重组DNA技术及基因工程药物.pptx

第一节 概述第二节 基因药物生产的过程第三节 目的基因的获得第四节 基因表达第五节 基因工程菌生长代谢的特点第六节 基因工程菌的不稳定性第七节 基因工程菌中试第八节 重组工程菌的培养第九节 高密度发酵第十节 基因工程药物的分离纯化第十一节 变性蛋白的复性第十二节 基因工程药物的质量控制第一节第一节 概述概述生物技术的核心是基因工程，基因工程技术最成功的应用就是用于生物治疗的新型生物药物的研制。1982年人胰岛素在美国的问世，带来了巨大的经济和社会效益。生物技术用于疾病的预防和疑难杂症的治疗已经成为了现实传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物基因工程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的优势应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得基因工程新药的主要蛋白和多肽：基因工程新药的主要蛋白和多肽：免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、激素，如胰岛素、生长素、心纳素酶类，如尿激酶、超氧化物歧化酶细胞因子细胞因子细胞因子的术语首次提出是20世纪70年代中期，这一词曾用于指那些控制分化和调节免疫系统细胞的多肽生长因子，像干扰素（IFN)和白细胞介素（IL）就是主要的细胞因子多肽家族现代概念现代概念：细胞因子是一个调节蛋白或糖蛋白构成的多样性群组，这些分子通常是由机体微量产生，它们在不同的细胞间充当化学通信分子，通过与特异性细胞表面受体结合诱导细胞效应，从而激活各种细胞内信号转导事件构成调节分子中细胞因子组群的主要蛋白构成调节分子中细胞因子组群的主要蛋白/蛋白家族蛋白家族白介素（白介素（IL-1 1IL-15IL-15）红细胞生成素（红细胞生成素（EPO）干扰素（干扰素（IFN-，IFN-，IFN-，IFN-，IFN-成纤维生长因子（成纤维生长因子（FGF）集落刺激因子（集落刺激因子（G-GSF，M-GSF，GM-GSF）白血病控制因子（白血病控制因子（LIF）肿瘤坏死因子（肿瘤坏死因子（TFN-，TFN-）巨噬细胞演性蛋白（巨噬细胞演性蛋白（MIP-1，MIP-1 MIP-2）神经营养因子（神经营养因子（NGF，BDNF，NT-3，NT-4/5）白小板源性生长因子（白小板源性生长因子（PDGF）睫状神经营养因子（睫状神经营养因子（CNTF）转化生长因子（转化生长因子（TGF-，TGF-）神经胶质细胞源性神经营养因子（神经胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）白小板生成素（白小板生成素（TPO）表皮生长因子表皮生长因子(EGF)主要基因工程药物简介主要基因工程药物简介人胰岛素人胰岛素胰岛素：多肽激素的一种，具有多种生物学功能，在维持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和蛋白质的合成、调节与控制细胞内多种代谢途径等方面都有重要作用商品名：甘舒霖商品名：甘舒霖药品名的商品名药品名的商品名即不同厂家生产的同一种药物制剂可以起不同的名称，具有专有性质，不可仿用。商品名经注册即为注册药品，常用®表示。它是市场竞争的结果，药品质量的标志和品牌效应的体现。如左旋氧氟沙星是通用名，而“利复星”、“来立信”等即是它的商品名 人生长激素（人生长激素（hGH)人的垂体腺前叶嗜酸细胞分泌的一种非糖基化多肽激素多肽激素，主要功能：刺激身体生长，最近还发现它对一些细胞的增殖和分化以及DNA的合成有直接效应注射用的人生长激素注射用的人生长激素 商品名商品名：安苏萌安苏萌干扰素（干扰素（IFN)是一类在同种细胞中具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受到细胞基因组的调节和控制，涉及到RNA和蛋白质的合成。干扰素是一种类似于多肽激素的细胞功能调节物质，是一种细胞素 根据抗原特异性和分子结构的不同，干扰素可分为三型商品名：尤靖安商品名：尤靖安白细胞介素（白细胞介素（IL)白细胞介素是由白细胞或其他体细胞产生的，又在白细胞间起调节作用和介导作用的一类细胞因子，是重要的免疫调节剂到目前为止，IL系列已发现的有18种，最主要的是 IL-2、IL-6、IL-11、IL-12、IL-15商品名：欣美格商品名：欣美格集落刺激因子（集落刺激因子（CSF)CSF是一种能参与造血调节过程的糖蛋白分子，故又称为造血刺激因子或造血生长因子现在已知的CSF主要有四种 粒细胞集落刺激因子（G-CSF)巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)多功能集落刺激因子（Multi-CSF)注射用注射用GMCSF 