基因工程的基本操作程序选修市公开课一等奖百校联赛获奖课件.pptx

1.2 1.2 基因工程基本操作程序基因工程基本操作程序第1页 目标基因获取目标基因获取 基因表示载体构建（基因表示载体构建（关键关键）将目基因导入受体细胞 目标基因检测与判定目标基因检测与判定四四 个个 步步 骤骤第2页一、目标基因获取一、目标基因获取(一)、目基因主要是_编码蛋白质基因编码蛋白质基因（二）、获取目标基因惯用方法（二）、获取目标基因惯用方法从基因文库中获取从基因文库中获取利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增人工合成人工合成第3页1)1)基因文库？基因文库？1.从基因文库中获取目基因将含有将含有某种生物某种生物不一样基因许多不一样基因许多DNADNA片断，片断，导入到导入到受体菌受体菌群体中，各个受体菌分别含有群体中，各个受体菌分别含有这种生物不一样基因，称为基因文库这种生物不一样基因，称为基因文库2)2)基因文库种类基因文库种类:种种类类基因组基因组DNA文库：文库：含有一个生物含有一个生物全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一个生物只包含了一个生物部分部分基因，基因，如：如：cDNA文库文库第4页受体菌整个群体包含了这种生物全部基因受体菌整个群体包含了这种生物全部基因基因组文库构建模式图基因组文库构建模式图第5页cDNA文库构建模式图文库构建模式图 杂交双链杂交双链(单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA反转录酶反转录酶双链双链DNADNA(cDNAcDNA)某种生物某种生物mRNAmRNA某种酶某种酶DNADNA聚合酶聚合酶与载体连接后导入受体菌贮存，组成与载体连接后导入受体菌贮存，组成cDNAcDNA文库文库第6页思索：思索：怎样从基因文库中得到我们所需目标基因呢？怎样从基因文库中得到我们所需目标基因呢？基因核苷酸序列基因核苷酸序列基因功效基因功效基因在染色体上位置基因在染色体上位置基因转录产物基因转录产物mRNA基因表示产物蛋白质基因表示产物蛋白质依据基因依据基因相关信息相关信息第7页概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项在生物，是一项在生物_复制复制_核酸合成技术。核酸合成技术。多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段（2）利用PCR技术扩增目基因过程过程第8页变性变性复性复性延伸延伸第9页1.1.变性变性（90-90-9595）双链双链DNADNA模板模板在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_氢键氢键单链单链DNADNA2.2.复性复性 (55-65)(55-65)温度降低，温度降低，与与DNADNA模板结合，形成模板结合，形成局部局部_。双链双链引物引物3.3.延伸延伸（70-7570-75）在在 作用下，从作用下，从引物引物 连接连接 ，合，合 成与模板互补成与模板互补DNADNA链。链。33端端脱氧核苷酸脱氧核苷酸TaqTaq酶酶第10页2 2、详细过程、详细过程第11页原理：原理：.DNADNA复制原理复制原理已知基因核苷酸序列已知基因核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸1 1对引物对引物DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶酶)条件条件模板模板原料原料酶酶引物引物能量能量第12页PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制比较复制比较PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不一样点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶高温下变性解旋高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制(PCR扩增仪扩增仪内内)主要在细胞核内主要在细胞核内热稳定热稳定DNA聚合酶聚合酶（Taq酶）酶）大量大量DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子解旋酶、解旋酶、普通普通DNADNA聚合酶等聚合酶等第13页3.3.