人卫版DNA的生物合成省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

目录目录生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学第1页目录目录第十四章第十四章DNA生物合成生物合成DNA Biosynthesis(Replication)第2页目录目录复制复制复制复制(replication)(replication)是以是以是以是以DNADNA为模板为模板为模板为模板DNADNA合合合合成，是基因组复制过程。在这个过程中，亲代成，是基因组复制过程。在这个过程中，亲代成，是基因组复制过程。在这个过程中，亲代成，是基因组复制过程。在这个过程中，亲代DNADNA作为合成模板，按照碱基配对标准合成作为合成模板，按照碱基配对标准合成作为合成模板，按照碱基配对标准合成作为合成模板，按照碱基配对标准合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应。反应。反应。反应。复制复制复制复制亲代亲代亲代亲代DNADNA子代子代子代子代DNADNA第3页目录目录n n本章主要内容：本章主要内容：本章主要内容：本章主要内容：n DNA DNA DNA DNA复制基本特征复制基本特征复制基本特征复制基本特征n DNADNA复制酶学和拓扑学改变复制酶学和拓扑学改变复制酶学和拓扑学改变复制酶学和拓扑学改变n 原核生物原核生物原核生物原核生物DNADNADNADNA复制过程复制过程复制过程复制过程n真核生物真核生物真核生物真核生物DNADNADNADNA生物合成过程生物合成过程生物合成过程生物合成过程n 逆转录和其它复制方式逆转录和其它复制方式逆转录和其它复制方式逆转录和其它复制方式 第4页DNA复制基本特征复制基本特征Basic Rules of DNA Replication第第 一一 节节第5页目录目录半保留复制半保留复制半保留复制半保留复制(semi-conservative replication)(semi-conservative replication)双向复制双向复制双向复制双向复制(bidirectional replication)(bidirectional replication)半不连续复制半不连续复制半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication)(semi-discontinuous replication)n nDNADNA复制主要特征复制主要特征复制主要特征复制主要特征 第6页目录目录一、一、DNA以半保留方式进行复制以半保留方式进行复制 DNADNA生生生生物物物物合合合合成成成成时时时时，母母母母链链链链DNADNA解解解解开开开开为为为为两两两两股股股股单单单单链链链链，各各各各自自自自作作作作为为为为模模模模板板板板(template)(template)按按按按碱碱碱碱基基基基配配配配对对对对规规规规律律律律，合合合合成成成成与与与与模模模模板板板板互互互互补补补补子子子子链链链链。子子子子代代代代细细细细胞胞胞胞DNADNA，一一一一股股股股单单单单链链链链从从从从亲亲亲亲代代代代完完完完整整整整地地地地接接接接收收收收过过过过来来来来，另另另另一一一一股股股股单单单单链链链链则则则则完完完完全全全全从从从从新新新新合合合合成成成成。两两两两个个个个子子子子细细细细胞胞胞胞DNADNA都都都都和和和和亲亲亲亲代代代代DNADNA碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列一一一一致致致致。这这这这种种种种复复复复制方式称为制方式称为制方式称为制方式称为半保留复制半保留复制半保留复制半保留复制。n n半保留复制半保留复制半保留复制半保留复制概念概念:第7页目录目录n n子链继承母链遗传信息几个可能方式子链继承母链遗传信息几个可能方式子链继承母链遗传信息几个可能方式子链继承母链遗传信息几个可能方式:全保留式全保留式全保留式全保留式 半保留式半保留式半保留式半保留式 混合式混合式混合式混合式 第8页n n密度梯度试验密度梯度试验密度梯度试验密度梯度试验:试验结果支持试验结果支持试验结果支持试验结果支持半保留复制半保留复制半保留复制半保留复制构想。构想。构想。构想。