商品名：商品名：吉姆欣吉姆欣红细胞生成素（红细胞生成素（EPO)主要由成年人的肾脏分泌产生，是一种调节和维持调节和维持血液循环中红细胞生理水血液循环中红细胞生理水平平的重要激素，也是合成红细胞的主要刺激因子 主要用于：治疗多种疾病引起的贫血症商品名：宁红欣商品名：宁红欣肿瘤坏死因子（肿瘤坏死因子（TNF)肿瘤坏死因子这一名称是在最初 发现时，观察到它的抗肿瘤活性 而命名的TNF除了抗肿瘤活性外，对多种 正常细胞还具有广泛的免疫生物 学活性，如：炎症活性，免疫调节作用，抗病毒、细菌、真菌等目前主要有三种 激活巨噬细胞产生的TNF-激活淋巴细胞产生的TNF-由NK细胞产生的细胞毒因子TNF-组织型纤溶酶原激活剂组织型纤溶酶原激活剂（t-PA)一种丝氨酸蛋白酶，能激活纤溶酶原生成纤溶酶，纤溶酶水解血凝块中的纤维蛋白网、导致血栓溶解用于治疗血栓性疾病用于治疗血栓性疾病利用基因工程技术生产药品的优点利用基因工程技术生产药品的优点可用于医药目的的蛋白质或活性多肽都是由相应的基因合成的基因工程的最大好处就在于它有能力从极端复杂的机体细胞内取出所需的基因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应蛋白质利用基因工程技术生产药品的优点利用基因工程技术生产药品的优点（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障（2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如白细胞介素-2的第125位半胱氨酸是游离的，有可能引起-S-S-键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源 第二节第二节 基因工程药物生产的基本过程基因工程药物生产的基本过程基因工程技术：基因工程技术：将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术基因工程基本过程基因工程基本过程基因工程基本过程基因工程基本过程 基因工程药物制药的主要程序基因工程药物制药的主要程序 目的基因的克隆目的基因的克隆 构建构建DAN重组体重组体 DAN重组体转入宿主菌重组体转入宿主菌 构建工程菌构建工程菌 工程菌发酵工程菌发酵 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化 产品的检验等产品的检验等以上程序中的每个阶段都包含若干细致的步骤，这些程序以上程序中的每个阶段都包含若干细致的步骤，这些程序和步骤将会随研究和生产条件的不同而改变和步骤将会随研究和生产条件的不同而改变获得目的基因获得目的基因组建重组质粒组建重组质粒培养工程菌培养工程菌构建基因工程构建基因工程菌或细胞菌或细胞产物分离纯化产物分离纯化除菌过滤除菌过滤半成品检定半成品检定包装包装成品检定成品检定基因工程药物制备的一般过程基因工程药物制备的一般过程基因工程药物生产的上游和下游基因工程药物生产的上游和下游上游：上游：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成下游：下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等下游阶段在产业化中是极其重要的下游阶段在产业化中是极其重要的下游阶段是将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等工程菌的发酵工艺不同于传统的抗生素和氨基酸发酵，需要对影响目的基因表达的因素进行分析，对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因高效表达的发酵工艺，同时建立一系列相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术工程菌（或细胞）构建中重要的工具工程菌（或细胞）构建中重要的工具该过程中重要的工具便是酶酶：限制性内切酶和连接酶是将所需目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入大肠杆菌或其他宿主菌（细胞）大量复制目的基因过程中的重要工具同时为保证目的基因的正确性，对目的基因要进行限制性内切酶和核苷酸序列分析基因表达系统就是上述的工程菌或细胞，有原核生物和真核生原核生物和真核生物两类表达系统物两类表达系统；选择基因表达的系统主要考虑的是保证表达蛋白质的功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。