DNA的生物合成省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

目目 录录DNA生物合成生物合成(复制复制)DNA Biosynthesis，Replication 第第 九九 章章第1页目目 录录中心法则（central dogma）遗传信息传递方向规律遗传信息传递方向规律基因表示：基因表示：是指将遗传信息由是指将遗传信息由DNA转录转录为为RNA、再、再翻译翻译成蛋白质过程成蛋白质过程第2页目目 录录第3页目目 录录复制复制(replication)是指遗传物质传代，以母链是指遗传物质传代，以母链DNA为模板合为模板合成子链成子链DNA过程。过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA第4页目目 录录复制基本规律复制基本规律Basic Rules of DNA Replication 第一节第一节第5页目目 录录一、半保留复制试验依据和意义一、半保留复制试验依据和意义 DNADNA生生生生物物物物合合合合成成成成时时时时，母母母母链链链链DNADNA解解解解开开开开为为为为两两两两股股股股单单单单链链链链，各各各各自自自自作作作作为为为为模模模模板板板板(template)(template)按按按按碱碱碱碱基基基基配配配配对对对对规规规规律律律律，合合合合成成成成与与与与模模模模板板板板互互互互补补补补子子子子链链链链。子子子子代代代代细细细细胞胞胞胞DNADNA，一一一一股股股股单单单单链链链链从从从从亲亲亲亲代代代代完完完完整整整整地地地地接接接接收收收收过过过过来来来来，另另另另一一一一股股股股单单单单链链链链则则则则完完完完全全全全从从从从新新新新合合合合成成成成。两两两两个个个个子子子子细细细细胞胞胞胞DNADNA都都都都和和和和亲亲亲亲代代代代DNADNA碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列一一一一致致致致。这这这这种种种种复复复复制制制制方方方方式式式式称称称称为为为为半保留复制半保留复制半保留复制半保留复制。半保留复制概念半保留复制概念第6页AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA 复制过程中形成复制过程中形成复制叉复制叉子代子代DNA 目目 录录第7页目目 录录密度梯度试验密度梯度试验 试验结果支持试验结果支持半保留复制半保留复制构想。构想。含重氮含重氮N15-DNA细菌细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果第8页目目 录录按按半半保保留留复复制制方方式式，子子代代DNA与与亲亲代代DNA A碱碱基基序序列列一一致致，即即子子代代保保留留了了亲亲代代全全部部遗遗传传信信息，表达了遗传息，表达了遗传保守性保守性。半保留复制意义半保留复制意义遗传保守性，是物种稳定性分子基础，但遗传保守性，是物种稳定性分子基础，但不不是绝正确是绝正确。第9页目目 录录二、双向复制二、双向复制原核生物复制时，原核生物复制时，原核生物复制时，原核生物复制时，DNADNA从从从从起始点起始点起始点起始点(origin)(origin)向向向向两个方向解链，形成两个延伸方向相反复制叉，两个方向解链，形成两个延伸方向相反复制叉，两个方向解链，形成两个延伸方向相反复制叉，两个方向解链，形成两个延伸方向相反复制叉，称为称为称为称为双向复制双向复制双向复制双向复制。复制中放射自显影图象复制中放射自显影图象第10页目目 录录Cairns复制模型复制模型型复制型复制第11页目目 录录第12页目目 录录A.环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B.复制中两个复制叉复制中两个复制叉C.复制靠近终止点复制靠近终止点(termination,ter)oriterA B C第13页目目 录录53oriorioriori535533553复制子复制子3第14页目目 录录（2）起始点和方向）起始点和方向 原核生物和真核生物复制都是在原核生物和真核生物复制都是在DNA分子特定位分子特定位置起始，如大肠杆菌起始点有固定重复保守次序，可被置起始，如大肠杆菌起始点有固定重复保守次序，可被酶识别。酶识别。方向：大多是双向、对称复制方向：大多是双向、对称复制,也有单向或不对称。也有单向或不对称。速度：速度：原核生物复制叉移动快原核生物复制叉移动快(约约105bp/min);真核生物复制叉移动慢真核生物复制叉移动慢 (约约51025103bp/min)第15页目目 录录复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）第16页目目 录录三、复制半不连续性三、复制半不连续性3 5 3 5 解链方向解链方向35335领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)第17页目目 录录顺顺着着解解链链方方向向生生成成子子链链，复复制制是是连连续续进进行行，这这股股链称为链称为领头链领头链(前导链）前导链）。