DNA生物合成过程省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第三节第三节DNA生物合成过程生物合成过程第1页 DNA合成期合成期第2页 一、复制起始一、复制起始几个相关概念：几个相关概念：1.复制起始点复制起始点(origin,ori)原核生物只有一个复制起始点；原核生物只有一个复制起始点；真核生物染色体真核生物染色体DNA有多个复制起始有多个复制起始 点，同时形成多个复制单位，点，同时形成多个复制单位，两个起始点两个起始点 之间之间DNA片段称为片段称为复制子复制子(replicon)。第3页 第4页 2.复制叉复制叉(replication fork)复制时双链打开，分开成两股，新链沿复制时双链打开，分开成两股，新链沿着张开模板生成，复制中形成这种着张开模板生成，复制中形成这种Y字形结构称为字形结构称为复制叉复制叉。第5页 3.双向复制双向复制(bidirectional replication)原核生物复制原核生物复制是从一个起始点开是从一个起始点开始，同时向两个方始，同时向两个方向进行，称为向进行，称为双向双向复制复制。复制中。复制中DNA成为成为 状。状。第6页 DNA复制起始就是要解开双链和生成复制起始就是要解开双链和生成引物。引物。(一一)DNA)DNA解成单链解成单链 由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶 解开双链，解开双链，SSBSSB结合到单链上使其稳定。结合到单链上使其稳定。第7页 复制起始解链需要复制起始解链需要各种蛋白质参加。这些各种蛋白质参加。这些蛋白质与复制起始点特蛋白质与复制起始点特有序列结合，促使其邻有序列结合，促使其邻近近DNADNA解链。解链。第8页 (二二)引物合成引物合成引发体引导引物酶抵达适当位置合成引物。引发体引导引物酶抵达适当位置合成引物。第9页 Dna A Dna B、Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 引发体和引物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域复合结构称为引发体。复制起始区域复合结构称为引发体。第10页3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成短链引物是由引物酶催化合成短链RNA分子。分子。引物引物3 HO5引物引物酶酶第11页 引物长度约为十几个到几十个核引物长度约为十几个到几十个核 苷酸不等。引物合成方向也是苷酸不等。引物合成方向也是5 533 方向。方向。DNADNA聚合就是在引物聚合就是在引物3 3OHOH 上进行。上进行。第12页 二、复制延长二、复制延长 在在DNA聚合酶催化下，以解开聚合酶催化下，以解开 单链为模板，以四种单链为模板，以四种dNTP为原料，进为原料，进 行聚合作用。即新进入行聚合作用。即新进入 dNTP 与引物与引物 3OH形成磷酸二酯键，由形成磷酸二酯键，由53方方向延长子链。向延长子链。第13页 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目目 录录模板方向模板方向355合成需要引物提供合成需要引物提供3-OH3-OH合成方向合成方向5353底物是底物是dNTP dNTP 第14页 第15页第16页第17页 (一一)半不连续复制半不连续复制领头链领头链(leading strand)顺着解链方向生成子链，其复制是顺着解链方向生成子链，其复制是连续进行，得到一条连续子链。连续进行，得到一条连续子链。第18页领头链合成领头链合成目目 录录第19页 随从链随从链(lagging strand)复制方向与解链方向相反，须等解开复制方向与解链方向相反，须等解开足够长度模板链才能继续复制，得到足够长度模板链才能继续复制，得到子链由不连续片段所组成。子链由不连续片段所组成。第20页 冈崎片段冈崎片段：1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射年日本生化学者冈崎用电镜及放射 自显影技术，观察到自显影技术，观察到DNA复制中出现一复制中出现一 些不连续片段些不连续片段，因而将这些不连续，因而将这些不连续 片段称为冈崎片段。片段称为冈崎片段。原核生物冈崎片段为一至二千个核苷原核生物冈崎片段为一至二千个核苷 酸，真核生物约为数百个核苷酸。酸，真核生物约为数百个核苷酸。第21页随从链合成随从链合成目目 录录第22页 第23页 第24页 第25页 (二二)滚环复制滚环复制(rolling circle replication)一些简单低等生物或染色体以外一些简单低等生物或染色体以外DNA 复制特殊形式。复制特殊形式。第26页 三、复制终止三、复制终止1.1.随从链不连续片段连接随从链不连续片段连接2.2.