核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析.pptx

提取核酸的目的提取核酸的目的:1.实验研究实验研究2.用于研制核酸类药物及保健品用于研制核酸类药物及保健品?核酸分离与纯化的设计与原则核酸分离与纯化的设计与原则主要核酸类药物及用途主要核酸类药物及用途 名名 称称治治 疗疗 范范 围围核糖核酸（核糖核酸（RNA）口服用于精神迟缓、记忆衰退、动脉硬化性痴呆口服用于精神迟缓、记忆衰退、动脉硬化性痴呆治疗；静脉注射用于刺激造血和促进白细胞生成，治疗；静脉注射用于刺激造血和促进白细胞生成，治疗慢性肝炎、肝硬化初期癌症治疗慢性肝炎、肝硬化初期癌症脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNA）有抗放射作用，能改善机体虚弱疲劳；与细胞毒有抗放射作用，能改善机体虚弱疲劳；与细胞毒药物合用，能提高细胞毒药物对癌细胞的选择性药物合用，能提高细胞毒药物对癌细胞的选择性作用；与红霉素合用，能降低其毒性，提高抗癌作用；与红霉素合用，能降低其毒性，提高抗癌疗效疗效免疫核糖核酸（免疫核糖核酸（iRNA）推动正常推动正常RNA分子在基因水平上通过对癌细胞分子在基因水平上通过对癌细胞DNA分子进行诱导，或通过反转录酶系统促使癌分子进行诱导，或通过反转录酶系统促使癌细胞发生逆分化，如：可用于肝炎治疗的抗乙肝细胞发生逆分化，如：可用于肝炎治疗的抗乙肝iRNA，治疗肺癌的抗肺癌，治疗肺癌的抗肺癌iRNA转移因子（转移因子（TF）相对分子质量较小，含有多核苷酸、多肽化合物，相对分子质量较小，含有多核苷酸、多肽化合物，Mr10000；它只传递细胞免疫信息，无体液免；它只传递细胞免疫信息，无体液免疫作用，不致促进肿瘤生长，治疗恶性肿瘤比较疫作用，不致促进肿瘤生长，治疗恶性肿瘤比较安全；亦可用于治疗肝炎等安全；亦可用于治疗肝炎等主要核酸类药物及用途主要核酸类药物及用途名名称称治治疗疗范范围围聚肌胞苷酸（聚肌胞）聚肌胞苷酸（聚肌胞）干扰素诱导物，具有广普抗病毒作用；用化学合干扰素诱导物，具有广普抗病毒作用；用化学合成、酶促合成方法生产成、酶促合成方法生产腺苷三磷酸（腺苷三磷酸（ATP）用于心力衰竭、心肌炎、心肌梗死、脑动脉和冠用于心力衰竭、心肌炎、心肌梗死、脑动脉和冠状动脉硬化、急性脊髓灰质炎、肌肉萎缩、慢性状动脉硬化、急性脊髓灰质炎、肌肉萎缩、慢性肝炎等肝炎等核酸核酸-氨基酸混合物氨基酸混合物用于气管炎、神经衰弱等用于气管炎、神经衰弱等辅酶辅酶A（CoA）用于动脉硬化，白细胞、血小板减少，肝、肾病用于动脉硬化，白细胞、血小板减少，肝、肾病脱氧核苷酸钠脱氧核苷酸钠用于放疗、化疗引起的急性白细胞减少症用于放疗、化疗引起的急性白细胞减少症腺苷一磷酸（腺苷一磷酸（AMP）有周围血管扩张作用、减压作用；用于静脉曲张有周围血管扩张作用、减压作用；用于静脉曲张性溃疡等性溃疡等鸟苷三磷酸（鸟苷三磷酸（GTP）用于慢性肝炎、进行性肌肉萎缩等症用于慢性肝炎、进行性肌肉萎缩等症辅酶辅酶（NDA）用于白细胞减少及冠状动脉硬化用于白细胞减少及冠状动脉硬化辅酶辅酶（NADP）促进体内物质的生物氧化促进体内物质的生物氧化lDNA：主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量量DNA，如线粒体，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体），叶绿体DNA（cpDNA），质粒），质粒DNA。lRNA：主要存在于细胞质中，如主要存在于细胞质中，如mRNA，rRNA，tRNA，miRNA等。等。l除上述除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含噬菌体，其或只含DNA，或只含有，或只含有RNA。细胞内的核酸具有复杂的结构，均与蛋白质结合成细胞内的核酸具有复杂的结构，均与蛋白质结合成核蛋核蛋白白。分子的分子的总长度在不同生物间差异很大总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的一般随生物的进化程度而增长。进化程度而增长。DNA与与RNA性质上的差异性质上的差异决定了两者的决定了两者的最适分离与纯最适分离与纯化的条件是不同化的条件是不同的。的。一、一、材料与方法的选择材料与方法的选择 核酸存在于各种生物中。临床常见的样品核酸存在于各种生物中。临床常见的样品有血液、尿液、唾液、头发、组织及培养有血液、尿液、唾液、头发、组织及培养细胞等。细胞等。核酸分离与纯化的方法非常多。如何选择核酸分离与纯化的方法非常多。如何选择合适的分离与纯化方法是一个首要的问题。合适的分离与纯化方法是一个首要的问题。因为因为不同的研究目的不同的研究目的对核酸的完整性、产对核酸的完整性、产量、纯度和浓度量、纯度和浓度有不同的要求。有不同的要求。近年来，近年来，试剂盒试剂盒(Kit)的开发与自动化仪器的开发与自动化仪器的使用大大提高了分离与纯化的效率。的使用大大提高了分离与纯化的效率。根据具体生物材料的性质与起始根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的量、待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。性质与用途而采取不同的方案。无论采取何种方法，都应遵循总的原则：无论采取何种方法，都应遵循总的原则：q 保证核酸一级结构的完整性，保证核酸一级结构的完整性，q 尽量排除其它分子的污染，尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。