含含含含1515N-DNAN-DNA细菌细菌细菌细菌培养于普培养于普培养于普培养于普通培养液通培养液通培养液通培养液 第一代第一代第一代第一代继续培养于继续培养于继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液普通培养液普通培养液 第二代第二代第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果梯度离心结果梯度离心结果第9页目录目录按按按按半半半半保保保保留留留留复复复复制制制制方方方方式式式式，子子子子代代代代DNADNA与与与与亲亲亲亲代代代代DNDNA A A A碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列一一一一致致致致，即即即即子子子子代代代代保保保保留留留留了了了了亲亲亲亲代代代代全全全全部部部部遗遗遗遗传传传传信信信信息，表达了遗传息，表达了遗传息，表达了遗传息，表达了遗传保守性保守性保守性保守性。n n半保留复制意义半保留复制意义半保留复制意义半保留复制意义:遗传保守性，是物种稳定性分子基础，但遗传保守性，是物种稳定性分子基础，但遗传保守性，是物种稳定性分子基础，但遗传保守性，是物种稳定性分子基础，但不不不不是绝正确是绝正确是绝正确是绝正确。第10页目录目录A AGGGGT TA AC CT TGGC CC CA AC CT TGGGGT TC CC CA AT TGGA AC CGGGGT TGGA AC CC CC CC CA AC CT TGGGGGGGGT TGGA AC CC CA AGGGGT TA AC CT TGGT TC CC CA AT TGGA AC CT TC CC CA AT TGGA AC CA AGGGGT TA AC CT TGGA AGGGGT TA AC CT TGGC CC CA AC CT TGGGGT TC CC CA AT TGGA AC CGGGGT TGGA AC CC CA AGGGGT TA AC CT TGGC CC CA AC CT TGGGGT TC CC CA AT TGGA AC CGGGGT TGGA AC CC C+母链母链母链母链DNADNA复制过程中形成复制过程中形成复制过程中形成复制过程中形成复制叉复制叉复制叉复制叉子代子代子代子代DNADNA第11页目录目录原原原原核核核核生生生生物物物物基基基基因因因因组组组组是是是是环环环环状状状状DNADNA，只只只只有有有有一一一一个个个个复复复复制制制制起起起起点点点点（originorigin）。复复复复制制制制从从从从起起起起点点点点开开开开始始始始，向向向向两两两两个个个个方方方方向向向向进行解链，进行是单点起始进行解链，进行是单点起始进行解链，进行是单点起始进行解链，进行是单点起始双向复制双向复制双向复制双向复制。二、二、DNA复制从起点向两个方向延伸复制从起点向两个方向延伸复制中放射自显影图象复制中放射自显影图象复制中放射自显影图象复制中放射自显影图象第12页A.A.环状双链环状双链环状双链环状双链DNADNA及复制起始点及复制起始点及复制起始点及复制起始点B.B.复制中两个复制叉复制中两个复制叉复制中两个复制叉复制中两个复制叉C.C.复制靠近终止点复制靠近终止点复制靠近终止点复制靠近终止点(termination,ter)(termination,ter)orioriterterA B CA B C第13页目录目录真真真真核核核核生生生生物物物物每每每每个个个个染染染染色色色色体体体体有有有有多多多多个个个个起起起起始始始始点点点点，是是是是多多多多复复复复制制制制子子子子复复复复制制制制。习习习习惯惯惯惯上上上上把把把把两两两两个个个个相相相相邻邻邻邻起起起起始始始始点点点点之之之之间间间间距距距距离离离离定定定定为为为为一一一一个个个个复复复复制制制制子子子子(replicon)(replicon)。复复复复制制制制子子子子是是是是独独独独立立立立完成复制功效单位。完成复制功效单位。完成复制功效单位。完成复制功效单位。5 5 3 3 oriorioriorioriorioriori5 5 3 3 第14页5 5 3 3 oriorioriorioriorioriori5 5 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 复制复制复制复制3 3 第15页目录目录三、三、DNA复制反应呈半不连续特征复制反应呈半不连续特征3 3 5 5 3 3 5 5 解链方向解链方向解链方向解链方向335 5 3 3 3355领头链领头链领头链领头链(leading strand)(leading strand)后随链后随链后随链后随链(lagging strand)(lagging strand)第16页目录目录顺顺着着解解链链方方向向生生成成子子链链，复复制制是是连连续续进进行行，这这股链称为股链称为领头链领头链(leading strand)。