另另一一股股链链因因为为复复制制方方向向与与解解链链方方向向相相反反，不不能能顺顺着着解解链链方方向向连连续续延延长长，这这股股不不连连续续复复制制链链称称为为随随从从链链（后后随随链链、滞滞后后链链）。复复制制中中不不连连续续片片段段称称为为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。领领头头链链连连续续复复制制而而随随从从链链不不连连续续复复制制，就就是是复复制制半不连续性半不连续性。第18页目目 录录参加参加DNA复制物质复制物质 底物底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶聚合酶(polymerase):依赖依赖DNADNA聚合酶，简写聚合酶，简写 为为 DNA-pol模板模板(template):解开成单链解开成单链DNA母链母链引物引物(primer):提供提供3-OH末端使末端使dNTP能够依次聚合能够依次聚合 其它酶和蛋白质因子其它酶和蛋白质因子第19页一、复制化学反应一、复制化学反应 (dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi 目目 录录第20页目目 录录聚合反应特点聚合反应特点 除了底物和酶外，除了底物和酶外，除了底物和酶外，除了底物和酶外，DNA DNA 新链生成需新链生成需新链生成需新链生成需引引引引物物物物和和和和模板模板模板模板；新链延长只可沿新链延长只可沿新链延长只可沿新链延长只可沿5 5 3 3 方向进行方向进行方向进行方向进行 。第21页目目 录录二、二、DNA聚合酶聚合酶全称：全称：依赖依赖DNADNA聚合酶聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：简称：DNA-pol活性：活性：1.53 聚合酶活性聚合酶活性2.核酸外切酶活性核酸外切酶活性第22页目目 录录第23页5 A G C T T C A G G A T A 3|3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 35外切酶活性外切酶活性 53 外切酶活性外切酶活性?能切除突变能切除突变 DNA片段。片段。能识别错配碱基对，并将其水解。能识别错配碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性核酸外切酶活性 目目 录录第24页目目 录录第25页目目 录录第26页目目 录录第27页目目 录录第28页目目 录录第29页目目 录录第30页目目 录录功效：53聚合酶活性；酶与模板结合后构象改变，识别碱基，正 确配对后才发挥聚合作用 3 5外切酶活性；主要是对新生DNA链进行校对，预防“错配”53外切酶活性。主要是对DNA损伤修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其空隙填补 可见，DNA pol是1个多功效酶第31页目目 录录323个氨基酸个氨基酸小片段小片段53核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 35核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是试验室合成片段是试验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中惯用工具酶。分子生物学研究中惯用工具酶。第32页目目 录录功效功效是原核生物复制延长中真正起催化作用酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用酶。DNA-pol (250kD)第33页目目 录录第34页目目 录录亚基含有亚基含有53方向合成方向合成DNA催化活性催化活性亚基含有亚基含有35外切酶活性，起校对功效，外切酶活性，起校对功效，可提升聚合酶可提升聚合酶复制复制DNA保真性保真性 亚基可能亚基可能起组建作用起组建作用亚基如同夹子，亚基如同夹子，功效是识别引物、夹住功效是识别引物、夹住DNA 分子向前滑动分子向前滑动 亚基亚基起着促使关键酶二聚化作用起着促使关键酶二聚化作用其余亚基组成其余亚基组成 -复合物，复合物，主要功效是帮助主要功效是帮助 亚基夹住亚基夹住DNA（也称夹子装置器），并有（也称夹子装置器），并有 增强关键酶活性作用增强关键酶活性作用第35页目目 录录（二）真核生物（二）真核生物DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链主要酶，有解螺旋酶活性。