第三节第三节 目的基因的获得目的基因的获得问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的 目的基因，为什么不能进行直接分离？目的基因，为什么不能进行直接分离？Central Dogma of Molecular Biology中心法则中心法则One-way transferof genetic informationfrom nucleic acidto protein is call Central Dogma ofMolecular BiologyInformation Transfer in Prokaryotes and EukaryotesProkaryotesEukaryotes第三节第三节 目的基因的获得目的基因的获得对于目的基因的获得需要根据目的基因的来源采取适当的方法对于真核细胞来源的目的基因，是不能直接进行分离的。真核细胞中单拷贝基因仅是染色体DNA中很小一部分(10-5 10-7)，即使多拷贝基因也是极少的，因此从染色体中分离纯化目的基因是很困难的另外，原核表达系统是有局限性的，主要是由于真核基因的内含子及基因的后翻译过程 真核基因内一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，即便分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA 的转录后加工过程，转录的mRNA 也不能加工，拼接成成熟的mRNA,因此，不能直接克隆真核基因目前克隆真核基因常用的方法有反转录法反转录法和化学合成法化学合成法 一、反转录法反转录法反转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶I（或者Klenow大片段）作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子一一 反转录法反转录法1、mRNA的纯化2、cDNA第一链的合成3、cDNA第二链的合成4、cDNA克隆5、将重组体导入宿主细胞6、cDNA文库的鉴定7、目的cDNA克隆的分离和鉴定cDNA克隆示意图克隆示意图 质粒质粒（Plasmid）是存在于细是存在于细菌染色体外的小菌染色体外的小型环状双链型环状双链DNADNA分子分子,大小约为大小约为数千碱基对。常数千碱基对。常有有1 31 3个抗药个抗药性基因，以利于性基因，以利于筛选筛选。大肠杆菌大肠杆菌T2噬菌体噬菌体蝌蚪形噬菌体结构模式图蝌蚪形噬菌体结构模式图5 将重组体导入宿主细胞将重组体导入宿主细胞体外包装的噬菌体，感染感受态大肠杆菌形成噬菌斑；或转化感受态大肠杆菌使质粒进入细胞内将重组DNA或其他外源DNA导入宿主细胞，常用的方法有转化（transformation）感染（infection）和转染（transfection）二二 化学合成法化学合成法由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列二二 化学合成法化学合成法人工化学合成的限制：一不能合成太长的基因，5060bp；二是人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变（UUU,UUC,UUA,UUG,丝氨酸）；三是费用较高已知核苷酸排列顺序，已知蛋白质氨基酸顺序，再用密码子推导出DNA的核苷酸顺序方法：先合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸片度，再退火成为两端形成黏性末端的DNA双链片段，最后把这些DNA片段按正确的次序进行退火连接形成较长的DNA 片段，再用连接酶连接成完整的基因 第四节第四节 基因表达基因表达 克隆蛋白质药物基因的一个主要目的使为了高效的表达该克隆蛋白质药物基因的一个主要目的使为了高效的表达该基因，从而大量地获得市场原本难以获得的药物。基因，从而大量地获得市场原本难以获得的药物。基因表达基因表达：指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所转录、翻译以及所有加工过程有加工过程。基因高效表达研究基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。产物。进行基因表达研究的主要问题主要问题是目的基因的表达产量、目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。一一 宿主菌的选择宿主菌的选择获得目的基因以后，必须在合适的宿主菌中表达对于宿主细胞其应该：容易获得较高浓度的细胞；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行DNA重组技术操作；产物的产量、产率高，产物容易提取纯化基因表达有两类宿主细胞：一类是原核细胞原核细胞，目前常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；另一类是真核细胞真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。