另另一一股股链链因因为为复复制制方方向向与与解解链链方方向向相相反反，不不能能顺顺着着解解链链方方向向连连续续延延长长，这这股股不不连连续续复复制制链链称称为为后后随随链链(lagging strand)。复复制制中中不不连连续续片片段段称为称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。领领头头链链连连续续复复制制而而随随从从链链不不连连续续复复制制，就就是是复复制半不连续性。制半不连续性。第17页目录目录DNA复制酶学和拓扑学改变复制酶学和拓扑学改变第第 二二 节节The Enzymology and Topology of DNA Replication第18页目录目录n n参加参加参加参加DNADNA复制物质复制物质复制物质复制物质:n底物底物底物底物(substratesubstrate):d dATP,dGTP,dCTP,dTTPATP,dGTP,dCTP,dTTP；n聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶(polymerase):(polymerase):依依依依赖赖赖赖DNADNADNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶，简简简简写为写为写为写为 DNA-polDNA-pol；n模板模板模板模板(template):(template):解开成单链解开成单链解开成单链解开成单链DNADNA母链；母链；母链；母链；n引引引引物物物物(primer):(primer):提提提提供供供供3 3 -OH-OH末末末末端端端端使使使使dNTPdNTP能能能能够够够够依依依依次聚合；次聚合；次聚合；次聚合；n其它其它其它其它酶和蛋白质因子酶和蛋白质因子酶和蛋白质因子酶和蛋白质因子。第19页目录目录(dNMP)(dNMP)n n +dNTP (dNMP)dNTP (dNMP)n+1n+1 +PPi PPiRNARNA引物引物引物引物RNARNA引物引物引物引物子代子代子代子代DNADNA第20页目录目录n n聚合反应特点聚合反应特点聚合反应特点聚合反应特点:DNA DNA 新链生成需新链生成需新链生成需新链生成需RNARNA引物引物引物引物和和和和模板模板模板模板；新链延长只可沿新链延长只可沿新链延长只可沿新链延长只可沿5 5 3 3 方向进行。方向进行。方向进行。方向进行。第21页目录目录一、一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间聚合聚合酶催化脱氧核苷酸间聚合全称：全称：全称：全称：依赖依赖依赖依赖DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 (DNA-dependent(DNA-dependent DNA polymerase)DNA polymerase)简称：简称：简称：简称：DNA-polDNA-poln活性：活性：活性：活性：1 1.5 53 3 聚合活性聚合活性聚合活性聚合活性2.2.核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性第22页5 5 A G C T T C A G G A T A G C T T C A G G A T A A 3 3|3 T C G A A G T C C T A G C G A C 53 T C G A A G T C C T A G C G A C 5n3 3 5 5 外切酶活性外切酶活性外切酶活性外切酶活性:n5 5 3 3 外切酶活性外切酶活性外切酶活性外切酶活性:?能切除突变能切除突变能切除突变能切除突变 DNADNA片段。片段。片段。片段。能识别错配碱基对，并将其水解。能识别错配碱基对，并将其水解。能识别错配碱基对，并将其水解。能识别错配碱基对，并将其水解。