参加低保真度复制参加低保真度复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口作用。口作用。在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 第36页目目 录录第37页目目 录录（一）解螺旋酶、引物酶和单链（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白结合蛋白第38页目目 录录解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用ATP供能，作用于氢键，使供能，作用于氢键，使DNA双链双链解开成为两条单链解开成为两条单链引物酶引物酶(primase)复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA引物酶引物酶单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单在复制中维持模板处于单链状态并保护单链完整链完整 第39页目目 录录拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶分分 类类第40页目目 录录第41页目目 录录第42页目目 录录第43页目目 录录第44页目目 录录第45页目目 录录五、五、DNA连接酶连接酶连连接接DNA链链3-OH末末端端和和相相邻邻DNA链链5-P末末端端，使使二二者者生生成成磷磷酸酸二二酯酯键键，从从而而把把两两段段相相邻邻DNA链链连连接接成成一一条条完完整整链链。以以N（大大肠杆菌）或（真核细胞）为能源。肠杆菌）或（真核细胞）为能源。DNA连接酶连接酶(DNA ligase)作用方式作用方式第46页HO5335DNA连接酶连接酶ATPADP5353目目 录录第47页目目 录录第48页目目 录录DNA连连接接酶酶在在复复制制中中起起最最终终接接合合缺缺口口作作用。用。在在DNA修修复复、重重组组及及剪剪接接中中也也起起缝缝合合缺缺口作用。口作用。也是基因工程主要工具酶之一。也是基因工程主要工具酶之一。功效功效第49页目目 录录（一）复制起始（一）复制起始需要处理两个问题：需要处理两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2.合成引物，提供合成引物，提供3-OH末端。末端。一、原核生物一、原核生物DNA生物合成生物合成 第50页目目 录录原核生物原核生物E.coli为例为例复制由起始点复制由起始点复制由起始点复制由起始点 oriC(origin)oriC(origin)开始双向复制开始双向复制开始双向复制开始双向复制E.coliE.coliE.coliE.coli复制起始点复制起始点复制起始点复制起始点oriCoriCoriCoriC（245bp245bp245bp245bpDNADNADNADNA组分）组分）组分）组分）序列分析有以下特点序列分析有以下特点序列分析有以下特点序列分析有以下特点 3 3 3 3组串连重复序列组串连重复序列组串连重复序列组串连重复序列(13bp(13bp(13bp(13bp），每个次序都由），每个次序都由），每个次序都由），每个次序都由GATCGATCGATCGATC开始开始开始开始 2 2 2 2组反向重复序列组反向重复序列组反向重复序列组反向重复序列(9bp)(9bp)(9bp)(9bp)4 4 4 4个个个个dnaAdnaAdnaAdnaA蛋白结合部位蛋白结合部位蛋白结合部位蛋白结合部位第51页目目 录录1 1、拓扑异构酶解开超螺旋。、拓扑异构酶解开超螺旋。2 2、Dna ADna A蛋白识别并在蛋白识别并在ATPATP存在存在下结合于四个下结合于四个9bp9bp重复序列。重复序列。3 3、在类组蛋白（、在类组蛋白（HUHU、ATPATP参加下参加下,Dan ADan A蛋白变性蛋白变性1313个个bpbp重复序列重复序列,形成开链复合物。形成开链复合物。4 4、Dna BDna B借助于水解借助于水解ATPATP产生能产生能量在量在Dna CDna C帮助下沿帮助下沿5 5 3 3 方向移动，解开方向移动，解开DNADNA双链，形成双链，形成前引发复合物。前引发复合物。5 5、单链结合蛋白结合于单链。、单链结合蛋白结合于单链。6 6、引物合成酶（、引物合成酶（Dna GDna G蛋白）开蛋白）开始合成始合成RNARNA引物。引物。第52页目目 录录第53页目目 录录第54页目目 录录 Dna A Dna B、Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 引发体和引物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域复合结构称为引发体。