原核生物在复制终止点汇合原核生物在复制终止点汇合3.3.真核生物端粒合成真核生物端粒合成第27页 (一一)不连续片段连接不连续片段连接第28页 (二二)原核生物复制终止原核生物复制终止原核生物环状原核生物环状DNA为双向复制，为双向复制，复制片段在复制终止点汇合。每个复制片段在复制终止点汇合。每个 方向领头链和相反方向随从链方向领头链和相反方向随从链 连接与不连续片段连接相同。连接与不连续片段连接相同。第29页原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制复制片段，双向复制复制片段在复制终止点在复制终止点(ter)处汇合。处汇合。第30页 (三三)真核生物复制终止真核生物复制终止染色体染色体DNA呈线性，复制在末端停顿。呈线性，复制在末端停顿。第31页哺乳动物细哺乳动物细胞周期胞周期DNA合成期合成期G1G2SM二、真核生物二、真核生物DNA生物合成生物合成 细细胞胞能能否否分分裂裂，决决定定于于进进入入S期期及及M期期这这两两个个关关键键点点。G1S及及G2M调调整整，与与蛋蛋白白激激酶酶活活性性相关。相关。蛋蛋白白激激酶酶经经过过磷磷酸酸化化激激活活或或抑抑制制各各种种复复制制因因子子而而实施调控作用。实施调控作用。第32页 真真核核生生物物每每个个染染色色体体有有多多个个起起始始点点，是是多多复复制制子子复复制制。复复制制有有时时序序性性，即即复复制制子子以以分组方式激活而不是同时起动。分组方式激活而不是同时起动。复复制制起起始始需需要要DNA-pol（引引物物酶酶活活性性）和和pol（解解螺螺旋旋酶酶活活性性）参参加加。还还需需拓拓扑扑酶酶和和复制因子复制因子(replication factor,RF)。Pol 合成合成RNARNA引物后继续合成短引物后继续合成短DNADNA （一）复制起始（一）复制起始第33页 增增殖殖细细胞胞核核抗抗原原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。在复制起始和延长中起关键作用。三聚体中空管，为滑卡三聚体中空管，为滑卡复复制制因因子子C（replication factor C,RF-C）由由5种种亚亚基基组组成，有成，有ATP结合位点，是结合位点，是PCNA装卡器装卡器 复复制制因因子子A（replication factor A,RF-A)是是单单链链DNA结结合蛋白合蛋白 第34页ARS第35页3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体（二）复制延长（二）复制延长第36页第37页第38页第39页第40页染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停顿。呈线状，复制在末端停顿。复制中岡崎片段连接，复制子之间连接。复制中岡崎片段连接，复制子之间连接。染色体两端染色体两端DNA子链上最终复制子链上最终复制RNA引物，去引物，去除后留下空隙。除后留下空隙。（三）复制终止（三）复制终止第41页53oriorioriori535533553复制子复制子3复制子复制子第42页 端粒端粒(telomere)真核生物染色体线性真核生物染色体线性DNA分子末分子末 端结构。端结构。结构特点：结构特点：1.由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质组成序列和蛋白质组成2.末端末端DNA序列是屡次重复富含序列是屡次重复富含G、C 碱基短序列碱基短序列功效：功效：1.维持染色体稳定性维持染色体稳定性 2.维持维持DNA复制完整性复制完整性第43页 端粒酶端粒酶(telomerase)特点：特点：1.由由RNA和蛋白质组成复合物和蛋白质组成复合物2.为特殊逆转录酶，能以本身为特殊逆转录酶，能以本身RNA为为模板逆转录合成端粒模板逆转录合成端粒DNA功效：功效：合成端粒合成端粒DNA，维持端粒长度，维持端粒长度第44页 爬行模型：爬行模型：第45页 端粒及端粒酶意义：端粒及端粒酶意义：端粒长短及端粒酶活性变端粒长短及端粒酶活性变 化与细胞水平化与细胞水平老化老化(aging)及及 肿瘤肿瘤发生有一定关系。发生有一定关系。第46页（五）真核生物（五）真核生物DNA复制特点复制特点 1.复制速度慢复制速度慢 真核生物基因组复制先要解开核小体，复制叉前真核生物基因组复制先要解开核小体，复制叉前进速度慢。真核生物基因组复制速度大约每秒钟进速度慢。真核生物基因组复制速度大约每秒钟50个核苷酸，仅为原核生物十分之一。个核苷酸，仅为原核生物十分之一。2.多起点复制多起点复制 真核生物每条染色体上都有多个复制起点，这些真核生物每条染色体上都有多个复制起点，这些复制起点可同时或先后发动复制。真核生物复制叉复制起点可同时或先后发动复制。真核生物复制叉行进速度虽慢，但因为复制起点多，复制子小，整行进速度虽慢，但因为复制起点多，复制子小，整个个DNA复制速度还是快速。