文献讲读何孟.pptx

A prototype tissue engineered blood A prototype tissue engineered blood vessel using amniotic membrane as vessel using amniotic membrane as scaffoldscaffold何何 孟孟 2012年年12月月6号号 1研究简介2实验材料和方法实验结果讨论与结论34目目 录录基于薄片的基于薄片的TEBV天然支架TEBV1986年开始使用利用活体血管细胞和天然基质分子已有多例报道存在力学性能问题包含活的纤维母细胞和组织良好的基质天然蛋白收获和种植细胞花费时间，限制应用1.1方法比较方法比较一 .研究简介1.2 选材及原因选材及原因AM（羊膜）（羊膜）单层上皮细胞单层上皮细胞无血管基质无血管基质基底膜基底膜和型胶原纤连蛋白层纤连蛋白1,5去表皮化的去表皮化的AM无无免疫源性，且它在免疫源性，且它在眼部手术，表面移眼部手术，表面移植的通畅性，已经植的通畅性，已经在临床上得到验证在临床上得到验证对于促进上皮细胞对于促进上皮细胞粘连有重要作用粘连有重要作用以以AM为基质的培为基质的培养的养的EC相应的表达相应的表达更多的血管内钙连更多的血管内钙连蛋白和整合素蛋白和整合素种植在种植在AM上的内皮细上的内皮细胞（胞（EC）的选择素）的选择素E和和选择素选择素P的表达降低的表达降低（相对于在培养皿培养）（相对于在培养皿培养），相应的其对于白血球，相应的其对于白血球的黏附也相应减少的黏附也相应减少AM（羊膜）（羊膜）证明戊二醛交联的证明戊二醛交联的AM.可以缩短可以缩短TEBV的合成时间的合成时间 并能解决内皮细胞对于并能解决内皮细胞对于TEBV的黏附问题的黏附问题将将AM做成管状做成管状用戊二醛交联用戊二醛交联用猪血管内皮用猪血管内皮对材料进行内皮化对材料进行内皮化在一定时间和生物条件下在一定时间和生物条件下通过不同剪切力处理通过不同剪切力处理对细胞黏附进行表征对细胞黏附进行表征 戊二醛交联戊二醛交联戊二醛交联戊二醛交联 内皮化内皮化内皮化内皮化剪切力剪切力剪切力剪切力影响影响影响影响1.3 实验思路实验思路二 .方法和材料2.胰蛋白酶消化，刮去胰蛋白酶消化，刮去EC1.PBS无菌洗涤无菌洗涤4.绕在聚四氟乙烯棒上绕在聚四氟乙烯棒上3.无菌水冲洗，切块无菌水冲洗，切块6.甘氨酸中和甘氨酸中和5.戊二醛交联戊二醛交联8.4无菌保存无菌保存7.双蒸水冲洗双蒸水冲洗交联交联AM管管AM棒棒去上皮的去上皮的AM人的人的AMAM的获取的获取2.1 AM的准备的准备 和支架制备和支架制备2.2 细胞培养细胞培养猪动脉上皮细胞的提取（步骤同前）猪动脉上皮细胞的提取（步骤同前）甘氨酸处理后，低速离心获得细胞甘氨酸处理后，低速离心获得细胞 M199重悬后传代培养（重悬后传代培养（1:3传代）传代）取取P2，P3代细胞进行实验代细胞进行实验 41232.3 TEBV的剪切力测试的剪切力测试1交联的AM管内壁种植EC密度：2105cm-22培养两天，TEBV上形成单层细胞，然后放入进行生物反应器测试（测试时间均为四天）TEBVTEBV流速控制流速控制流速控制流速控制培养液培养液培养液培养液存储器存储器存储器存储器微型搏动泵微型搏动泵微型搏动泵微型搏动泵生物反应器构成生物反应器构成剪切力计算公式剪切力计算公式：剪切力（达因每平方厘米）1 达因=10-5牛：培养液粘稠度 d:TEBV的内壁直径 Q:流速（立方厘米每秒）通过流速控制剪切力大小测试及检验方法测试及检验方法实验组实验组通过控制流速使剪切力在通过控制流速使剪切力在0.5-12达因的达因的范围范围培养培养2-4天，进行免疫学和组织学检测天，进行免疫学和组织学检测对照组对照组在静止状态下，采用相同条件进行培养在静止状态下，采用相同条件进行培养培养时间相同，进行相同检测培养时间相同，进行相同检测检验检验AM管内细胞通过核染色进行计数管内细胞通过核染色进行计数随机抽取三个区域进行荧光显微计数并随机抽取三个区域进行荧光显微计数并拍照拍照2.4 免疫荧光染色免疫荧光染色肌动蛋白 用 Alexa Fluor-phalloidin 染色PECAM-1(血小板内皮细胞黏附因子-1)，用小鼠抗大鼠CD31抗体结合，再用与 与荧光蛋白结合的山羊抗小鼠IgG蛋白染色VE-钙粘蛋白：用大鼠抗猪的CD144抗体结合，再用 德州红共轭的山羊 抗小鼠IgG蛋白染色整合素1：小鼠抗猪整合素1的抗体结合，再用荧光蛋白结合的山羊 抗小鼠蛋白染色 细胞核：碘化丙啶染色共聚焦显微镜和荧光显微镜观察2.5 蛋白印迹分析蛋白印迹分析EC细胞蛋白的SDS-PAGE电泳转移到PVDF膜脱脂牛奶封闭小鼠抗大鼠PECAM-1抗体标记 PECAM-1小鼠抗猪VE-钙粘蛋白标记 VE-钙粘蛋白HRP（辣根过氧化物酶）结合的IgG二抗标记显色分析2.6 统计学分析统计学分析t分布检验选取显著值P0.05标准误的方法表示结果（SEM）三 .