复制起始区域复合结构称为引发体。第55页目目 录录3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成短链引物是由引物酶催化合成短链RNA分子。分子。引物引物3 HO5引物引物酶酶第56页目目 录录第57页目目 录录 DNADNA复复复复制制制制调调调调控控控控是是是是在在在在起起起起始始始始阶阶阶阶段段段段进进进进行行行行，一一一一旦旦旦旦复复复复制制制制起起起起始始始始，它它它它就就就就会会会会继继继继续续续续下下下下去去去去直直直直到到到到整整整整个个个个复复复复制制制制子子子子完完完完成成成成复制。复制。复制。复制。复复复复制制制制起起起起点点点点是是是是以以以以一一一一条条条条链链链链为为为为模模模模板板板板起起起起始始始始DNADNA合合合合成成成成一一一一段段段段序序序序列列列列。有有有有时时时时，两两两两条条条条链链链链复复复复制制制制起起起起点点点点并并并并不不不不在在在在同同同同一点上（不对称复制，如一点上（不对称复制，如一点上（不对称复制，如一点上（不对称复制，如DD环复制）。环复制）。环复制）。环复制）。在在在在一一一一个个个个完完完完整整整整细细细细胞胞胞胞周周周周期期期期中中中中，每每每每一一一一个个个个复复复复制制制制起点只使用一次，完成一次复制过程。起点只使用一次，完成一次复制过程。起点只使用一次，完成一次复制过程。起点只使用一次，完成一次复制过程。多数生物复制起点，都是富含多数生物复制起点，都是富含多数生物复制起点，都是富含多数生物复制起点，都是富含A.TA.T。第58页目目 录录（二）复制延长（二）复制延长复复制制延延长长指指在在DNA-pol催催化化下下，dNTP以以dNMP方方式式逐逐一一加加入入引引物物或或延延长长中中子子链链上上，其其化化学本质是磷酸二酯键不停生成。学本质是磷酸二酯键不停生成。第59页目目 录录 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目目 录录第60页领头链合成领头链合成目目 录录第61页随从链合成随从链合成目目 录录第62页目目 录录第63页目目 录录第64页目目 录录第65页目目 录录第66页目目 录录第67页目目 录录原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制复制片，双向复制复制片段在复制终止点段在复制终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）复制终止（三）复制终止第68页目目 录录 细菌复制终止区含有多个约细菌复制终止区含有多个约22bp终止子终止子(terminator)位点，位点，E.coli 有有7个终止子位点。个终止子位点。第69页目目 录录 新合成两条染新合成两条染色体色体DNADNA分子相互连分子相互连在一起，被拓扑异在一起，被拓扑异构酶构酶IVIV分离分离第70页目目 录录DNA复制分子机制基本特点n n复制结果是半保留复制，复制过程是半不连续复制。n n复制以复制单位进行，起始于特定位点（复制起点）。n n复制能够是单向，也能够是双向，后者更为常见。n n复制时，DNA两条链都从5端向3端延伸。第71页目目 录录n n前导链是连续合成，而后续链是不连续合成。n n DNA合成始于RNA引物合成，所以前导链只有一次RNA合成，滞后链冈崎片断每个都有RNA引物合成。RNA引物随后由DNA片段替换，相邻DNA片段连接形成一条完整DNA链。n nDNA聚合酶校对功能和细胞错误修复功能维持DNA分子准确性和忠实性。第72页目目 录录哺乳动物细哺乳动物细胞周期胞周期DNA合成期合成期G1G2SM二、真核生物二、真核生物DNA生物合成生物合成 细细细细胞胞胞胞能能能能否否否否分分分分裂裂裂裂，决决决决定定定定于于于于进进进进入入入入S S期期期期及及及及MM期期期期这这这这两两两两个个个个关关关关键键键键点点点点。G1SG1S及及及及G2MG2M调调调调整整整整，与与与与蛋蛋蛋蛋白白白白激激激激酶酶酶酶活活活活性性性性相关。相关。相关。相关。蛋蛋蛋蛋白白白白激激激激酶酶酶酶经经经经过过过过磷磷磷磷酸酸酸酸化化化化激激激激活活活活或或或或抑抑抑抑制制制制各各各各种种种种复复复复制制制制因因因因子子子子而而而而实施调控作用。实施调控作用。实施调控作用。实施调控作用。第73页目目 录录 真真真真核核核核生生生生物物物物每每每每个个个个染染染染色色色色体体体体有有有有多多多多个个个个起起起起始始始始点点点点，是是是是多多多多复复复复制制制制子子子子复复复复制制制制。复复复复制制制制有有有有时时时时序序序序性性性性，即即即即复复复复制制制制子子子子以以以以分分分分组组组组方方方方式式式式激激激激活活活活而不是同时起动。