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Chapter 5 Enzymes()主讲：谢云飞主讲：谢云飞Department of Life Sciences and Technologyxie_xie_ 38319281上两次课的内容上两次课的内容 第一节第一节 酶是生物催化剂酶是生物催化剂第二节第二节 酶的结构与功能酶的结构与功能第三节第三节 酶的作用机制酶的作用机制第四节第四节 酶促反应动力学酶促反应动力学本次课的内容本次课的内容第五节第五节 酶的分离、提纯和活性测定酶的分离、提纯和活性测定第六节第六节 重要的酶类重要的酶类第七节第七节 酶在医学上的应用酶在医学上的应用第第五五章章 酶酶2第五节第五节 酶的分离、提纯和活性测定酶的分离、提纯和活性测定Section 5 the separation,purification and measuration of activity of enzyme3一、一、酶的分离提纯酶的分离提纯 目的：目的：研究酶的理化性质。研究酶的理化性质。包括结构与功能、生物学作用。包括结构与功能、生物学作用。作为生化试剂及用作药物的酶要求纯度高作为生化试剂及用作药物的酶要求纯度高4根据酶在体内作用部位根据酶在体内作用部位胞外酶胞外酶-易分离易分离胞内酶胞内酶-须破碎须破碎cellcell分离提纯的原则分离提纯的原则选择酶含量丰富的材料选择酶含量丰富的材料目前多采用微生物发酵的方法来获取大量的酶制目前多采用微生物发酵的方法来获取大量的酶制剂剂避免蛋白质变性：避免强酸、强碱，低温避免蛋白质变性：避免强酸、强碱，低温每一步骤，都要测定酶的总活力和比活力每一步骤，都要测定酶的总活力和比活力5a.a.选材选材动物、植物、微生物：含酶量高，易分离的酶动物、植物、微生物：含酶量高，易分离的酶分离提纯的步骤分离提纯的步骤选材选材-破碎细胞破碎细胞-抽提抽提-纯化纯化-保存保存6b b破碎细胞破碎细胞 动物动物 细菌细菌 植物植物 研磨研磨 超声波超声波 纤维素酶纤维素酶匀浆匀浆 溶菌酶溶菌酶 捣碎机捣碎机 化学溶剂化学溶剂 (甲苯甲苯)提取液提取液c c抽提抽提抽提条件的选取应根据酶的溶解度和稳定性等。抽提条件的选取应根据酶的溶解度和稳定性等。（用稀盐、稀酸、稀碱溶液抽提）用稀盐、稀酸、稀碱溶液抽提）盐：盐：一般用等渗盐溶液，如一般用等渗盐溶液，如0.05mol/L 0.05mol/L 的的PBS，0.15mol/L的的NaCl等；等；T T：一般在一般在0 044；pHpH在其稳定范围内且远离其等电点。在其稳定范围内且远离其等电点。7 操作要求：操作要求：A.A.尽量减少酶活性的损失尽量减少酶活性的损失 B.B.低温低温 0 0 5 5 摄氏度摄氏度 有机溶剂：有机溶剂：-15-15 -20-20摄氏度摄氏度 C.C.抽提液加入抽提液加入EDTAEDTA（络合金属）（络合金属）D.D.抽提液加入巯基乙醇（防止抽提液加入巯基乙醇（防止-SH-SH氧化失活）氧化失活）E.E.不能过度搅拌，以免产生大量泡沫，使酶不能过度搅拌，以免产生大量泡沫，使酶 变性变性 F.F.测定酶的比活力测定酶的比活力 8d.纯化纯化 小分子能自然去除小分子能自然去除,大分子中核酸用鱼精蛋白或大分子中核酸用鱼精蛋白或MnCl2沉淀去除沉淀去除,粘多糖用醋酸铅去除。粘多糖用醋酸铅去除。而主要工作则是去除杂蛋白。而主要工作则是去除杂蛋白。纯化方法与蛋白质基本相同纯化方法与蛋白质基本相同,此外常用选择性变此外常用选择性变性法如选择性热变性法性法如选择性热变性法(某些酶耐热某些酶耐热).9纯化方法纯化方法选择性变性法选择性变性法盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀方法等电点沉淀方法吸附分离方法吸附分离方法几种方法配合使用几种方法配合使用10 提纯的目的提纯的目的:含量含量+纯度纯度工艺的选择应权衡含量与纯度工艺的选择应权衡含量与纯度,根据酶的应用目的和根据酶的应用目的和经济效益取得一个平衡点经济效益取得一个平衡点.