治伤活血胶囊质量标准研究.doc

治伤活血胶囊质量标准研究
关键词:治伤活血胶囊；当归;三七；冰片；丹参；骨碎补； TLC；HPLC
摘要：目的：建立治伤活血胶囊(当归；三七；冰片;丹参；骨碎补）的质量标准。方法：以冰片；丹参酮IIA为对照品，以当归；三七为对照药材进行薄层色谱鉴别，以阿魏酸为对照品，采用高效液相色谱方法进行含量测定。结果:阿魏酸平均回收率为99.8％，RSD为1。6%，薄层图谱斑点清晰，阴性对照无干扰。结论：结果准确，方法重复性好。
治伤活血胶囊由当归、三七、乳香（制）、冰片、土鳖虫、自然铜（煅)、丹参、骨碎补八味药经提取加工制成.具补血活血,调经止痛，润肠通便之功效，用于血虚萎黄,眩晕心悸，月经不调,经闭痛经，虚寒腹痛，肠燥便秘，风湿痹痛，跌打损伤,痈疽疮疡等症。为有效控制药品的质量，本文采用TLC法对当归；三七;冰片；丹参进行了定性鉴别，并采用了HPLC法对该方中当归主成分阿魏酸进行了定量控制。
1、仪器与试药
Agilent G1311A Quat Pump，G1314A VWD,G1379A DEGASSER,AT-330柱温箱，Thermo— C18(250mm×4。6mm,5um）色谱柱，硅胶G薄层板（自制）。冰片对照品（中国药品生物制品检定所提供，编号为110743-200504）。三七对照药材为阳性对照（中国药品生物制品检定所，批号:120941—200807），丹参酮IIA对照品为阳性对照（中国药品生物制品检定所，批号：110766—200417），当归对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：120927-200512）阿魏酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号:0773-9910）塞多利斯全自动电子天平，SG2200H超声波清洗器；色谱纯甲醇，其它试剂均为分析纯。
2、定性研究
2。1为方中冰片的薄层色谱鉴别.
取本品内容物1g，加石油醚（30—60℃)15ml，超声处理2-3分钟，滤过,滤液低温浓缩至约1ml，作为供试品溶液。另取冰片对照品，加石油醚（30—60℃)制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液.取缺冰片的阴性样品按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液.照薄层色谱法（附录VI B）试验，吸取上述三种溶液各5ul,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚（30-60℃）-醋酸乙酯（19：2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105摄氏度烘数分钟.供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照液色谱无干扰（图1）.
图1冰片的TLC图
1、冰片对照品 2、3、4、供试品溶液5、缺冰片阴性对照溶液
2．2当归的鉴别
取本品内容物6g，加乙醚40ml，超声处理10分钟，滤过，残渣备用,滤液挥去乙醚,残渣加乙醇2ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。另取当归对照药材1g,同法制成对照药材溶液。取缺当归的阴性样品液按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法（附录VI B）试验,吸取上述三种溶液各5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上,以正己烷—乙酸乙酯（9：1）为展开剂,展开，取出,晾干,置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主斑点。阴性对照液色谱无干扰(图2）。
图2当归的TLC图
1、当归对照药材2、3、4、供试品溶液 5、缺当归阴性对照溶液
2.3三七的鉴别
取【鉴别】（2.2）项下乙醚提取后的残渣，挥尽乙醚，加甲醇30ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次10ml，正丁醇液蒸干,残渣加甲醇2ml使溶解,作为供试品溶液。另取三七对照药材1g，加甲醇30ml同法制成对照药材溶液。取缺三七的阴性样品按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法（附录VI B）试验，吸取上述三种溶液各2ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇—醋酸乙酯—水（4：1：5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干,喷以10％硫酸乙醇溶液,在105℃烘数分钟。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，日光下显相同的主斑点;紫外光灯（365nm）下显相同颜色的荧光主斑点.阴性对照液色谱无干扰（图3）。
日光下 荧光下
图3三七的TLC图
1、三七对照药材 2、3、4、供试品溶液 5、缺三七阴性对照溶液
2。4丹参的鉴别
取本品内容物6g，加醋酸乙酯20ml，置水浴上加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品。另取丹参酮11A对照品,加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。取缺丹参的阴性样品按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(附录VI B）试验，吸取上述三种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上,以苯-醋酸乙酯（19:1）为展开剂，展开，取出，晾干.供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点。阴性对照液色谱无干扰(图4）。
图4丹参的TLC图
1、丹参酮IIA对照品 2、3、4、供试品溶液 5、缺丹参阴性对照溶液
3、定量研究
3。1色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—甲醇-1％醋酸溶液(1:1：5）为流动相;检测波长为313nm。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于2000.
3。2溶液的配制
对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中,加甲醇制成每1ml含20ug的溶液，即得.
供试品溶液的制备 取本品内容物约2.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加0。5%碳酸钠溶液20ml，超声处理（功率150W，频率20kHz）30分钟,提取液移至离心管中，离心(转速为每分钟3000转）10分钟,取上清液，置分液漏斗中，沉淀再用0.5％的碳酸钠溶液洗涤3次,每次10ml，洗液并入同一分液漏斗中，用2%氯化钠溶液饱和的乙醚洗涤3次，每次20ml，弃去乙醚液，水溶液用盐酸调节ph值至1－2，再用2%氯化钠溶液饱和的乙醚振摇提取4次（25ml，25ml,20ml，20ml），必要时离心消除乳化层，合并乙醚提取液，回收乙醚至干，残渣用甲醇溶解,转移至25ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（避光操作)。测定时用微孔滤膜（0。45μm）滤过，取20μl进样。
阴性对照溶液的制备 按处方取不含当归的其它药材制成阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制备，以上三种溶液按上述色谱条件进样，测定.结果阴性对照在阿魏酸峰相应的保留时间处无干扰。见图6.