而不是同时起动。而不是同时起动。而不是同时起动。复复复复制制制制起起起起始始始始需需需需要要要要DNA-polDNA-pol（引引引引物物物物酶酶酶酶活活活活性性性性）和和和和polpol（解解解解螺螺螺螺旋旋旋旋酶酶酶酶活活活活性性性性）参参参参加加加加。还还还还需需需需拓拓拓拓扑扑扑扑酶酶酶酶和和和和复复复复制制制制因因因因子子子子(replication factor,RF)(replication factor,RF)。增增增增殖殖殖殖细细细细胞胞胞胞核核核核抗抗抗抗原原原原(proliferation(proliferation cell cell nuclear nuclear antigen,antigen,PCNA)PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。在复制起始和延长中起关键作用。在复制起始和延长中起关键作用。在复制起始和延长中起关键作用。（一）复制起始（一）复制起始第74页目目 录录3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体（二）复制延长（二）复制延长第75页目目 录录染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停顿。呈线状，复制在末端停顿。复制中岡崎片段连接，复制子之间连接。复制中岡崎片段连接，复制子之间连接。染色体两端染色体两端DNA子链上最终复制子链上最终复制RNA引物，去引物，去除后留下空隙。除后留下空隙。（三）复制终止（三）复制终止第76页5 3 3 5 5 3 3 5+5 3 3 3 3 5 5 目目 录录第77页目目 录录诺贝尔生理学/医学奖：端粒和端粒酶怎样保护染色体第78页目目 录录端粒端粒(telomere)指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端结构。分子末端结构。功效功效 维持染色体稳定性维持染色体稳定性 维持维持DNA复制完整性复制完整性结构特点结构特点 由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质组成。序列和蛋白质组成。末端末端DNA序列是屡次重复富含序列是屡次重复富含G、C碱基短碱基短 序列。序列。TTTTGGGGTTTTGGGG第79页目目 录录端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT)组成组成第80页目目 录录端粒酶爬行模型（动画演示）端粒酶爬行模型（动画演示）第81页目目 录录第82页目目 录录真核生物真核生物DNADNA复制复制特点特点4 4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复 制；而在快速生长原核生物染色体制；而在快速生长原核生物染色体DNADNA复制中，起点可复制中，起点可 以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采取更多以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采取更多 复制起点。复制起点。1 1、真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复制序列、真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复制序列 （ARSARS）或复制基因）或复制基因(replicator);(replicator);多复制眼，呈双向复多复制眼，呈双向复 制，多复制子。制，多复制子。2 2、冈崎片段长约、冈崎片段长约200bp200bp。3 3、真核生物、真核生物DNADNA复制速度比原核慢，速度为复制速度比原核慢，速度为10001000 3000bp/min(3000bp/min(仅为原核生物仅为原核生物1/201/201/501/50）。）。第83页目目 录录5 5、真核生物有、真核生物有各种各种DNADNA聚合酶聚合酶,DNA,DNA聚合酶聚合酶（）是真正复）是真正复制酶，在制酶，在PCNAPCNA存在下有连续合成能力。存在下有连续合成能力。PCNAPCNA称为称为增殖细胞核增殖细胞核抗原抗原，相当于大肠杆菌，相当于大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶-夹子，夹子，RFCRFC蛋白相当于蛋白相当于夹子装配器。夹子装配器。