每一步都要测定酶的纯度每一步都要测定酶的纯度(比活力比活力)并计算纯化倍数并计算纯化倍数和产率以决定该步骤的效益和取舍和产率以决定该步骤的效益和取舍.酶的比活力酶的比活力(纯度纯度)=)=活力单位数活力单位数/毫克蛋白毫克蛋白纯化倍数纯化倍数=每次比活力每次比活力/第一次比活力第一次比活力产率产率=(=(每次总活力每次总活力/第一次总活力第一次总活力)100%100%11e e保存保存 将酶制品浓缩，结晶，以便保存（将酶制品浓缩，结晶，以便保存（-20-20）注意：注意：酶易失活，不可烘干。酶易失活，不可烘干。可用的方法：可用的方法：（1 1）保存浓缩的酶液：保存浓缩的酶液：（2 2）浓缩液加入等体积甘油浓缩液加入等体积甘油 -20-20长期保存长期保存12二、酶的活力测定二、酶的活力测定(定量定量)酶的活力酶的活力:又称为酶活性，一般把酶催化一又称为酶活性，一般把酶催化一定化学反应的能力称为酶活力，酶的活力大小可定化学反应的能力称为酶活力，酶的活力大小可用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示来表示,即可用单位时间内、单位体积中底物的即可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的生成量来表示减少量或产物的生成量来表示.一般采用高底物浓度一般采用高底物浓度S100Km(S100Km(零级反应零级反应)测定初速度来定量酶浓度测定初速度来定量酶浓度.13 酶活力单位酶活力单位:最适条件下最适条件下,单位时间内单位时间内,酶催化酶催化底物的减少量或产物的生成量底物的减少量或产物的生成量.1 1个个U U（1U1U）:特定条件下特定条件下,1,1分钟内生成分钟内生成1 1微摩尔微摩尔产物的酶量产物的酶量(或转化或转化1 1微摩尔底物的酶量微摩尔底物的酶量).).Kat Kat:最适条件下最适条件下,每秒钟可使每秒钟可使1 1摩尔底物转化的摩尔底物转化的酶量酶量.即即1Kat=61Kat=610107 7IUIU 习惯单位表示酶活力习惯单位表示酶活力14酶的转换数（酶的转换数（turnover numberturnover number）单位时间，每个催化中心所转换的底物分单位时间，每个催化中心所转换的底物分子数。通常指每秒钟每个酶分子转换底物子数。通常指每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数，在数值上，的微摩尔数，在数值上，KcatKcatK K3 315第六节第六节 重要的酶类重要的酶类一、寡聚酶一、寡聚酶(oligomeric enzyme)(oligomeric enzyme)含有含有2 2个以上的亚基，分子量大（个以上的亚基，分子量大（3500035000以上）。以上）。可分为含相同亚基的寡聚酶和含不同亚基的寡聚可分为含相同亚基的寡聚酶和含不同亚基的寡聚酶。酶。寡聚酶普遍存在，单体酶的数量则较少。寡聚酶普遍存在，单体酶的数量则较少。（含不同亚基的）寡聚酶的不同亚基执行不同的（含不同亚基的）寡聚酶的不同亚基执行不同的功能。催化功能和底物载体的功能。功能。催化功能和底物载体的功能。寡聚酶是代谢调节的方式之一。寡聚酶是代谢调节的方式之一。16二、同工酶二、同工酶(isoenzyme)(isoenzyme)概概念念：存存在在于于同同一一种种属属或或不不同同种种属属，同同一一个个体体的的不不同同组组织织或或同同一一组组织织、同同一一细细胞胞（位位置置），具具有有不不同同分分子子形形式式（结结构构）、理理化化性性质质和和免免疫疫学学性性质质，但但却却能能催催化化相相同同的的化化学学反反应应（功功 能能）的的 一一 组组 酶酶，称称 之之 为为 同同 工工 酶酶（isoenzymeisoenzyme）。乳乳酸酸脱脱氢氢酶酶是是研研究究的的最最多多的的同工酶。同工酶。