSII的电子传递情况。的电子传递情况。FvFm-Fo:为可变荧光为可变荧光(variable fluorescence),反映了反映了QA的还原情的还原情况。况。Fv/Fm:PSII最大光化学量子产量最大光化学量子产量(optimal/maximal photochemical effici

49、ency of PSII in the dark)或或(optimal/maximal quantum yield of PSII),反映,反映PSII反应中心内禀光能转换效率反应中心内禀光能转换效率(intrinsic PSII efficiency)或称最大或称最大PSII的光能转换效率的光能转换效率(optimal/maximal PSII efficiency),叶暗适应,叶暗适应20min后测得。后测得。非胁迫条件下该参数的变化极小,不受物种和生长条件的影非胁迫条件下该参数的变化极小,不受物种和生长条件的影响,胁迫条件下该参数明显下降。响,胁迫条件下该参数明显下降。Pv/Fm:PSI

50、I有效光化学量子产量有效光化学量子产量(photochemical efficiency of PSII in the dark),它反映开放的,它反映开放的PSII反应中心原初光能反应中心原初光能捕获效率,叶片不经过暗适应在光下直接测得。捕获效率,叶片不经过暗适应在光下直接测得。(FmF)/Fm或或F/Fm:PSII实际光化学量子产量实际光化学量子产量(actual photochemical efficiency of PSII in the light),它反映,它反映PSII反应中心在有部分关闭情况下的实际原初光能捕获反应中心在有部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率,叶片不经过暗适应在

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