复制速度还是快速。第47页3.引物及岗崎片段长度均小于原核生物引物及岗崎片段长度均小于原核生物 动物细胞中引物长度约动物细胞中引物长度约10个核苷酸，岗崎个核苷酸，岗崎片段长约片段长约100-200个核苷酸。真核生物岗崎片个核苷酸。真核生物岗崎片段长度可能和核小体结构相关。段长度可能和核小体结构相关。引物中混有引物中混有DNA 4.组蛋白合成与组蛋白合成与DNA复制同时复制同时 组蛋白合成也在细胞组蛋白合成也在细胞S期，与期，与DNA复制同复制同时进行。组蛋白和时进行。组蛋白和DNA组装成核小体。组装成核小体。5.真核生物染色体全部复制完成以前不会发动真核生物染色体全部复制完成以前不会发动新一轮复制。新一轮复制。第48页复制基本规律复制基本规律Basic Rules of DNA ReplicationBasic Rules of DNA Replication 第三节第三节第49页半保留复制半保留复制(semi-conservative replication)双向复制双向复制(bidirectional replication)半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication)条件：条件：DNA模板模板355 RNA RNA引物提供引物提供3-OH3-OH dNTP dNTP 底物底物 DNA聚合方向聚合方向533 复制高保真性复制高保真性(high fidelity)第50页1.恪守严格碱基配对规律；恪守严格碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基选择功效；聚合酶在复制延长时对碱基选择功效；3.复制犯错时复制犯错时DNA-pol及时校读功效。及时校读功效。DNA复制保真性最少要依赖三种机制复制保真性最少要依赖三种机制 第51页DNA-pol核酸外切酶活性和及时校读核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol外切酶活性切除错配碱基；并用其外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配正确底物。聚合活性掺入正确配正确底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。不表现活性。第52页逆转录和其它复制方式逆转录和其它复制方式Reverse Transcription and Other DNA Reverse Transcription and Other DNA Replication WaysReplication Ways第四节第四节第53页逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase)逆转录逆转录(reverse transcription)逆转录逆转录酶酶一、逆转录病毒和逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶 第54页逆转录病毒细胞内逆转录现象逆转录病毒细胞内逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA第55页逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目标基因主要方法之一，此法称标基因主要方法之一，此法称为为cDNA法。法。以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成与录合成与mRNA碱基序列互补碱基序列互补DNA链。链。试管内合成试管内合成cDNAcDNA complementary DNA 第56页二、逆转录研究意义二、逆转录研究意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中重大发觉。重大发觉。逆转录现象说明：最少在一些生物，逆转录现象说明：最少在一些生物，RNA一样一样兼有遗传信息传代与表示功效。兼有遗传信息传代与表示功效。对逆转录病毒研究，拓宽了对逆转录病毒研究，拓宽了20世纪初已注意到世纪初已注意到病毒致癌理论。病毒致癌理论。第57页 滚环复制滚环复制(rolling circle replication)三、滚环复制和三、滚环复制和D环复制环复制 是一些低等生物复制形式，如是一些低等生物复制形式，如 X174和和M13噬菌体等。噬菌体等。第58页3-OH5-P5 5 5 3 3 3 3 5滚环复制滚环复制5 5 3 3 5 目目 录录第59页dNTPDNA-pol D环复制环复制(D-loop replication)是线粒体是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)复制形式。复制形式。第60页第61页