n n核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性:第23页目录目录（一）原核生物有（一）原核生物有3种种DNA聚合酶聚合酶nDNA-pol DNA-pol nDNA-pol DNA-pol nDNA-pol DNA-pol 第24页目录目录原核生物原核生物原核生物原核生物DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶第25页目录目录n n个关键酶个关键酶个关键酶个关键酶n n1 1个个个个 -复合物（复合物（复合物（复合物（、6 6种种种种亚基）亚基）亚基）亚基）n n1 1对对对对 -亚基（可滑动亚基（可滑动亚基（可滑动亚基（可滑动DNADNA夹子）夹子）夹子）夹子）DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶全酶结构全酶结构全酶结构全酶结构全酶结构包含：全酶结构包含：全酶结构包含：全酶结构包含：第26页目录目录 亚基亚基亚基亚基（130 000130 000）主要功效是合成）主要功效是合成）主要功效是合成）主要功效是合成DNADNA 亚基亚基亚基亚基含有含有含有含有3 35 5 外切酶活性（复制保真外切酶活性（复制保真外切酶活性（复制保真外切酶活性（复制保真性所必需）性所必需）性所必需）性所必需）亚基可增强其活性亚基可增强其活性亚基可增强其活性亚基可增强其活性 亚基亚基亚基亚基可能起组装作用可能起组装作用可能起组装作用可能起组装作用关键酶由关键酶由关键酶由关键酶由 、和和和和 亚基组成：亚基组成：亚基组成：亚基组成：两侧两侧两侧两侧 亚基发挥夹稳亚基发挥夹稳亚基发挥夹稳亚基发挥夹稳DNADNADNADNA模板链，并使酶沿模板模板链，并使酶沿模板模板链，并使酶沿模板模板链，并使酶沿模板滑动作用滑动作用滑动作用滑动作用第27页目录目录2 2个个个个 -亚亚亚亚基基基基分分分分别别别别和和和和1 1个个个个关关关关键键键键酶酶酶酶相相相相互互互互作作作作用用用用，其其其其柔柔柔柔性性性性连连连连接接接接区区区区能能能能够够够够确确确确保保保保在在在在复复复复制制制制叉叉叉叉1 1个个个个全全全全酶酶酶酶分分分分子子子子2 2个个个个关关关关键键键键酶酶酶酶能能能能够够够够相相相相对对对对独独独独立立立立运运运运动动动动，分分分分别别别别负负负负责责责责合合合合成成成成前导链和后随链。前导链和后随链。前导链和后随链。前导链和后随链。功功功功效效效效：有有有有促促促促进进进进全全全全酶酶酶酶组组组组装装装装至至至至模模模模板板板板上上上上及及及及增增增增强强强强关关关关键键键键酶酶酶酶活性作用活性作用活性作用活性作用 -复合物由复合物由复合物由复合物由6 6种亚基组成：种亚基组成：种亚基组成：种亚基组成：、第28页目录目录n n功效：功效：功效：功效：nDNA-pol DNA-pol （109kD109kD）对复制中错误进行校读，对复制和修复中对复制中错误进行校读，对复制和修复中对复制中错误进行校读，对复制和修复中对复制中错误进行校读，对复制和修复中出现空隙进行填补。出现空隙进行填补。出现空隙进行填补。出现空隙进行填补。第29页目录目录323323个氨基酸个氨基酸个氨基酸个氨基酸小片段小片段小片段小片段5 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段大片段大片段/Klenow/Klenow 片段片段片段片段 604604个氨基酸个氨基酸个氨基酸个氨基酸DNADNA聚合酶活性聚合酶活性聚合酶活性聚合酶活性 5 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性N N 端端端端C C 端端端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol DNA-pol nKlenowKlenow片段是试验室合成片段是试验室合成片段是试验室合成片段是试验室合成DNADNA，进行，进行，进行，进行分子生物学研究中惯用工具酶。分子生物学研究中惯用工具酶。分子生物学研究中惯用工具酶。分子生物学研究中惯用工具酶。第30页目录目录nDNA-pol DNA-pol（120kD120kD）nDNA-pol IIDNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。nDNA-pol DNA-pol 对模板特异性不高，即使在已发生损对模板特异性不高，即使在已发生损对模板特异性不高，即使在已发生损对模板特异性不高，即使在已发生损伤伤伤伤DNADNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。所以认模板上，它也能催化核苷酸聚合。所以认模板上，它也能催化核苷酸聚合。所以认模板上，它也能催化核苷酸聚合。所以认为，它参加为，它参加为，它参加为，它参加DNADNA损伤应急状态修复。损伤应急状态修复。损伤应急状态修复。损伤应急状态修复。