实验结果3.1 剪切力的影响剪切力的影响内皮化内皮化剪切力剪切力处理处理观察观察结果结果取制备好的取制备好的AM管管用猪的内皮用猪的内皮细胞进行内细胞进行内皮化皮化培养两天培养两天实验组用在实验组用在有剪切力的有剪切力的情况下培养情况下培养四天四天对照组培养对照组培养相同时间相同时间进行核染色计进行核染色计数数随机抽样计数随机抽样计数经显微观察经显微观察细胞数目细胞数目无明显变化无明显变化3.2 免疫荧光研究免疫荧光研究肌动蛋白和细胞核染色肌动蛋白和细胞核染色肌动蛋白：绿色肌动蛋白：绿色细胞核：红色细胞核：红色显显示示出出了了细细胞胞的的方方向向性性3.2 免疫荧光研究免疫荧光研究PECAM-1和和VE-钙粘蛋白的分布和表达分析钙粘蛋白的分布和表达分析PECAM-1：蓝色：蓝色VE-钙粘蛋白钙粘蛋白：绿色：绿色PECAM-1和和VE-钙钙粘蛋白的分布性差粘蛋白的分布性差异异3.2 免疫荧光研究免疫荧光研究整合素整合素1的分布和表达分析的分布和表达分析整合素整合素1：蓝色：蓝色细胞核细胞核：红色：红色A-F显示：静止显示：静止培养时只在培养时只在AM与与EC作用面表作用面表达，剪切力影达，剪切力影响下，出现其响下，出现其在细胞间的表在细胞间的表达量达量3.3 蛋白印迹研究蛋白印迹研究分别增长分别增长729%677%3.3 蛋白印迹研究蛋白印迹研究增长增长259%激活的整激活的整合素却有合素却有降低降低整合素整合素v3的分布和表达分析的分布和表达分析整合素整合素v3：蓝色：蓝色细胞核细胞核：红色：红色A-F显示：剪切显示：剪切力对其分布无力对其分布无影响影响整合素整合素v3的表达分析的表达分析分别增加分别增加298%和和 5313%其中其中 P0.05AM作为作为TEBV合成材料的优势合成材料的优势AM最大承受腔内最大承受腔内压力压力300mmHg材料合成周期短材料合成周期短AM与细胞的黏附与细胞的黏附性良好，促进黏性良好，促进黏附因子表达附因子表达基质凝胶蛋白存基质凝胶蛋白存在力学性能缺陷在力学性能缺陷基于薄片的组织基于薄片的组织工程相对耗时工程相对耗时四 .结果与讨论PGA黏附的黏附的EC会会被血流冲刷脱落被血流冲刷脱落人工聚合物和天人工聚合物和天然基质在移植时然基质在移植时经常出现内皮细经常出现内皮细胞脱落问题胞脱落问题生物相容性已得生物相容性已得到临床验证到临床验证关于测得关于测得-肌动蛋白含量减少的解释肌动蛋白含量减少的解释但是其他黏附因子的相对含量仍但是其他黏附因子的相对含量仍有升高有升高-肌动蛋白含量显示较少肌动蛋白含量显示较少剪切力处理提高了剪切力处理提高了PECAM-1和和VE-钙粘蛋白的表达量钙粘蛋白的表达量剪切力处理剪切力处理剪切力处理后，剪切力处理后，EC比较难从比较难从AM上用解上用解离下来，需要更长离下来，需要更长的解离时间。同时的解离时间。同时解离出来的细胞可解离出来的细胞可能含有能含有AM的成分的成分并可能稀释了并可能稀释了-肌肌动蛋白动蛋白种有种有EC的的TEBV在剪切力作用下形在剪切力作用下形成了仿天然血管的细胞连接网络成了仿天然血管的细胞连接网络.EC的方向性利于连接蛋白的表达，的方向性利于连接蛋白的表达，并促进并促进EC的生长和成熟的生长和成熟可以提前制备并储存，减少制备移可以提前制备并储存，减少制备移植体所花的时间植体所花的时间已在眼科诊所中广泛使用，生物相已在眼科诊所中广泛使用，生物相容性问题已得到验证容性问题已得到验证AMnTEBV移植后的平滑肌细胞的迁移和重塑成型过程 因为移植平滑肌细胞可以增加TEBV的机械性质 但是自体平滑肌移植需要相当多的时间 又有人通过动物实验证明，在植入物植入后，附近的平滑肌细胞会迁移到移植物内后续研究后续研究选文原因n剪切力方法的设计是一个新思路n选取了几种有代表性的细胞表面因子进行考察，方法全面，实验设计严谨，效果明显n不足：没有对讨论中涉及的其他材料进行平行实验进行对照，没有解释为什么激活的整合素在剪切力处理后降低