1原核细胞原核细胞（1）大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌表达基因工程产物的形式多种多样：细胞不溶性表达（包含体）、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等，极少数情况下还可分泌到细胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平，且杂质的含量和种类也会变化大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌中的表达的特点大肠杆菌中的表达的特点：不存在信号肽，产品多为胞内产物；分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，产物须在下游 处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性；不存在翻译后修饰作用；翻译通常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多 余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应；产生的内毒素难以除去；产生的蛋白质酶会破坏蛋白质（2）枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌分泌能力强，分泌能力强，可以将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体形成包含体。该菌也不能使蛋白质产物糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此在外源基因克隆表达的应用中受到影响枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌（3）链霉菌链霉菌重要的工业微生物，近年来作为外源基因表达体系正日益受到人们的重视。主要特点：不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，变铅青链霉菌限制修饰能力弱，可以作为理想的受体菌。现已构建了一系列有效的载体，下游培养工艺也已经成熟链霉菌链霉菌2 真核细胞真核细胞（1）酵母酵母 研究基因表达调控的研究基因表达调控的最有效的单细胞真核生物最有效的单细胞真核生物特点：真核生物细胞，故有后翻译过程；基因组小，仅为大肠杆菌的4倍；世代时间短，有单倍体和双倍体两种形式；基因操作与原核生物相似；可以建立有分泌功能的表达系统，将产物分泌出胞外，分离纯化工艺相对简单 各种酵母中以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的应用历史最为悠久，研究资料也最丰富。酿酒酵母（2）丝状真菌丝状真菌近年来，已在约30种以上丝状真菌中建立了DNA转化系统，其特点是：有很强的蛋白分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等，而且其糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉等）等又确认是安全菌株，有成熟的发酵和后处理工艺（3）哺乳动物细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，细胞培养成分完全由人控制，从而使产物纯化变得容易。哺乳动物细胞分泌的基因产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生产慢，产率低，且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。表达体系表达体系 综述综述虽然各种微生物从理论理论上来说都可以用于基因表达，但由于克隆载体、DNA 导入方法以及遗传背景等方面的限制，目前使用最广泛的宿主菌还是 大肠杆菌大肠杆菌 和酵酵母母。