第31页目录目录（二）常见真核细胞（二）常见真核细胞DNA聚合酶有聚合酶有5种种DNA-pol DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链主要酶，有解螺旋酶活性。参加低保真度复制参加低保真度复制参加低保真度复制参加低保真度复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口作用。口作用。口作用。口作用。在线粒体在线粒体在线粒体在线粒体DNADNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-polDNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 第32页目录目录真核生物和原核生物真核生物和原核生物DNA聚合聚合酶酶比比较较 E.Coli真核真核细细胞胞 功效填补复制中DNA空隙，DNA修复和重组复制中校对，DNA修复 DNA修复修复 线线粒体粒体DNA合成合成 前前导链导链合成合成DnaG 引物引物酶酶 后随后随链链合成合成第33页目录目录真核生物真核生物真核生物真核生物DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶第34页目录目录二、二、DNA聚合酶碱基选择和校对功效聚合酶碱基选择和校对功效实现复制保真性实现复制保真性n复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代基本原理。准确传代基本原理。准确传代基本原理。准确传代基本原理。n另外还需酶学机制来确保复制保真性。另外还需酶学机制来确保复制保真性。另外还需酶学机制来确保复制保真性。另外还需酶学机制来确保复制保真性。第35页目录目录n恪守严格碱基配对规律；恪守严格碱基配对规律；恪守严格碱基配对规律；恪守严格碱基配对规律；n聚合酶在复制延长时对碱基选择功效；聚合酶在复制延长时对碱基选择功效；聚合酶在复制延长时对碱基选择功效；聚合酶在复制延长时对碱基选择功效；n复制犯错时有即时校对功效。复制犯错时有即时校对功效。复制犯错时有即时校对功效。复制犯错时有即时校对功效。n nDNADNA复制保真性最少要依赖三种机制：复制保真性最少要依赖三种机制：复制保真性最少要依赖三种机制：复制保真性最少要依赖三种机制：第36页目录目录（一）复制保真性依赖正确碱基选择（一）复制保真性依赖正确碱基选择利用利用利用利用“错配错配错配错配”试验发觉，试验发觉，试验发觉，试验发觉，DNA pol DNA pol DNA pol DNA pol 对核苷酸参对核苷酸参对核苷酸参对核苷酸参入（入（入（入（incorporationincorporationincorporationincorporation）含有选择功效。）含有选择功效。）含有选择功效。）含有选择功效。DNA pol DNA pol DNA pol DNA pol 对嘌呤不一样构型表现不一样亲和力，对嘌呤不一样构型表现不一样亲和力，对嘌呤不一样构型表现不一样亲和力，对嘌呤不一样构型表现不一样亲和力，所以实现其选择功效。所以实现其选择功效。所以实现其选择功效。所以实现其选择功效。第37页目录目录（二）聚合酶中核酸外切酶活性在复制中识别（二）聚合酶中核酸外切酶活性在复制中识别切除错配碱基并加以校正切除错配碱基并加以校正核核核核酸酸酸酸外外外外切切切切酶酶酶酶(exonuclease)(exonuclease)是是是是指指指指能能能能从从从从核核核核酸酸酸酸链链链链末末末末端端端端把把把把核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸依依依依次次次次水水水水解解解解出出出出来来来来酶酶酶酶，外外外外切切切切酶酶酶酶是是是是有有有有方方方方向性。向性。向性。向性。第38页目录目录A A：DNA-polDNA-pol外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配正确底物。掺入正确配正确底物。掺入正确配正确底物。掺入正确配正确底物。B B：碱基配对正确，：碱基配对正确，：碱基配对正确，：碱基配对正确，DNA-polDNA-pol不表现活性。不表现活性。不表现活性。不表现活性。DNA pol 校读功效校读功效第39页目录目录三、复制中解链伴有三、复制中解链伴有DNA 分子拓分子拓扑学改变扑学改变DNA分子碱基埋在双螺旋内部，只有把分子碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。