6 6、真核生物线性染色体两端有真核生物线性染色体两端有端粒结构端粒结构，它是由许多成串重，它是由许多成串重短复序列组成，端粒功效是稳定染色体末段结构，预防染色体短复序列组成，端粒功效是稳定染色体末段结构，预防染色体间末端连接，并可赔偿滞后链间末端连接，并可赔偿滞后链5 5-末段在消除末段在消除RNARNA引物后造成引物后造成空缺，使染色体空缺，使染色体保持保持一定长度一定长度。端粒酶端粒酶是含一段是含一段RNARNA逆转录酶逆转录酶.7 7、RPARPA：真核生物单链结合蛋白；：真核生物单链结合蛋白；RNaseHRNaseH1 1和和MF-1MF-1切除切除RNARNA引物，引物，DNADNA聚合酶聚合酶填补缺口。填补缺口。第84页目目 录录n n最少依赖三种机制最少依赖三种机制最少依赖三种机制最少依赖三种机制n n1 1 1 1、恪守严格碱基配对规律、恪守严格碱基配对规律、恪守严格碱基配对规律、恪守严格碱基配对规律n n2 2 2 2、聚合酶在复制延长中对碱基选择功效（按模板要求选、聚合酶在复制延长中对碱基选择功效（按模板要求选、聚合酶在复制延长中对碱基选择功效（按模板要求选、聚合酶在复制延长中对碱基选择功效（按模板要求选择底物）择底物）择底物）择底物）n n3 3 3 3、复制犯错时有即时校读功效、复制犯错时有即时校读功效、复制犯错时有即时校读功效、复制犯错时有即时校读功效复制忠实性确保复制忠实性确保第85页目目 录录核酸生物合成核酸生物合成三、DNA复制调控 n n原核生物DNA甲基化以及与细胞质膜相互作用能够影响复制起始时间。n n酶：Dam甲基化酶（腺嘌呤甲基化酶）n n位点：GATC中腺嘌呤N6位 n n方式：游离oriC第86页目目 录录核酸生物合成核酸生物合成n n复制时间与染色质结构、DNA甲基化以及转录活性相关。通常活性区先复制，异染色质区晚复制。n n复制许可因子（replication licensing factor）所控制.该因子为复制起始所必需，但一旦复制起始后它即被灭活或者降解。因为该因子不能经过核膜，只能经过有丝分裂在重建核结构时才能进入核内并作用于染色体复制起点，这使其仅在有丝分裂后期才能与复制起点相互作用。真核生物复制起始是受各种因子调控，这些因子磷酸化和去磷酸化直接影响着复制起始。第87页目目 录录逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase)逆转录逆转录(reverse transcription)逆转录逆转录酶酶一、逆转录病毒和逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶 第88页目目 录录逆转录病毒细胞内逆转录现象逆转录病毒细胞内逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA第89页目目 录录逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目标基因主要方法之一，此法称标基因主要方法之一，此法称为为cDNA法。法。以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成与录合成与mRNA碱基序列互补碱基序列互补DNA链。链。试管内合成试管内合成cDNAcDNA complementary DNA 第90页目目 录录DNADNA损伤（损伤（DNA damageDNA damage）指一个或多个脱氧核苷酸组成、复制指一个或多个脱氧核苷酸组成、复制或表型功效异常改变，也称或表型功效异常改变，也称DNADNA损伤，又称损伤，又称突变（突变（mutationmutation）突变结果引发遗传信息突变结果引发遗传信息改变。改变。DNA突变突变(损伤损伤)大多数是自发，是大多数是自发，是进化与分化基础。进化与分化基础。原因原因原因原因：自发突变：自发突变：自发突变：自发突变 诱发突变诱发突变诱发突变诱发突变第91页目目 录录引发突变原因引发突变原因物理原因物理原因 紫外线紫外线(ultra violet,UV)、各种辐射、各种辐射 UV第92页化学原因化学原因目目 录录第93页目目 录录突变分子改变类型突变分子改变类型错配错配(mismatch)缺失缺失(deletion)插入插入(insertion)重排重排(rearrangement)框移框移(frame-shift)第94页目目 录录DNA分子上碱基错配称分子上碱基错配称点突变点突变(point mutation)。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.转换转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。或嘧啶变嘌呤。2.