人工合成人工合成1)1)反转录法：反转录法：杂交双链杂交双链(单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA双链双链DNADNA(cDNAcDNA)目标基因目标基因mRNAmRNA某种酶某种酶DNADNA聚合酶聚合酶反转录酶反转录酶第14页2)2)依据已知氨基酸序列合成依据已知氨基酸序列合成DNADNA法法 ：蛋白质氨基酸序列蛋白质氨基酸序列mRNAmRNA核苷酸序列核苷酸序列基因脱氧核苷酸序列基因脱氧核苷酸序列推测推测推测推测目基因化学合成化学合成第15页二、基因表示载体构建（二、基因表示载体构建（关键关键）使目基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代使目基因能够表达和发挥作用1 1、基因、基因表示载体表示载体构建目标构建目标？（？（P11P11）第16页2 2、基因表示载体组成？、基因表示载体组成？开启子开启子目基因终止子终止子标识基因标识基因1 1、开启子？终止子？标识基因？它们作用是？、开启子？终止子？标识基因？它们作用是？2、作为基因工程表达载体，只需含有目基因就可以完成任务吗？3 3、基因表示载体构建是千篇一律吗？基因表示载体构建是千篇一律吗？第17页三、将目基因导入受体细胞目标基因进入目标基因进入_ _内，而且在受体内，而且在受体细胞内维持细胞内维持_ _ _和和_ _过程过程转化转化:受体细胞受体细胞稳定稳定表示表示第18页1 1、将目标基因导入植物细胞方法：、将目标基因导入植物细胞方法：易感染易感染双子叶植物双子叶植物和和裸子植物裸子植物，对大多数单，对大多数单子叶植物没有感染能力子叶植物没有感染能力原理：原理：Ti质粒上质粒上T-DNA（可转移（可转移DNA)能够转移到受体细胞，而且整合到受体细能够转移到受体细胞，而且整合到受体细胞染色体胞染色体DNA上。上。农杆菌特点：农杆菌特点：（1）农杆菌转化法）农杆菌转化法(采取最多）第19页两次拼接？两次导入？两次拼接？两次导入？组织培养技术组织培养技术第20页（2 2）基因枪法）基因枪法（3 3）花粉管通道法）花粉管通道法第21页 显微注射技术（最惯用，最有效）显微注射技术（最惯用，最有效）（3）将目基因导入动物细胞方法方法受体细胞受体细胞惯用受精卵惯用受精卵动物细胞受精卵全能性大动物细胞受精卵全能性大目标基因表示载体提纯目标基因表示载体提纯取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物过程：过程：第22页（2）将目基因导入微生物细胞过程：过程：Ca2+处理受体细胞处理受体细胞感受态细胞感受态细胞重组表示载体与感受态细胞混合重组表示载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNA分子分子思索：早期基因工程用什么作受体细胞？为何？思索：早期基因工程用什么作受体细胞？为何？惯用原核生物，因为原核生物繁殖快、多为单细惯用原核生物，因为原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。胞、遗传物质相对较少等。方法方法CaCa2+2+处理法处理法用用CaCa2 2处理，处理，增加细菌细增加细菌细胞壁通透性胞壁通透性思索：思索：为何要为何要用用Ca2+处理受处理受体细胞？体细胞？第23页受体生物受体生物 植物植物 动物动物 微生物微生物受体细胞受体细胞导入方法导入方法受精卵受精卵体细胞体细胞受精卵受精卵细胞细胞/个体个体农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注显微注射技术射技术用用CaCa2+2+处理成处理成感受态细胞感受态细胞采取基因工程方法培育抗虫棉，以下导入目标基因作法正确是（采取基因工程方法培育抗虫棉，以下导入目标基因作法正确是（）A.A.将毒素蛋白注射到受精卵中将毒素蛋白注射到受精卵中B.B.将编码毒素蛋白将编码毒素蛋白DNADNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉体细胞，再进行组织培养感染棉体细胞，再进行组织培养C.C.将编码毒素蛋白将编码毒素蛋白DNADNA序列，与质粒重组，注射到棉子房并进入序列，与质粒重组，注射到棉子房并进入受精卵受精卵D.D.将编码毒素蛋白将编码毒素蛋白DNADNA序列，注射到棉受精卵中序列，注射到棉受精卵中第24页四、目标基因检测与判定四、目标基因检测与判定检测转基因生物染色体检测转基因生物染色体DNADNA上是否插上是否插入了目标基因入了目标基因1 1、导入检测、导入检测目：方法：方法：DNADNA分子杂交技分子杂交技术术第25页从转基因生物中提取基因组从转基因生物中提取基因组DNADNA探针？探针？杂交对象？杂交对象？用放射性同位素标识用放射性同位素标识含目标基因含目标基因DNADNA片段片段1515N N1515N N1414N N探针探针探针探针转基因生转基因生转基因生转基因生物物物物DNADNA变性变性变性变性变性变性变性变性1414N N过过程程.