一方面它们的遗传背景研究得比较清楚，建立了许多适合它们的克隆载体和 DNA 导入方法,另一方面许多外源基因在这两种宿主菌中表达成功，积累了许多实际操作经验现在我们不仅要继续利用大肠杆菌和酵母，研究清除影响基因表达的各种因素之间的关系，提出更有效的解决方法，而且还要寻找更好的适合于不同外源基因表达的微生物宿主菌大肠杆菌表达体系的优点：大肠杆菌表达体系的优点：大肠杆菌表达体系的优点：大肠杆菌表达体系的优点：积累了充足经验，有数不清的载体可供应用；积累了充足经验，有数不清的载体可供应用；积累了充足经验，有数不清的载体可供应用；积累了充足经验，有数不清的载体可供应用；可因不同载体而选择不同菌种作宿主；可因不同载体而选择不同菌种作宿主；可因不同载体而选择不同菌种作宿主；可因不同载体而选择不同菌种作宿主；操作安全，致病能力低操作安全，致病能力低操作安全，致病能力低操作安全，致病能力低 ；技术操作简便，培养条件简单，技术操作简便，培养条件简单，技术操作简便，培养条件简单，技术操作简便，培养条件简单，成本相对低得多，大规模发酵经济成本相对低得多，大规模发酵经济成本相对低得多，大规模发酵经济成本相对低得多，大规模发酵经济 ；真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆（subclonesubclonesubclonesubclone），然后采用其它方式转移至真核细胞上表达），然后采用其它方式转移至真核细胞上表达），然后采用其它方式转移至真核细胞上表达），然后采用其它方式转移至真核细胞上表达二二 大肠杆菌体系中的基因表达大肠杆菌体系中的基因表达缺点：缺点：缺点：缺点：原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行表达表达表达表达没有加工所需的酶系统没有加工所需的酶系统没有加工所需的酶系统没有加工所需的酶系统热源、内毒素不易除去热源、内毒素不易除去热源、内毒素不易除去热源、内毒素不易除去 常会形成包涵体常会形成包涵体常会形成包涵体常会形成包涵体 基因工程药物研究中常用的表达载体基因工程药物研究中常用的表达载体pBV220系统系统（质粒载体系统）特点：宿主菌为E.coli 质粒拷贝数较多，小量简便快速抽提可满足需求 温度诱导，外源基因的表达量可达到细胞总蛋白的20%-30%正常情况下，产物以包含体的形式存在与细胞内，表达产物不易被降解，均一性好pBV220系统系统特点：克隆宿主与表达宿主分离 可直接插入外源基因 产物以包含体的形式存在与细胞内，外源基因的表达量可达到细胞总蛋白的50%pET系统系统pET系统系统2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因的表达产量与单位容积产量成正相关 单位容积产量与细胞浓度和每个细胞的平均表达产量成正相关（1）外源基因的拷贝数：外源基因的拷贝数：细菌内基因拷贝数增加，表达产量增加。将外源基因拷贝到高拷贝数的表达质粒上，重组质粒拷贝数的增加，必然导致外源基因拷贝数的增加（2）外源基因的表达效率：外源基因的表达效率：启动子的强度、核糖体结合位点的有效性、SD序列和起始密码ATG的间距、密码子的组成等都会不同程度地影响外源基因的表达效率（3）表达产物的稳定性：表达产物的稳定性：外源基因的表达导致细胞内降解外源蛋白的蛋白酶产量增加，即使原始表达量很高，由于很快在菌体内被降解，导致实际产量很低提高表达产物在菌体内的稳定性方法提高表达产物在菌体内的稳定性方法 组建融合蛋白；短的原核多肽与真核蛋白结合，稳定，不易降解 利用大肠杆菌的信号肽或真核多肽中自身的信号肽，真核基因运至胞浆周质空隙中，外源蛋白不易被细菌酶类降解 采用位点突变的方法；改变二硫键，增加稳定性 选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞，可能会减弱表达产物的降解。如黄嘌呤核苷（Ion）是大肠杆菌合成蛋白酶的主要底物，Ion-营养缺陷型大肠杆菌不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶，减少了表达产物在细胞体内的降解。（4）细胞的代谢负荷细胞的代谢负荷外源基因的表达产物属于异己物质，并可能对宿主细胞有毒性，大量的外源基因表达产物可能打破宿主细胞的生长平衡。调节表达物质的积累与细胞的生长和代谢之间的平衡有利于外源基因的高效表达另外通过将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，或将宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开两种手段也可以减轻细胞代谢的负荷形成不溶性的包含体可以降低表达产物对宿主细胞的毒害作用（5）工程菌的培养条件工程菌的培养条件除宿主、载体和克隆基因三者之间的关系影响外源基因的高水平表达外，培养条件亦是非常值得研究的因素。以后会对其进行详细的介绍。