第40页目录目录（一）各种酶参加（一）各种酶参加DNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态第41页目录目录E.Coli E.Coli 基因图基因图基因图基因图第42页目录目录n解螺旋酶解螺旋酶解螺旋酶解螺旋酶(helicase)helicase)利用利用利用利用ATPATP供能，作用于供能，作用于供能，作用于供能，作用于氢键，使氢键，使氢键，使氢键，使DNADNA双链解开成为两条单链。双链解开成为两条单链。双链解开成为两条单链。双链解开成为两条单链。n引物酶引物酶引物酶引物酶(primase)(primase)复制起始时催化生成复制起始时催化生成复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNARNA引物酶。引物酶。引物酶。引物酶。n单链单链单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding(single stranded DNA binding protein,SSB)protein,SSB)在复制中维持模板处于单链状在复制中维持模板处于单链状在复制中维持模板处于单链状在复制中维持模板处于单链状态并保护单链完整态并保护单链完整态并保护单链完整态并保护单链完整。第43页目录目录10108 8局部解链后局部解链后局部解链后局部解链后（二）（二）DNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态超螺旋状态n n复制过程正超螺旋形成：复制过程正超螺旋形成：复制过程正超螺旋形成：复制过程正超螺旋形成：第44页目录目录解链过程中正超螺旋形成解链过程中正超螺旋形成解链过程中正超螺旋形成解链过程中正超螺旋形成第45页目录目录n既能水解既能水解既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键。、又能连接磷酸二酯键。、又能连接磷酸二酯键。、又能连接磷酸二酯键。拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶n n拓扑异构酶分类：拓扑异构酶分类：拓扑异构酶分类：拓扑异构酶分类：n n拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶作用特点：第46页目录目录拓扑异拓扑异拓扑异拓扑异构酶构酶构酶构酶 切断切断切断切断DNADNA双链中双链中双链中双链中一股一股一股一股链，使链，使链，使链，使DNADNA解链旋转不致打结；适当初候封解链旋转不致打结；适当初候封解链旋转不致打结；适当初候封解链旋转不致打结；适当初候封闭切口，闭切口，闭切口，闭切口，DNADNA变为松弛状态变为松弛状态变为松弛状态变为松弛状态。反应反应反应反应不需不需不需不需ATPATP。拓扑异拓扑异拓扑异拓扑异构酶构酶构酶构酶切断切断切断切断DNADNA分子分子分子分子两股两股两股两股链，断端经过链，断端经过链，断端经过链，断端经过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用利用利用ATPATP供能，连接断端，供能，连接断端，供能，连接断端，供能，连接断端，DNADNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。n n作用机制：作用机制：作用机制：作用机制：第47页目录目录n n拓扑酶作用方式：拓扑酶作用方式：拓扑酶作用方式：拓扑酶作用方式：第48页目录目录四、四、DNA连接酶连接复制中产生单连接酶连接复制中产生单链缺口链缺口连连连连 接接接接 DNADNA链链链链 3 3 -OH-OH末末末末 端端端端 和和和和 相相相相 邻邻邻邻 DNADNA链链链链5 5 -P-P末末末末端端端端，使使使使二二二二者者者者生生生生成成成成磷磷磷磷酸酸酸酸二二二二酯酯酯酯键键键键，从从从从而而而而把把把把两两两两段相邻段相邻段相邻段相邻DNADNA链连接成一条完整链。链连接成一条完整链。链连接成一条完整链。链连接成一条完整链。n n DNA DNA连接酶连接酶连接酶连接酶(DNA ligase)(DNA ligase)作用方式：作用方式：作用方式：作用方式：第49页HOHO5 5 3 3 3 3 5 5 DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶ATPATPADPADP5 5 3 3 5 5 3 3 n nDNADNA连接酶作用：连接酶作用：连接酶作用：连接酶作用：第50页目录目录nDNADNA连连连连接接接接酶酶酶酶在在在在复复复复制制制制中中中中起起起起最最最最终终终终接接接接合合合合缺缺缺缺口口口口作作作作用。