保证核酸样品的纯度。选择原则选择原则 核酸制备时应注意的事项核酸制备时应注意的事项:尽量简化操作步骤，缩短提取过程。尽量简化操作步骤，缩短提取过程。减少化学因素对核酸的降解减少化学因素对核酸的降解(pH4-10)减少物理因素对核酸的降解减少物理因素对核酸的降解,如机械剪如机械剪切力和高温切力和高温 防止核酸的生物降解。防止核酸的生物降解。核酸制备的步骤：破碎细胞破碎细胞破碎细胞破碎细胞提取提取提取提取纯化纯化纯化纯化二二 技术路线的设计技术路线的设计 破碎细胞破碎细胞微生物：溶菌酶、微生物：溶菌酶、SDS裂解。裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。动物：液氮处理后用匀浆器破碎。动物：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器细胞器DNA，首先纯化细胞器。，首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂 (一一)核酸的释放核酸的释放 正常情况下，无论是正常情况下，无论是DNA还是还是RNA均位均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就第一步就是破碎细胞是破碎细胞、释放核酸释放核酸。DNA酶抑制剂：酶抑制剂：1.金属离子螯合剂：金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。酶活性。如：如：EDTA2.阴离子表面活性剂：阴离子表面活性剂：如如SDS。该试剂除对核酸酶有抑制作。该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。RNA酶抑制剂：酶抑制剂：1.皂土：皂土：带负电荷，能吸附带负电荷，能吸附RNase，使其失活。，使其失活。2.DEPC(焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯)：通过和通过和RNA酶的活性基团组氨酸酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。(二二)核酸的分离与纯化核酸的分离与纯化 利用核酸与其它物质在一个或多个性质利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异设计有效方案，才能使核酸得以分上的差异设计有效方案，才能使核酸得以分离。核酸与其它物质的差异包括离。核酸与其它物质的差异包括细胞定位与细胞定位与组织分布上的差异、物理化学性质上的不同组织分布上的差异、物理化学性质上的不同以及以及各自独特的生物学特性各自独特的生物学特性。1.DNA分离纯化过程分离纯化过程破碎细胞破碎细胞+DNA抽提液抽提液(EDTA、去污剂去污剂、蛋白酶蛋白酶K)65温温育育20冰浴冰浴冷却冷却离心去细胞碎片离心去细胞碎片上清液上清液用用水饱和苯酚水饱和苯酚抽提抽提23次次上层液相用上层液相用氯仿氯仿抽至界面无蛋白变性抽至界面无蛋白变性物物上层液相用两倍体积冷上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀乙醇沉淀沉淀物用沉淀物用70%冷乙醇冷乙醇洗涤洗涤,干燥干燥溶于缓冲液溶于缓冲液加入加入RNase处理除去处理除去RNA苯酚氯仿抽提苯酚氯仿抽提沉淀干燥沉淀干燥lEDTA：破坏细胞膜，螯合破坏细胞膜，螯合Mg2+、Ca2+，使，使DNase失失活；活；lSDS：可破坏细胞膜、抑制核酸酶，还可使核酸从可破坏细胞膜、抑制核酸酶，还可使核酸从蛋白质上游离下来；蛋白质上游离下来；l蛋白酶蛋白酶K：非特异性蛋白酶，可将蛋白质消化成氨非特异性蛋白酶，可将蛋白质消化成氨基酸；基酸；l65：高温下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，高温下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；释放出核酸；l冰浴：冰浴：降低温度使蛋白质及多糖杂质沉淀；降低温度使蛋白质及多糖杂质沉淀；l水饱和苯酚：水饱和苯酚：由于蛋白与由于蛋白与DNA连结键已断裂，蛋白分子表面连结键已断裂，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相。苯酚使蛋白质变性，并抑制了溶于水相。苯酚使蛋白质变性，并抑制了DNase的降解的降解作用。作用。l氯仿：氯仿：氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，还能去除植物色素和蔗糖。水相中的酚，还能去除植物色素和蔗糖。l异戊醇异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相、的水相、中间的变性蛋白相、下层有机溶剂相维持稳定。下层有机溶剂相维持稳定。l无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀DNA：与核酸不发生任何化学反应；对盐类沉与核酸不发生任何化学反应；对盐类沉淀少，沉淀中所含微量乙醇易挥发除去。淀少，沉淀中所含微量乙醇易挥发除去。2.RNA分离纯化分离纯化-Trizol一步法一步法TRIzol是一种新型总是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总中提取总RNA。TRIzol的主要成分是苯酚。的主要成分是苯酚。