乳酸菌基因组编辑技术研究进展_李泳靓.pdf

第 3 期第 53 卷工业微生物基金项目：国家自然科学基金青年项目（32101928）。作者简介：李泳靓（1998），女，硕士研究生。E-mail：*通信作者：宋馨（1984），女，副教授。E-mail：。乳酸菌基因组编辑技术研究进展李泳靓，赖凤羲，艾连中，熊智强，夏永军，王光强，宋馨*上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093摘要：乳酸菌是一类重要的工业微生物，具有多种益生功能。目前关于其代谢功能改造、蛋白功能鉴定和挖掘优良功能基因等的研究主要依赖于传统的同源重组技术，但该技术效率低下，耗时且操作繁琐，严重制约了乳酸菌在基因水平的改造。因此建立稳定、高效的乳酸菌基因编辑方法，借助基因编辑技术挖掘功能基因、解析代谢途径、改良工业菌株等是十分有必要的。文章综述了乳酸菌基因编辑技术及其原理，并对这些技术在乳酸菌基因组上的应用现状和亟待解决的问题进行了分析总结，展望了乳酸菌基因组编辑技术的未来发展趋势，以期为乳酸菌功能基因鉴定及遗传改良提供参考。关键词：乳酸菌；基因编辑；同源重组；CRISPR；位点特异性重组doi：10.3969/j.issn.1001-6678.2023.03.022第 53 卷第 3 期2023 年 6 月工业微生物Industrial MicrobiologyVol.53 No.3Jun.2023乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）指的是一类能将碳水化合物发酵产生大量乳酸的细菌，乳酸菌包括 33 个属，有超过 373 种细菌1。相关研究表明，乳酸菌对恶劣环境具有良好的抗逆性，揭示了乳酸菌作为细胞工厂进行生物精制和生产生物活性物质的潜力2。同时，乳酸菌及其代谢产物已被证实对宿主具有益生作用，可以起到调节肠道菌群、改善胃肠道环境、降低胆固醇等作用3。另有研究称乳酸菌还可以通过各种机制抑制肿瘤生长，如抗增殖、诱导凋亡和抗炎作用等4。但是，与其他益生菌如尼氏大肠杆菌 1917（EcN）相比5，应用于生物医学的乳酸菌其生物工程技术并不完善，落后的基因组编辑技术一直阻碍着乳酸菌在基因水平上的改造。随着高通量测序技术的发展，开发新型基因组编辑工具、快速构建乳酸菌工程菌株成为新的研究热点。运用乳酸菌基因编辑技术进行表达系统开发、代谢途径改造及合成生物学等研究被锚定为关键技术6。目前，研究者们已经开发出一些适用于乳酸菌的基因组编辑工具，但这些工具大都不够高效并且具有菌株特异性。因此，研究适用于乳酸菌的广谱高效基因组编辑工具具有重要意义，有助于人们从乳酸菌中挖掘新的功能基因，解析菌株代谢途径，改良工业菌株，强化益生特性，有利于拓展其在食品开发、疾病治疗和营养保健等方面的应用。本文重点在基因组插入/整合方面综述了乳酸菌基因编辑技术及其原理，并对这些技术在乳酸菌基因组中的应用现状进行总结，分析该项技术目前面临的问题，展望乳酸菌基因编辑技术的未来发展趋势，以期为相关研究者提供参考。1基于质粒的同源重组传统的乳酸菌靶向基因修饰大多依赖于整合质粒与基因组之间的双交换，利用乳酸菌自身的同源重组实现目标基因的插入或敲除7。该方法由多种酶共同作用，其中最重要的是核酸重组酶（RecBCD）和重组酶 A（RecA）。RecBCD 是由三个亚基组成的66-第 3 期第 53 卷李泳靓等：乳酸菌基因组编辑技术研究进展蛋白质复合体，能解开 DNA 双链，形成单链；RecA能识别同源序列并在其他酶的辅助下完成链交换，实现同源重组8。同源重组可根据交换次数分为单交换同源重组和双交换同源重组。单交换同源重组指通过一次同源重组将重组载体整合到宿主染色体中，虽然其操作简单，但会在染色体中引入抗性基因，难以去除，并不是一种合适的重组方法，因此又开发出双交换同源重组。双交换方法可以通过二次同源重组将带有抗性基因的重组载体从宿主染色体上置换下来，实现无痕插入/敲除。但是双交换菌株的筛选和鉴定过程尤为耗时、繁琐、低效9，在部分乳酸菌中的阳性率仅为 1%10。对此可以引入反筛标记，或在同源臂中添加抗性标记以提高筛选效率。但这种方法无法有效区分回复突变株和突变株，理论筛选效率仅有50%11。此外，同源重组在大片段基因插入过程中存在较大困难，对于2.5 kb 的片段，重组效率极低12。2重组介导的基因/通路整合2.1Red/RecET 介导的双链 DNA 重组传统基于 RecA 的同源重组存在较大缺陷，而近年来一种新型的基于大肠杆菌体内同源重组的遗传工程技术逐渐兴起，被称为“重组工程”13。