用。用。用。n在在在在DNADNA修修修修复复复复、重重重重组组组组及及及及剪剪剪剪接接接接中中中中也也也也起起起起缝缝缝缝合合合合缺缺缺缺口作用。口作用。口作用。口作用。n也是基因工程主要工具酶之一。也是基因工程主要工具酶之一。也是基因工程主要工具酶之一。也是基因工程主要工具酶之一。n n功效：功效：功效：功效：第51页目录目录提供核糖提供核糖3-OH提供提供5-P结果结果DNA聚合酶聚合酶引物或延长中新链游离游离dNTP去去PPi(dNTP)n+1连接酶连接酶复制中不连续两条单链不连续不连续连续链连续链拓扑酶拓扑酶切断、整理后两链改变拓扑状态改变拓扑状态DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成比较磷酸二酯键生成比较 第52页目录目录原核生物原核生物DNA复制过程复制过程The Process of DNA Replication in Prokaryotes第第 三三 节节第53页目录目录起始是复制中较为复杂步骤，在此过程中，起始是复制中较为复杂步骤，在此过程中，起始是复制中较为复杂步骤，在此过程中，起始是复制中较为复杂步骤，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成形成复制叉并合成形成复制叉并合成形成复制叉并合成RNARNARNARNA引物。引物。引物。引物。需要处理两个问题：需要处理两个问题：需要处理两个问题：需要处理两个问题：1 1.DNADNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2.2.形成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供3 3 -OH-OH末端。末端。末端。末端。一、一、复制起始复制起始第54页目录目录E.coliE.coli复制起始点复制起始点复制起始点复制起始点 oriCoriC GATTNTTTATTT GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TGTGGATTA-TTATACACA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTTGGATAA-TTATCCACATTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列反向重复序列反向重复序列5 5 3 3 5 5 3 3 （一）（一）（一）（一）DNADNA解链解链解链解链第55页目录目录原核生物复制起始部位及解链原核生物复制起始部位及解链原核生物复制起始部位及解链原核生物复制起始部位及解链 第56页目录目录第57页目录目录 Dna A Dna A Dna B Dna B、Dna CDna CDNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物引物引物酶酶酶酶SSBSSB3 3 5 5 3 3 5 5 （二）引物合成和引发体形成（二）引物合成和引发体形成（二）引物合成和引发体形成（二）引物合成和引发体形成含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaCDnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNADNA复制起始区域复合结构称为引发体。复制起始区域复合结构称为引发体。复制起始区域复合结构称为引发体。复制起始区域复合结构称为引发体。第58页目录目录3 3 5 5 3 3 5 5 引物是由引物酶催化合成短链引物是由引物酶催化合成短链引物是由引物酶催化合成短链引物是由引物酶催化合成短链RNARNA分子。分子。分子。分子。引物引物引物引物3 3 HOHO55引物引物引物引物酶酶酶酶第59页目录目录引发体和复制叉生成引发体和复制叉生成 第60页目录目录第61页目录目录二、二、DNA链延长链延长复复复复 制制制制 延延延延 长长长长 指指指指 在在在在 DNA-polDNA-pol催催催催 化化化化 下下下下，dNTPdNTP以以以以dNMPdNMP方方方方式式式式逐逐逐逐一一一一加加加加入入入入引引引引物物物物或或或或延延延延长长长长中中中中子子子子链链链链上上上上，其其其其化化化化学本质是磷酸二酯键不停生成。