苯酚苯酚的主要作用的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因酶活性，因此此TRIzol中还加入了中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙巯基乙醇醇等来抑制内源和外源等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。酶）。0.1%的的8羟基喹啉羟基喹啉可以抑制可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增，与氯仿联合使用可增强抑制作用。强抑制作用。异硫氰酸胍异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。蛋白迅速与核酸分离。-巯基乙醇巯基乙醇的主要作用是破坏的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。蛋白质中的二硫键。注意：注意：Trizol是强腐蚀性物质，小心存放于是强腐蚀性物质，小心存放于4l所有的组织中均存在所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中烘箱中200烘烤烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，水溶液处理，再用蒸馏水冲净。再用蒸馏水冲净。lDEPC：焦碳酸二乙酯，是一种强烈但并不彻底的焦碳酸二乙酯，是一种强烈但并不彻底的RNA酶酶抑制剂，通过和抑制剂，通过和RNA酶中酶中His结合使蛋白质变性，抑制结合使蛋白质变性，抑制RNA酶酶活性。活性。利用乙醇的易挥发性洗掉异丙醇利用乙醇的易挥发性洗掉异丙醇,氯仿；氯仿；溶解一些沉淀中可能的有机物杂质溶解一些沉淀中可能的有机物杂质会极大降低会极大降低RNA的可溶性的可溶性 (三三)核酸的浓缩核酸的浓缩 随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度会遂渐下降，当不能满足后继研究与应用的需要时，会遂渐下降，当不能满足后继研究与应用的需要时，应对核酸进行浓缩。应对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法沉淀是核酸浓缩最常用的方法。优点：优点：核酸沉淀后核酸沉淀后,可以很容易地可以很容易地改变溶解缓冲液改变溶解缓冲液和和调调整核酸溶液至所需浓度整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能；另外，核酸沉淀还能去除部去除部分杂质与某些盐离子分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。，有一定的纯化作用。三三 鉴定与保存鉴定与保存(一一)核酸的鉴定核酸的鉴定 分离纯化后的核酸质量如何，是否分离纯化后的核酸质量如何，是否达到后继实验研究与应用的要求，可以达到后继实验研究与应用的要求，可以通过相关的方法来鉴定其通过相关的方法来鉴定其浓度、纯度及浓度、纯度及完整性完整性。1浓度鉴定浓度鉴定(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，其子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，其最大吸收波长在最大吸收波长在250270nm之间。之间。l在波长在波长260nm紫外光下，紫外光下，1OD值得吸光度相当于双值得吸光度相当于双链链DNA浓度为浓度为50g/ml；单链；单链DNA和和RNA为为40g/ml；寡核苷酸为；寡核苷酸为35g/ml。lOD值范围应该在值范围应该在0.10.99之间，否则不符合上述线之间，否则不符合上述线性关系。性关系。(2)荧光光度法荧光光度法核酸的荧光染料核酸的荧光染料溴化乙锭溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出橙红色的荧光，且荧光强度积分与线激发下发出橙红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。该法灵敏度可达核酸含量呈正比。该法灵敏度可达1-5ng，适合低，适合低浓度核酸溶液的定量分析。浓度核酸溶液的定量分析。另外，另外，SYBRGold作为一种新的超灵敏荧光染料，作为一种新的超灵敏荧光染料，可以从琼脂糖凝胶中检出低于可以从琼脂糖凝胶中检出低于20pg的双链的双链DNA。(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法：紫外分光光度法主紫外分光光度法主要通过要通过A260与与A280的比值的比值来判定有无蛋白来判定有无蛋白质的污染。在质的污染。在TE缓冲液中，纯缓冲液中，纯DNA的的A260A280比值为比值为1.8，纯，纯RNA的的A260A280比比值为值为2.0。比值升高与降低均表示不纯。比值升高与降低均表示不纯。2纯度鉴定纯度鉴定(2)荧光光度法荧光光度法：用用溴化乙锭等荧光染料溴化乙锭等荧光染料示踪示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子比分子比RNA大许多，电泳迁移率低。通过分大许多，电泳迁移率低。通过分析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果，析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果，可以鉴定可以鉴定DNA制品中有无制品中有无RNA的干扰，亦可鉴定的干扰，亦可鉴定在在RNA制品中有无制品中有无DNA的污染。的污染。