3、真核基因在大肠杆菌中的表达形式、真核基因在大肠杆菌中的表达形式（1）融合蛋白的形式融合蛋白的形式真核基因在大肠杆菌中表达的一种简便方式便是使其表达为一种融合蛋白的一部分融合蛋白：短的原核多肽与真核蛋白结合 氨基端为原核序列，羧基端为真核系列融合蛋白在菌体内稳定，不易被细菌酶类降解只能作抗原用，融合蛋白的原核多肽序列，影响真核蛋白的免疫原性，一般不能作为人体注射用药 （2）非融合蛋白的形式非融合蛋白的形式指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含任何细菌多肽序列表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌或噬菌体的启动子细菌的核糖体结合位点（SD序列）真核基因的起始密码子结构基因终止密码要表达非融合蛋白，要求SD序列与翻译起始密码ATG之间的距离要适合，SD序列与翻译起始密码ATG之间即使只改变23个碱基，表达效率也会受到很大的影响非融合蛋白能较好的保持原来的蛋白活性，但易被蛋白酶破坏，其N端常带有甲硫氨酸，可引起人免疫反应（3）分泌型表达蛋白药物基因：分泌型表达蛋白药物基因：外源蛋白的表达是通过将外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的下游来实现的。利用大肠杆菌的信号肽，构建分泌型表达质粒，常用的信号肽有碱性磷酸酶信号肽（phoA）、膜外周质蛋白信号肽（OmpA）、霍乱弧菌毒素B亚单位（CTXB）等；也能利用一些真核多肽自身的信号肽（能被细菌所识别和切割的），把真核基因产物搬运到胞浆周质的空隙中特点：特点：一些可被胞内蛋白酶所降解的蛋白质在周质中是稳定的；由于有些蛋白质能按一定的方式折叠，所以在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌表达时却具有活性；蛋白信号肽和编码序列之间能被切割，因而分泌蛋白质不含起始密码ATG所编码的甲硫氨酸等遇到的问题遇到的问题：产量不高、信号肽不被切割或不在特定位置上切割等四四 动物中的基因表达动物中的基因表达优点：哺乳动物细胞外源基因表达产物可由重组转化的细胞 分泌到培养 液中,容易分离纯化 基因产物糖基化接近天然产物基因产物糖基化接近天然产物缺点：细胞生长慢，生产率低，条件刻苛，费用高，培养液浓度较小 表达的外源细胞均为传代细胞 表达产物是否致癌致癌尚有疑问 主要基因工程表达体系比较主要基因工程表达体系比较主要基因工程表达体系比较主要基因工程表达体系比较表达体系表达体系 产产 物物 产生部位产生部位 培养方式培养方式 提提 纯纯 产物活性产物活性 潜在危性潜在危性大肠杆菌大肠杆菌 多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内 容易容易 一般一般 对原核好对原核好 不大不大 融合蛋白质融合蛋白质 部分高产部分高产 对真核差对真核差 酵酵 母母 多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内 容易容易 菌体内菌体内 真核的接近真核的接近 不大不大 糖基化蛋白糖基化蛋白 外分泌外分泌 可高产可高产 稍复杂稍复杂 天然产物天然产物 哺乳动物哺乳动物 完完 整整 外分泌外分泌 较难成本高较难成本高 简单简单 可达天然可达天然 需注意需注意 糖基化蛋白糖基化蛋白 可高产可高产 产物产物 致癌致癌第五节第五节 基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点菌体生长是菌体各成分尤其是生物大分子核酸和蛋白质合成的综合表现，通常用比生长速率生长速率表示碳源、补料或稀释速率碳源、补料或稀释速率可调控菌体生长。菌体的生长反应了蛋白质合成的速度。控制菌体生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物的积累、提高外源蛋白产率方面都具有一定的意义菌体生长调控的主要两种观点：能量的供应决定了菌体的最大比生长速率 小分子前体或催化组分（RNA聚合酶，核糖体）的限制决定 了菌体的最大比生长速率第六节第六节 基因工程菌的不稳定性基因工程菌的不稳定性一 质粒不稳定产生的原因（质粒不稳定产生的原因（分裂不稳定、结构不稳定分裂不稳定、结构不稳定）分裂的不稳定：分裂的不稳定：工程菌分裂时出现一定比例的不含质粒的子代菌 质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质粒的丢失与宿主菌、质粒特性和培养条件有关 两种菌的比生长速率的大小差异，丢失质粒的菌体具有生长优势 结构的不稳定：结构的不稳定：DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所 致工程菌性能的改变 与质粒的同源重组和培养条件有关二二 