图6—1阿魏酸对照品溶液及治伤活血胶囊供试品溶液HPLC图谱
阿魏酸对照品溶液HPLC图谱
治伤活血胶囊供试品溶液HPLC图谱
缺当归的阴性样品溶液HPLC图谱
3。3线性关系考察
精密称取阿魏酸对照品10。6mg,置50 ml量瓶中，加甲醇溶液使溶解，并稀释至刻度。摇匀(212ug/ml）,再分别精密吸取对照品母液适量,用甲醇溶液稀释成不同浓度的对照品溶液：10。6ug/ml、21.2ug/ml、42。4ug/ml、63。6ug/ml、84.8ug/ml.分别 精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各20ul，按正文中色谱条件分析，测定峰面积。以峰面积积分值为纵坐标，进样阿魏酸的量为横坐标绘制标准曲线(见阿魏酸对照品溶液标准曲线图），计算得回归方程：Y=5087215X+228190,R=0.9990。表明阿魏酸在0.212 ug~1。696ug范围内具有良好线性关系。具体数据及标准曲线见下表。
线性关系考察结果
阿魏酸浓度（ug/ml)
10。6
21。2
42。4
63。6
84。8
阿魏酸的量（ug）
0.212
0.424
0。848
1.272
1.696
峰面积
1434435。2
2356330。6
4452793。8
6494167.4
8797145
以峰面积积分值为纵坐标,阿魏酸的量为横坐标绘制标准曲线（见阿魏酸对照品溶液标准曲线图）：
阿魏酸对照品溶液标准曲线图
计算得回归方程：Y=5087215X+228190，R=0.9990。表明阿魏酸在0.212 ug～1。696ug 范围内具有良好线性关系。
3。4稳定性试验
取本品内容物约2.3g,研细，精密称定，按【含量测定】项下的方法制备供试品溶液,进样，测定，然后分别于第2小时、4小时、6小时、8小时分别进样，测定,对其稳定性进行考察.结果见下表.
稳定性试验结果
放置时间（h)
峰面积
RSD%
0
2
4
6
8
2210050。6
2209450.4
2202809.4
2149963.1
2173184.1
1。2
3.5精密度试验
精密吸取阿魏酸对照品溶液（21.2μg/ml）20μl，重复进样5次，测定峰面积，（结果见表4）,阿魏酸峰面积积分值的相对标准偏差小于2%，表明此法精密度良好。
表4 精密度试验结果
实验次数
峰面积
RSD%
1
2
3
4
5
2222543
2220548。6
2150592
2207429.1
2166469。6
1。5
3.6重复性试验
分别取同一批治伤活血胶囊样品5份,按正文中含量测定项下方法试验，测定阿魏酸的含量，结果见表5。样品中阿魏酸含量的相对标准偏差为1。27％，表明此法重复性良好。
表5 重复性试验结果
试验号 阿魏酸含量（ug/g) 平均含量(ug/g） RSD（％)
1 212。9
2 218.4
3 216.8 216。34 1.27
4 219.4
5 214.2
3。7加样回收率试验
采用加样回收法.取同一批已知含量的治伤活血胶囊精密称取样品约1g各5份，分别定量加入阿魏酸对照品适量，按正文中含量测定项下方法测定阿魏酸的含量。结果见表6，平均回收率为99.8%，相对标准偏差1。6%，表明此法回收率良好。
实测阿魏酸量-取样相当阿魏酸量
回收率= ×100％
加入阿魏酸对照品量
表6 回收率试验结果
取样量
(g）
样品中阿魏酸量(ug）
加入阿魏酸量(ug）
实测阿魏酸量（ug）
回收率
（％)
平均回收
率（%）
RSD（%）
1。2472
1。2493
1.2498
1。2407
1。2400
269。8
270.3
270。4
268。4
268。3
285
285
285
285
285
553。3
561。8
539。7
552.8
550。8
99。5
102。3
98。1
99.8
99。1
99.8
1.6
4、讨论
治伤活血胶囊主要由当归等八味药组成,本次实验对冰片的研究时，曾比较了超声处理提取方法，对比了环已烷—氯仿——醋酸乙酯（9：1：2）展开剂，比较了紫外光灯下（365nm）检视方法,结果以本文的方法较好。
实验对三七的研究时,为了更能控制产品的质量，采用三七对照药材为阳性对照,曾比较了:Ⅰ氯仿—醋酸乙酯—甲醇—水（10：4：1：5）;Ⅱ甲苯—甲酸乙酯—甲酸（6：6:0。1）;Ⅲ异辛烷—苯—氯仿—醋酸乙酯—甲酸（6：3:1.5:2：0.1）；Ⅳ正丁醇—醋酸乙酯—水（4：1:5）的上层溶液等多种展开剂，结果以展开剂Ⅳ展开后的斑点圆整，分离效果好。
综上，本品由八味药材组成，对五味药材分别进行了定性、定量的分析，能有效地控制本品的质量。
参 考 文 献
1、《中国药典》2005年版一部
2、《中华本草》上海科学技术出版社
3、《天然药物成分定量分析》中国医药科技出版社
4、苗明三等.现代实用中药质量控制技术
5、国家药品监督管理局。国家中成药标准汇编（经络肢体、脑系分册）
6、国家药品监督管理局.国家中成药标准汇编（内科、气血津液分册）