重组工程系统包括基于 噬菌体的 Red 重组系统14和源于Rac 前噬菌体的 ET 重组系统15，故又被称为 Red/ET重组系统。Red/ET 系统包括一个 5-3 核酸外切酶Red/RedE 和一个单链 DNA 退火蛋白 Red/RedT16。在宿主细胞中过表达两种蛋白后，Red 结合dsDNA 末端，从 5 向 3 降解 DNA 单链，产生位于3 链的粘性末端17，随后环催化退火反应的双链产物与 Red 结合成左旋螺旋结构，保护产物不被核酸酶降解18，并引导其寻找同源序列，继而发生同源重组，这一过程称为双链 DNA 重组工程（dsDNARecombineering）19。Gam 蛋白可以通过抑制宿主核酸酶系RecBCD 和 SbcCD 来阻止导入细胞的线性双链 DNA 降解，从而提高 Red/RecET 系统的重组效率16。Yang 等20发现植物乳杆菌 WCFS1 基因组上相 邻 的 Lp_0640、Lp_0641、Lp_0642 三 个 基 因 与Gam、Beta 和 Exo 氨基酸序列相似，基因组的位点也相似，因此推测其具有相似的功能，能够介导双链DNA 重组。经过试验成功将大肠杆菌 gusA 基因（3000 bp）插入 WCFS1 中，并通过 loxP/Cre 系统获得了抗性消除的突变菌株，使基因的连续敲除成为现实。但是该系统具有菌株特异性，限制了其在其他乳酸菌中的应用。相 较 之 下，单 链 DNA 重 组 工 程（ssDNARcombination）可以在没有筛选标记的情况下进行基因编辑，在乳酸菌中的应用似乎更有前途。Datta 等21从粪肠球菌中分离出了与大肠杆菌 RecT 功能相似的单链结合蛋白，使单链 DNA 重组工程在乳酸菌中的应用得以实现。该重组工程在罗伊氏乳杆菌、乳酸乳球菌、加氏乳杆菌和植物乳杆菌中也得到了成功应用，实现了点突变和基因缺失，但重组效率仅为0.4%19%22-23。ssDNA 重组工程所需同源序列短，50 bp 即可获得高效重组，操作简单，但基因组编辑效率低，难以进行大片段基因的敲除，有关基因插入的例子也未有报道。同时，乳酸菌菌种之间存在显著差异，如何研究出一种有效且适用于多种乳酸菌的重组酶系统仍是一个难题。2.2基于 CRISPR 的无痕多位点基因整合近年来，一种新型的基因组编辑技术 CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats）/Cas（CRISPR associated）引起众多学者广泛的关注和研究，已在多种生物中达成了快速基因编辑的目标24-26。与重组酶所介导的基因编辑技术不同的是，CRISPR/Cas 技术基于 DNA 的断裂/修复实现对目的序列的编辑27。CRISPR/Cas 系统本质上是一套获得性免疫系统，由具有特异性的小 RNA 将核酸内切酶 Cas（或多个 Cas 蛋白的复合体）引导至基因组靶位点，介导靶基因座使 DNA 双链断裂（Double strand break，DSB）28，多用于防御病毒或噬菌体的入侵29。CRISPR/Cas9 系统的免疫过程大致可分为三个阶段：适应、表达和效应30。适应阶段，当病毒或质粒等外源 DNA 入侵时，Cas1 和 Cas2 蛋白捕获 DNA片段并将其整合到 CRISPR 序列中形成新的间隔区，间隔区一般是通过对 PAM 的特异性识别获得，整个过程被称为“间隔选择”。表达阶段，新获得的间隔子需要转录加工为成熟的小分子 crRNA 来介导67-第 3 期第 53 卷工业微生物特异性免疫，这一过程即 crRNA 生物合成。整合发生后，新的间隔子与所有其他间隔子共同转录成一个长的前驱体 CRISPR RNA（pre-crRNA）。转录激活 CRISPR RNA（tracrRNA）被单独转录，随后退火到 pre-crRNA 重复序列中，通过 RNase III 裂解实现 crRNA 成熟。在干扰过程中，成熟的 crRNA-tracrRNA 经 RNase III 处理后，继续保持 RNA 双链。RNA 双链体和 Cas9 快速扫描目标 DNA 上的PAM 序列。crRNA 与原间隔 DNA 的碱基配对，并进一步延伸到整个原间隔区，形成稳定的 R-loop 结构。Cas9 蛋白的 HNH 结构域和 RuvC 结构域将目标 DNA 的两条链裂解，形成双链断裂。当存在外源同源重组模板 DNA（donor DNA）时，可依照同源片段对断裂位点进行修复，此过程即为同源重组修复（HDR）；而不存在 donor DNA时，DNA 双链断裂将激发生物体内的非同源末端连接（NHEJ），在断裂处插入或缺失基因片段31-33。