17乳酸脱氢酶同工酶形成示意图乳酸脱氢酶同工酶形成示意图多肽多肽亚基亚基mRNA四聚体四聚体结构基因结构基因a b乳酸脱氢酶同乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱工酶电泳图谱+H4MH3M2H2M3HM4点样线点样线18不同组织中不同组织中LDHLDH同工酶的电泳图谱同工酶的电泳图谱LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌心肌 肾肾 肝肝 骨骼肌骨骼肌 血清血清-+原点原点19同工酶在各学科中的应用同工酶在各学科中的应用医学和临床诊断医学和临床诊断：体内同工酶的变化，可看作：体内同工酶的变化，可看作机体组织损伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的机体组织损伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。分子标志。适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要20 心肌梗死和肝病病人血清心肌梗死和肝病病人血清LDHLDH同工酶谱的变化同工酶谱的变化1 1酶酶活活性性心肌梗死酶谱心肌梗死酶谱正常酶谱正常酶谱肝病酶谱肝病酶谱2 23 34 45 521 关于同工酶的叙述，哪一个是正确的关于同工酶的叙述，哪一个是正确的A.A.是能催化同一反应，但分子组成，理化性质以是能催化同一反应，但分子组成，理化性质以及免疫学特征都不相同的一组酶及免疫学特征都不相同的一组酶B.B.由同一基因编码，生成相同的由同一基因编码，生成相同的mRNAmRNA，然后把翻，然后把翻译的蛋白质经加工而形成的不同分子形式的酶译的蛋白质经加工而形成的不同分子形式的酶C.C.催化同一反应，理化性质相同，只是分布不同催化同一反应，理化性质相同，只是分布不同的酶的酶D.D.催化同一反应，分子组成不同，理化性质相同，催化同一反应，分子组成不同，理化性质相同，免疫学特征不相同的一组酶免疫学特征不相同的一组酶E.E.催化同一反应，分子组成和理化性质不同，但催化同一反应，分子组成和理化性质不同，但免疫学特征相同的一组酶免疫学特征相同的一组酶22三、诱导酶（三、诱导酶（induced enzymeinduced enzyme）含量在诱导物存在下显著增高。含量在诱导物存在下显著增高。诱导物是该酶的底物类似物或底物本身。诱导物是该酶的底物类似物或底物本身。半乳糖苷酶（无葡萄糖时利用乳糖）半乳糖苷酶（无葡萄糖时利用乳糖）因为长期服用某种药物而产生抗药性因为长期服用某种药物而产生抗药性23四、调节酶四、调节酶 一般催化代谢反应链中的单向反应或速度最一般催化代谢反应链中的单向反应或速度最慢的步骤慢的步骤,因而可调节、控制反应链的总的方向和因而可调节、控制反应链的总的方向和总速度总速度.调节酶一般位于代谢反应链的开端或分枝点上。调节酶一般位于代谢反应链的开端或分枝点上。24（一）共价调节酶（一）共价调节酶 调节剂通过共价键与酶分子结合调节剂通过共价键与酶分子结合,以增减酶分以增减酶分子上的基团来改变酶的活性子上的基团来改变酶的活性(高高/低低,有有/无无).).常见类型常见类型常见类型常见类型磷酸化与脱磷酸化磷酸化与脱磷酸化（最常见）（最常见）乙酰化和脱乙酰化乙酰化和脱乙酰化乙酰化和脱乙酰化乙酰化和脱乙酰化甲基化和脱甲基化甲基化和脱甲基化甲基化和脱甲基化甲基化和脱甲基化腺苷化和脱腺苷化腺苷化和脱腺苷化腺苷化和脱腺苷化腺苷化和脱腺苷化SHSHSHSH与与与与S S S SS S S S互变互变互变互变25 酶的磷酸化与脱磷酸化酶的磷酸化与脱磷酸化 -OHThrSerTyr酶蛋白酶蛋白H2OPi磷蛋白磷酸酶磷蛋白磷酸酶 ATPADP蛋白激酶蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-酶蛋白酶蛋白26（二）变构酶（二）变构酶(别构酶别构酶,属寡聚酶属寡聚酶)（结构）除活性中心外（结构）除活性中心外,还有别构中心还有别构中心(结合结合调节物或称效应剂调节物或称效应剂)别构效应别构效应:调节物与别构中心结合引起酶蛋白调节物与别构中心结合引起酶蛋白构象变化构象变化,使酶活性中心对底物的结合和催化作用使酶活性中心对底物的结合和催化作用受影响受影响(改变酶活性改变酶活性),),从而改变酶促反应速度从而改变酶促反应速度.