提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法选择合适的宿主菌：选择合适的宿主菌：宿主菌的遗传特性影响质粒的稳定选择合适的载体：选择合适的载体：含低拷贝质粒的工程菌，增加质粒拷贝数提高质粒稳定性；含高拷贝质粒的工程菌，通过控制比生长速率，降低拷贝数，提高稳定性选择压力选择压力：选择压力（抗生素）提高了工程菌的生长优势分阶段控制培养分阶段控制培养：外源基因表达水平越高，重组质粒越不稳定 第一阶段外源基因未表达，菌体生长；第二阶段，外源基因表达 由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性生长速率的差别，增加了质粒稳定性 在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性性 有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。通过变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性 控制培养条件：控制培养条件：培养条件影响了菌体的比生长速率培养条件影响了菌体的比生长速率，比生长速率影响了菌体的稳定性，比生长速率与培养环境有关 采用适当的操作方式可使工程菌生长速率具有优势，并使工程菌和质粒丢失菌生长竞争趋于极端化。可调控的环境参数为温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。通过间隙供氧和改变稀释速率都可以提高质粒的稳定性固定化：固定化：基因重组菌固定化以后，质粒的稳定性和目的基因产物的产率都有了很大的提高第七节第七节 基因工程菌中试基因工程菌中试在做工业化之前的试验在做工业化之前的试验 在确定一个项目前，先要进行实验室试验 第二步就是小试，也就是根据实验室结果进行放大，放大倍数一般不一样，如510倍等 第三步就是中试，就是根据小试结果继续放大，当中试试验成功后就基本可以进行生产了 比如：实验室是0.5L，小试5L，中试500L 具体放大比例不确定 中试可以得到较大量的临床试验，也可以将中试所得的数据提供生产设计时参考第七节第七节 基因工程菌中试（基因工程菌中试（p34）工程菌的选择工程菌的选择：具有工业生产潜力反应器（发酵罐）设计反应器（发酵罐）设计：符合生物反应和化学工程的需要发酵培养基组成发酵培养基组成：符合工业化生产需求工艺优化和参数控制：工艺优化和参数控制：符合生产的最佳条件，4种参数监控计算机的应用：计算机的应用：在线监控发酵参数指标菌种菌种菌种菌种 一级种子摇瓶一级种子摇瓶一级种子摇瓶一级种子摇瓶 二级种子罐培养二级种子罐培养二级种子罐培养二级种子罐培养 扩大培养扩大培养扩大培养扩大培养 原料原料原料原料 发酵培养发酵培养发酵培养发酵培养 灭菌灭菌灭菌灭菌 发酵生产发酵生产发酵生产发酵生产 代谢产物分离代谢产物分离代谢产物分离代谢产物分离 基配制基配制基配制基配制 微生物工业发酵过程简图微生物工业发酵过程简图微生物工业发酵过程简图微生物工业发酵过程简图第八节：重组工程菌的培养第八节：重组工程菌的培养一一 基因工程菌的培养方式基因工程菌的培养方式分批培养分批培养:指在发酵过程中，除了不断进行通气（好氧发指在发酵过程中，除了不断进行通气（好氧发酵）和为调节发酵液的酵）和为调节发酵液的 pH 而加入酸碱溶液外，与外界没而加入酸碱溶液外，与外界没有其它物料交换的一种发酵方式。培养基的量一次性加入，有其它物料交换的一种发酵方式。培养基的量一次性加入，产品一次性收获，是目前广泛采用的一种发酵方式产品一次性收获，是目前广泛采用的一种发酵方式 其优点是：其优点是：对温度的要求低，工艺操作简单；比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题；对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发 酵要高缺点是：缺点是：人力、物力、动力消耗较大 生产周期较长，由于分批发酵时菌体有一定的生长 规律，都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而 且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段 生产效率低，生产上常以体积生产率（以每小时每升发酵物 中代谢产物的 g 数来表示）来计算效率，在分批发酵过程 中，必须计算全过程的生产率，即时间不仅包括发酵时间，而且也包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间补料分批培养补料分批培养:是指将种子接入发酵罐进行培养，经过一段时间是指将种子接入发酵罐进行培养，经过一段时间后，间歇或者连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养后，间歇或者连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法方法优点：通过优点：通过溶氧控制溶氧控制和和流加补料相结合流加补料相结合（DO-Stat,Balanced