首先取出首先取出转基因生物基因组转基因生物基因组DNA.用含目标基因用含目标基因DNA片段用片段用放射性同位素等作标识放射性同位素等作标识,以此做以此做探针探针。使探针和转基因生物基因组杂交使探针和转基因生物基因组杂交,若显示出若显示出杂交带杂交带,表明目标基因已插入染色体表明目标基因已插入染色体DNA中中第26页2 2、转录检测、转录检测目：检测目基因是否转录出了mRNA方法：方法：分子杂交技术分子杂交技术用放射性同位素标识用放射性同位素标识含目标基因含目标基因DNADNA片段片段探针？探针？杂交对象？杂交对象？从转基因生物中提取从转基因生物中提取mRNA.mRNA.3 3、翻译检测、翻译检测目：检测目基因是否翻译成蛋白质方法方法:抗原抗体杂交技术抗原抗体杂交技术从转基因生物中提取蛋白质从转基因生物中提取蛋白质抗原？抗原？抗体？抗体？将目标基因编码蛋白质注射进动物体内进行免疫产生将目标基因编码蛋白质注射进动物体内进行免疫产生对应抗体对应抗体4、个体生物学水平判定、个体生物学水平判定抗虫判定、抗病判定、抗虫判定、抗病判定、活性判定等活性判定等第27页DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采取一定技术伎俩，将两种生物采取一定技术伎俩，将两种生物DNADNA分子单分子单链放在一起，假如这两个单链含有互补碱基序链放在一起，假如这两个单链含有互补碱基序列，那么，互补碱基序列就会结合在一起，形列，那么，互补碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列部位，依成杂合双链区；在没有互补碱基序列部位，依然是两条游离单链。然是两条游离单链。第28页归纳:基因工程基本操作程序1.1.获取目标基因获取目标基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表示载体构建基因表示载体u目标基因、开启子、终止子、标识基因目标基因、开启子、终止子、标识基因3.3.将目标基因导入受体细胞将目标基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法、农杆菌转化法、显微注射法、Ca2+处理法处理法4.4.目标基因检测与判定目标基因检测与判定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u判定：判定：个体生物学水平判定个体生物学水平判定第29页第30页1.1.原核细胞基因结构原核细胞基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点开启子开启子终止子终止子开启子：开启子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNAmRNA合成序列。没有开启子，基因就不能转录。合成序列。没有开启子，基因就不能转录。终止子：终止子：位于基因尾端一段特殊位于基因尾端一段特殊DNADNA片断，它能妨碍片断，它能妨碍RNARNA聚合酶移动，并使其从聚合酶移动，并使其从DNADNA模板链上脱离下来，使转录终模板链上脱离下来，使转录终止。止。RNARNA聚合酶聚合酶:能够识别开启子上结合位点并与其结合一能够识别开启子上结合位点并与其结合一个蛋白质个蛋白质.(.(以模板转录然后脱落以模板转录然后脱落)第31页编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质序列叫做外显子能够编码蛋白质序列叫做外显子 不能够编码蛋白质序列叫做不能够编码蛋白质序列叫做内含子内含子开启子开启子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：2.2.真核细胞基因结构真核细胞基因结构第32页原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不一样点编码区是_编码区是间隔、_相同点相同点都由能够编码蛋白质_和含有调控作用 组成原核细胞与真核细胞基因结构比较原核细胞与真核细胞基因结构比较思索思索编码相同数目氨基酸蛋白质，原核细编码相同数目氨基酸蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码区非编码区第33页基因组文库与基因组文库与cDNAcDNA文库比较文库比较文库类型文库类型 cDNA cDNA文库文库 基因组文库基因组文库文库大小文库大小基因中是否有开启子基因中是否有基因中是否有内含子内含子基因多少基因多少物种间基因交流小小有有无无有有无无某种生物全部基因某种生物全部基因某种生物部分基某种生物部分基因因部分基因能够部分基因能够能够能够大大第34页