别构激活别构激活/别构抑制别构抑制 别构效应剂别构效应剂:别构激活剂别构激活剂:通常为底物或底物类似物通常为底物或底物类似物 别构抑制剂别构抑制剂:通常为产物通常为产物27同种效应：一分子的配体结合在蛋白质一同种效应：一分子的配体结合在蛋白质一个部位影响另一分子同样配体在另一部位个部位影响另一分子同样配体在另一部位的结合。的结合。异种效应是一分子的配体在一个部位的结异种效应是一分子的配体在一个部位的结合会影响另一分子的不同配体在另一部位合会影响另一分子的不同配体在另一部位的结合。的结合。28*协同效应协同效应(cooperativity)(cooperativity)一个寡聚蛋白质的一个亚基与其配体结合后，一个寡聚蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为现象，称为协同效应协同效应。如果是促进作用则称为如果是促进作用则称为正协同效应正协同效应 (positive(positive cooperativity)cooperativity)如果是抑制作用则称为如果是抑制作用则称为负协同效应负协同效应 (negative(negative cooperativity)cooperativity)29变构酶的初速度变构酶的初速度底物浓度的关系不符合典型底物浓度的关系不符合典型的米氏公式。的米氏公式。对于变构酶来说，酶反应速度对底物浓度的变对于变构酶来说，酶反应速度对底物浓度的变化极为敏感。当底物浓度发生较小变化时，变化极为敏感。当底物浓度发生较小变化时，变构酶可以极大程度地控制着反应速度。变构酶构酶可以极大程度地控制着反应速度。变构酶可以灵敏地调节酶反应速度。可以灵敏地调节酶反应速度。30（一）血清酶测定应用于肝胆疾病的诊断（一）血清酶测定应用于肝胆疾病的诊断转氨酶转氨酶 血清谷草转氨酶血清谷草转氨酶(SGOT)(SGOT)卵磷脂卵磷脂-胆固醇转酰基酶胆固醇转酰基酶(LCAT)(LCAT)-谷氨酰转肽酶谷氨酰转肽酶 (-GT(-GT)（二）血清酶测定应用于急性心肌梗死的诊断（二）血清酶测定应用于急性心肌梗死的诊断肌酸激酶肌酸激酶(CK-MB(CK-MB高高6 6倍倍)乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 LDH-H1/H2LDH-H1/H2高高（三）血清酶测定应用于诊断肿瘤（三）血清酶测定应用于诊断肿瘤 -GT Gal-T-GT Gal-T第七节第七节 酶在医药学上的应用酶在医药学上的应用一、酶在疾病诊断上的应用一、酶在疾病诊断上的应用311.1.助消化酶助消化酶2.2.消炎酶消炎酶3.3.防治冠心病用酶防治冠心病用酶 4.4.止血酶和抗血栓酶止血酶和抗血栓酶5.5.抗肿瘤酶类抗肿瘤酶类6.6.其他酶类药物其他酶类药物二、酶在治疗上的应用二、酶在治疗上的应用32固固定定化化酶酶：借借助助于于理理化化方方法法把把酶酶束束缚缚在在一一定定空空间间内内并并仍具有催化活性的酶制剂。仍具有催化活性的酶制剂。固固定定化化酶酶的的优优点点：稳稳定定性性提提高高，可可反反复复使使用用，有有一一定定机械强度可连续化自动化，极易和产物分离等。机械强度可连续化自动化，极易和产物分离等。固定化酶的制备方法固定化酶的制备方法：吸附、共价结合、交联、包埋吸附、共价结合、交联、包埋固定化酶在医药上的应用固定化酶在医药上的应用：生生产产、分分离离（亲亲和和层层析析）、医医疗疗：如如人人工工肾肾（微微胶胶囊囊的脲酶和微胶囊的离子交换树脂）的脲酶和微胶囊的离子交换树脂）三、固定化酶及其在医药上的应用三、固定化酶及其在医药上的应用3334