第四节核酸的分子杂交.pptx

第四节第四节 核酸的分子杂交核酸的分子杂交Nucleic Acid HybridizationNucleic Acid Hybridization核酸分子杂交核酸分子杂交：概念：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，概念：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。按碱基配对原则形成双链的过程。DNADNA变性方法变性方法:热变性：热变性：9010090100酸碱变性：常采用碱变性酸碱变性：常采用碱变性化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等醛等DNADNA复性或杂交复性或杂交(hybridization)(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNADNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等等Content of Table一、一、核酸分子杂交技术的原理核酸分子杂交技术的原理二、二、核酸探针的制备核酸探针的制备三、三、核酸探针的标记核酸探针的标记四、四、核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交技术的原理一、核酸分子杂交技术的原理 有互补特定核苷酸序列的单链有互补特定核苷酸序列的单链DNADNA或或RNARNA混在一混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。如把一段如把一段已知基因（已知基因（DNADNA或或RNARNA）的核酸序列用）的核酸序列用合适的标记物（如放射性同位素、生物素等）予合适的标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，以标记，当作探针（当作探针（probe),probe),与变性后的单链基与变性后的单链基因组因组DNADNA或或RNARNA等进行杂交。等进行杂交。用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列的拷贝数及表达丰度等。列的拷贝数及表达丰度等。应应 用：用：1 1）检测特定生物有机体之间是否存在）检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；亲缘关系；2 2）用来揭示核酸片段中某一特定基因）用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。的存在与否、拷贝数及表达丰度。Home二、核酸探针的制备二、核酸探针的制备探针（探针（Probe):Probe):一段带有检测标记的与目的基一段带有检测标记的与目的基因或目的因或目的DNA特异互补的已知核特异互补的已知核苷酸序列。苷酸序列。探针的制备方法探针的制备方法探针长度一般以探针长度一般以50300bp为宜。为宜。制备方法：制备方法：1）利用）利用DNA重组技术重组技术2）PCR扩增扩增3）化学合成）化学合成探针的分类：探针的分类：据制备方法及核酸性质不同，可分为：据制备方法及核酸性质不同，可分为：1 基因组基因组DNA探针探针2 cDNA探针探针3 RNA探针探针4 寡核苷酸探针寡核苷酸探针合成寡核苷酸探针注意原则：合成寡核苷酸探针注意原则：1 1）长度（）长度（10-50 bp);10-50 bp);2)G:C2)G:C对含量对含量40%-60%40%-60%；3 3）探针内避免互补；）探针内避免互补；4 4）避免同一碱基连续出现；）避免同一碱基连续出现；5 5）与非靶序列有）与非靶序列有70%70%以上同源性或连续以上同源性或连续8 8个以上碱基序列相同，最好不用。个以上碱基序列相同，最好不用。Home三、核酸探针的标记三、核酸探针的标记 为确定探针是否与相应基因组为确定探针是否与相应基因组DNADNA杂杂交，有必要对探针加以标记，以便在交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。结合部位获得可识别的信号。1、标记的种类、标记的种类同位素：同位素：3232P P、3535S S、3 3H H、125125I I等标记探针等标记探针非同位素：非同位素：生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。存时间较长，无同位素污染。一个理想的标记物：1 1）标记前后探针的基本结构、化学性）标记前后探针的基本结构、化学性质相同质相同;2 2）特异性强、本底低、重复性好；）特异性强、本底低、重复性好；3 3）操作简单、节时；）操作简单、节时；4 4）安全、无环境污染。）安全、无环境污染。2、探针的标记方法、探针的标记方法（1 1）缺口平移法）缺口平移法（2 2）随机引物标记法）随机引物标记法（3 3）末端标记法）末端标记法（4 4）生物素光照标记法）生物素光照标记法缺口平移法的原理缺口平移法的原理 将将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的的53的聚合酶活性和的聚合酶活性和5 3的外切酶活性相结合。的外切酶活性相结合。首先用首先用DNAase I 在探针在探针DNA双链上造成缺口，然后再双链上造成缺口，然后再借助于借助于E.coli的的DNA pol I的的53外切酶活性，切去带有外切酶活性，切去带有5-磷酸的核苷酸；同时利用该酶磷酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，使生聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。这两种活性同时作用，缺口不断向这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，方向移动，DNA链链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。探针。随机引物标记法原理随机引物标记法原理 用一些用一些六核苷酸作为随机引物六核苷酸作为随机引物，将这些，将这些引物和探针引物和探针DNADNA片段一起热变性，退火后，片段一起热变性，退火后，引物与单链引物与单链DNADNA互补结合，再互补结合，再在在DNADNA聚合酶的聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其作用下，按碱基互补配对原则不断在其3-3-OHOH端添加标记的单核苷酸修补缺口端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新，合成新的标记的探针片段。的标记的探针片段。末端标记法原理末端标记法原理（1）一种是在）一种是在5末端加成标记法末端加成标记法：先用先用碱性磷酸酶碱性磷酸酶（AP）去掉）去掉dsDNA 5-磷磷酸，再用酸，再用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶催化标记的催化标记的ATP转移加到转移加到DNA片段片段5-OH上。上。（2）在探针）在探针3-末端末端用末端转移酶用末端转移酶掺入一个掺入一个单标记的单标记的ddUTP。生物素光照标记法生物素光照标记法光敏生物素在紫外线照射下与光敏生物素在紫外线照射下与DNADNA或或RNARNA的碱基发生化学加成反应，的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的获得生物素标记的DNADNA探针。探针。Home四、核酸分子杂交技术四、核酸分子杂交技术 此技术由此技术由Southern 1975年首年首先设计。被检测对象为先设计。被检测对象为DNA。（一）（一）Southern 印迹杂交印迹杂交带有带有DNA片段的凝胶片段的凝胶DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳至至膜（尼龙膜或硝酸膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）纤维素滤膜）上上转膜转膜杂交、显影杂交、显影凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液转移用缓冲液转移DNADNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜Southern Southern 印迹杂交的技术流程印迹杂交的技术流程（二）（二）Northern印迹杂交印迹杂交 与与SouthernSouthern杂交类似。杂交类似。检测检测目的目的RNARNA的存在与否及含量。的存在与否及含量。（三）（三）WesternWestern印迹杂交印迹杂交 将待检测蛋白质（或酶）经将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用上固定，再用“抗体抗体-抗原抗原”免疫免疫反应或反应或“DNA-protein”结合反应鉴结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。别滤膜上的蛋白质。（四）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交（四）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交Dot blotting and slot blotting 直接将样品点样于固相支持直接将样品点样于固相支持物上。适合于核酸样品的定性物上。适合于核酸样品的定性检测，而不是定量检测。检测，而不是定量检测。(五）原位杂交五）原位杂交in situ hybridization将标记的核酸探针与将标记的核酸探针与细胞或组织中的细胞或组织中的核酸进行核酸进行杂交，称为原位杂交。杂交，称为原位杂交。特点特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态