学本质是磷酸二酯键不停生成。学本质是磷酸二酯键不停生成。学本质是磷酸二酯键不停生成。第62页 5 5 5 5 3 3 3 35 5 5 5dATPdATPdGTPdGTPdTTPdTTPdCTPdCTPdTTPdTTPdGTPdGTPdATPdATPdCTPdCTPOH 3OH 33 3 3 3 DNA-polDNA-pol第63页目录目录n n领头链合成：领头链合成：领头链合成：领头链合成：领头链子链沿着领头链子链沿着5 5 33 方向能够连续地延长。方向能够连续地延长。第64页n n后随链合成后随链合成后随链合成后随链合成第65页目录目录 在复制叉同时合成前导链和后随链在复制叉同时合成前导链和后随链在复制叉同时合成前导链和后随链在复制叉同时合成前导链和后随链第66页复复复复制制制制过过过过程程程程简简简简图图图图第67页目录目录第68页目录目录n原核生物基因是环状原核生物基因是环状原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNADNA，双向复制复制片段在，双向复制复制片段在，双向复制复制片段在，双向复制复制片段在复制终止点复制终止点复制终止点复制终止点(ter)(ter)处汇合。处汇合。处汇合。处汇合。oriter E.coliE.coli82823232 ori terSV40SV4050500 0三、复制终止三、复制终止第69页目录目录5 5 5 5 5 5 RNARNA酶酶酶酶OHOHP P5 5 DNA-pol DNA-pol dNTPdNTP5 5 5 5 P PATPATP ADP+Pi ADP+Pi5 5 5 5 DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶n n 子链中子链中子链中子链中RNARNA引物被取代引物被取代引物被取代引物被取代第70页目录目录第71页目录目录第72页目录目录真核生物真核生物DNA生物合成生物合成过程过程The Process of DNA Biosynthesis in eukaryotes第第 四四 节节第73页目录目录n真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；前进速度慢等；前进速度慢等；前进速度慢等；nDNADNA复制从引发进入延伸阶段发生复制从引发进入延伸阶段发生复制从引发进入延伸阶段发生复制从引发进入延伸阶段发生DNADNA聚聚聚聚合酶合酶合酶合酶 /转换；转换；转换；转换；n切除冈崎片段切除冈崎片段切除冈崎片段切除冈崎片段RNARNA引物是核酸酶引物是核酸酶引物是核酸酶引物是核酸酶RNAse HRNAse H和和和和FEN1FEN1等。等。等。等。真核生物与原核生物真核生物与原核生物真核生物与原核生物真核生物与原核生物DNADNA复制差异：复制差异：复制差异：复制差异：第74页目录目录哺乳动物细哺乳动物细哺乳动物细哺乳动物细胞周期胞周期胞周期胞周期DNADNA合成期合成期合成期合成期G1 1G2 2SMM细细细细胞胞胞胞能能能能否否否否分分分分裂裂裂裂，决决决决定定定定于于于于进进进进入入入入S S期期期期及及及及MM期期期期这这这这两两两两个个个个关关关关键键键键点点点点。G1SG1S及及及及G2MG2M调调调调整整整整，与与与与蛋蛋蛋蛋白白白白激激激激酶酶酶酶活活活活性性性性相关。相关。相关。相关。蛋蛋蛋蛋白白白白激激激激酶酶酶酶经经经经过过过过磷磷磷磷酸酸酸酸化化化化激激激激活活活活或或或或抑抑抑抑制制制制各各各各种种种种复复复复制制制制因因因因子子子子而实施调控作用。而实施调控作用。而实施调控作用。而实施调控作用。第75页目录目录真真真真核核核核生生生生物物物物每每每每个个个个染染染染色色色色体体体体有有有有多多多多个个个个起起起起始始始始点点点点，是是是是多多多多复复复复制制制制子子子子复复复复制制制制。复复复复制制制制有有有有时时时时序序序序性性性性，即即即即复复复复制制制制子子子子以以以以分分分分组组组组方方方方式式式式激活而不是同时起动。激活而不是同时起动。激活而不是同时起动。激活而不是同时起动。复复复复制制制制起起起起始始始始需需需需要要要要DNA-pol DNA-pol （引引引引物物物物酶酶酶酶活活活活性性性性）和和和和pol pol （解解解解螺螺螺螺旋旋旋旋酶酶酶酶活活活活性性性性）参参参参加加加加。还还还还需需需需拓拓拓拓扑扑扑扑酶酶酶酶和和和和复复复复制制制制因因因因子子子子(replication factor,RF)(replication factor,RF)。一、真核生物复制起始与原核基本相