DO-Stat），），控制菌体比生长速率控制菌体比生长速率等方法，等方法，能够较好地维持基因工程菌生长所需的良好环境，延长能够较好地维持基因工程菌生长所需的良好环境，延长 对数其对数生长期，获得高密度菌体对数其对数生长期，获得高密度菌体连续培养：连续培养：种子液接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达种子液接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达一定程度以后，开动进料和出料蠕动泵，以一一定程度以后，开动进料和出料蠕动泵，以一 定稀释率进行不间定稀释率进行不间断的培养断的培养优点：连续培养可以为微生物恒定的生活环境，控制其生长速率，优点：连续培养可以为微生物恒定的生活环境，控制其生长速率，为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因标的的影响等创造了良好的条件因标的的影响等创造了良好的条件缺陷：基因工程菌不稳定，连续培养困难缺陷：基因工程菌不稳定，连续培养困难 解决的办法：两阶段连续培养：解决的办法：两阶段连续培养：工程菌的生长阶段与基因表达阶段分开工程菌的生长阶段与基因表达阶段分开固定化培养：固定化培养：基因工程菌固定化以后，可提高质粒的稳定性固定化细胞的制备方式固定化细胞的制备方式固定化细胞的制备方式是多种多样的，大致可以分成如下三种方法：吸附法、包埋法、交联法吸附法、包埋法、交联法吸附法吸附法，又叫载体结合法，是依据带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和粘附力的作用，使微生物细胞固定细胞固定在载体表面和内部形成生物膜。吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法两种。该法操作简单，固定化过程对细胞活性影响小包埋法，包埋法，是将微生物包埋在凝胶的微小格子微小格子或微胶囊微胶囊等有限空间内，微生物被包裹在该空间内不能离开，而底物和产物能自由地进出这个空间，常用的有凝胶包埋法。纤维包埋法和微胶囊法。包埋法对细胞活性影响小，它是固定化细胞常用的方法交联法交联法，是通过利用含有两个或两个以上官能基团的试剂与微生物细胞表面的反应基团如羧基、氨基等发生反应，使细胞之间交联成网格结构，从而制成固定化网格，其结合力是共价键。该固定化方法微生物反应活性损失较大损失较大，且采用的交联剂大都比较昂贵，因此应用受到一定的限制戊二醛戊二醛交联法交联法制备固定化菌细胞细胞固定化工程菌细胞的培养固定化工程菌细胞的培养二二 基因工程菌的培养工艺基因工程菌的培养工艺 基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同,基因基因工程菌带外源基因工程菌带外源基因,发酵的目的是使外源基因高效表发酵的目的是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关达。它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关系还和环境有关系还和环境有关 工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有：纯化。对发酵影响较大的几个因素有：纯化。对发酵影响较大的几个因素有：纯化。对发酵影响较大的几个因素有：培养基的影响培养基的影响培养基的影响培养基的影响 接种量的影响接种量的影响接种量的影响接种量的影响 温度的影响温度的影响温度的影响温度的影响 溶解氧的影响溶解氧的影响溶解氧的影响溶解氧的影响 诱导时机的影响诱导时机的影响诱导时机的影响诱导时机的影响 诱导程序的影响诱导程序的影响诱导程序的影响诱导程序的影响 7 pH 7 pH 7 pH 7 pH的影响的影响的影响的影响 培养基的影响培养基的影响培养基的影响培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。常用的碳源保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。常用的碳源保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。常用的碳源保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等