颠换颠换（一）错配（一）错配第95页目目 录录镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb(HbA)亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因第96页目目 录录（二）缺失（二）缺失、插入插入和框移和框移缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上大分子上消失。消失。插入：插入：原来没有一个碱基或一段核苷酸链插入到原来没有一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。大分子中间。框移突变框移突变是指三联体密码阅读方式改变，造成是指三联体密码阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列次序发生改变。蛋白质氨基酸排列次序发生改变。缺失或插入都可造成缺失或插入都可造成框移突变框移突变。第97页目目 录录谷谷 酪酪 蛋蛋 丝丝5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 缬缬 组组 缬缬正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失C缺失引发框移突变缺失引发框移突变第98页目目 录录-第99页目目 录录（三）重排（三）重排DNA分子内较大片段交换，称为重分子内较大片段交换，称为重组或重排。组或重排。第100页目目 录录由基因重排引发两种地中海贫血基因型由基因重排引发两种地中海贫血基因型第101页目目 录录DNA损伤修复损伤修复修复修复(repairing)是对已发生分子改变赔偿办法，使其回是对已发生分子改变赔偿办法，使其回复为原有天然状态。复为原有天然状态。光修复光修复(light repairing)切除修复切除修复(excision repairing)重组修复重组修复(recombination repairing)SOS修复修复 修复主要类型修复主要类型第102页目目 录录第103页目目 录录（一）光修复（一）光修复光修复酶光修复酶(photolyase)UV第104页UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶OHP （二）切除修复（二）切除修复是细胞内最主要和是细胞内最主要和有效修复机制，主要由有效修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。和连接酶完成。DNA连接酶连接酶ATPE.coli切除修切除修复机制复机制目目 录录第105页目目 录录第106页目目 录录第107页目目 录录第108页目目 录录第109页目目 录录（三）重组修复（三）重组修复第110页目目 录录（四）（四）SOS修复修复当当DNA损损伤伤广广泛泛难难以以继继续续复复制制时时，由由此此而而诱诱发出一系列复杂反应。发出一系列复杂反应。在在E.coli，各各种种与与修修复复相相关关基基因因，组组成成一一个个称称为为调整子调整子(regulon)网络式调控系统。网络式调控系统。这这种种修修复复特特异异性性低低，对对碱碱基基识识别别、选选择择能能力力差差。经经过过SOS修修复复，复复制制如如能能继继续续，细细胞胞是是可可存存活活。然然而而DNA保保留留错错误误较较多多，造造成成较较广广泛泛、长长久久突变。突变。第111页目目 录录第112页目目 录录第113页目目 录录第114页目目 录录第115页目目 录录第116页目目 录录第117页目目 录录第118页目目 录录第119页目目 录录第120页目目 录录第121页目目 录录第122页目目 录录第123页目目 录录第124页目目 录录第125页目目 录录酵母单杂交技术是一个研究蛋白质和特定酵母单杂交技术是一个研究蛋白质和特定DNADNA序列相互作用技术方法序列相互作用技术方法依据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表示原理，克隆与靶元件特异结合转录因子基因(cDNA)有效方法。许多真核生物转录激活子由物理和功效上独立DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD)组成，所以可构建各种基因与AD融合表示载体，在酵母中表示为融合蛋白时，依据报道基因表示情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域蛋白。第126页目目 录录第127页目目 录录第128页目目 录录第129页目目 录录第130页目目 录录第131页目目 录录第132页目目 录录三磷酸腺苷双磷酸酶三磷酸腺苷双磷酸酶ATPATP硫酸化酶硫酸化酶萤光素酶萤光素酶第133页目目 录录第134页目目 录录荧光标识荧光标识dNTP,3dNTP,3羟羟基带有可基带有可被化学切被化学切割基团割基团第135页目目 录录第136页目目 录录第137页目目 录录第138页