CRISPR/Cas 系统分为三类，I 型与 III 型需要多种蛋白共同作用，而 II 型只需一种蛋白即可（如Cas9 蛋白）34，这为其广泛发展奠定了良好基础。CRISPR-Cas9 系统中 Cas9 蛋白、成熟的 CRISPRRNA（crRNA）和 tracrRNA 以及原间隔区相邻基序（protospacer adjacent motif,PAM）是最主要的 4 种元件。Cas9 蛋白是一种由 RNA 引导的核酸内切酶，包括 2 个结构域：HNH（负责切割互补链）和 RuvC（负责切割非互补链）。这两个结构域切割不同的DNA 链从而产生双链 DNA 缺口35；crRNA 是间隔序列的转录产物，它由 RNA 内切酶 III（RNaseIII）促进成熟并与 tracrRNA 一起形成单向导 RNA（singleguide RNA,sgRNA），引导 Cas9 蛋白找到正确的外源 DNA 切割位点36；PAM 序列是位于外源 DNA 上由 NGG（N 为任意碱基）组成的小段序列，Cas9 复合物与 PAM 近端结合时，Cas9 会在 PAM 位点上游 3bp 的位置切割 DNA 产生双链缺口37。乳酸菌中 CRISPR 系统可根据来源的不同分为内源性和外源性两类。Oh 等38将 CRISPR/Cas9 技术与 SSDR 方法相结合对罗伊氏乳杆菌中的 3 个基因lacL、srtA 和 sdp6 进行敲除，其突变率可以达到90%100%，首次实现了 CRISPR/Cas9 技术在乳酸菌中的应用，并证实了 CRISPR/SpCas9 结合 ssDNA重组是一种切实可行的编辑方法。GOH 等39利用外源性 Cas9N 系统对嗜酸乳杆菌进行了基因敲除，并成功插入了 mCherry 荧光蛋白基因，同时证实该系统在加氏乳杆菌和副干酪乳杆菌中也可以得以利用。内源 CRISPR/Cas 系统则为研究提供了另外一种思路。Hidalgo 等40利用卷曲乳杆菌（L.crispatus）内源 I-E 型 CRIPSR/Cas 系统实现了对自身基因组的编辑，成功敲除了胞外多糖启动糖基转移酶基因p-gtf（643 bp，100%效率）和原噬菌体 DNA 包装基因 Nu1（308 bp，20%效率）；插入了 gfp 基因（730bp，23%效率）；在 p-gtf 基因内实现了终止密码子插入（36%效率）和单核苷酸替换（19%效率）。这是首个成功利用内源性 CRISPR/Cas 系统在乳杆菌中实现基因编辑的案例。然而，CRISPR/Cas 系统的基因编辑效率仍然较低。研究表明，在 Cas9 核酸酶的固定表达水平下，sgRNA 的转录量与 Cas9-sgRNA 复合物在染色体上的切割效率呈正相关41，因此，可以通过更换强启动子增加 sgRNA 的转录量或避开 DSB 以提高基因编辑效率。Cas9D10A是 Cas9 的一个突变体，称为 Cas9切口酶。由于 Cas9 的 RuvC 结构域的活性位点发生突变时（D10A）仅保留一个 HNH 结构域，因此在基因组中只产生单链 DNA 缺口，对细胞的致命性降低，从而提高了同源重组的效率。Song 等42利用该系统敲除了 4 个非必需基因，还插入了 gfp 基因，基因敲除和插入的效率在 26%62%之间。Huang 等43成功利用 RecE/T 辅助的 CRISPR-Cas9 系统对植物乳杆菌（L.plantarum）WCFS1 和短乳杆菌（L.brevis）ATCC367 实现了有效的基因编辑。RecE/T 辅助HDR 提高了 610 倍的编辑频率，转化效率提升至102 CFU/g DNA，实现了单基因缺失，效率为 50100%。此外，还利用 P23-丙酮酸脱羧酶（pdc）表达盒将 Lp_0537 染色体进行替换，效率为 35.7%。植物乳杆菌和短乳杆菌的高效基因编辑表明，RecE/T 辅助的 HDR 和 CRISPR-Cas9 靶向染色体 DSB 的组合为基因编辑提供了一种通用且适应性强的策略来解决乳杆菌属的低 HDR 问题。虽然目前运用 CRISPR/Cas 系统对乳酸菌基因组进行编辑的实例较少（见表 1），但由于其实验要求低、操作简单快捷、基因编辑高效无痕，CRISPR/68-第 3 期第 53 卷属种菌株CRISPR/Cas 组件内源性/外源性特征参考文献乳球菌L.lactisNZ9000dCas9外源性利用单质粒系统使 upp mRNA 的相对转录降低 50 倍44L.lactisMG1363SpyCas9外源性CRISPR 敲除特定基因以产生抗噬菌体感染的菌株45L.acidophilusNCFMSpyCas9D10A外源性对多个位点进行基因敲除（效率 35%100%）并拓展到其他乳杆菌中39L.reuteriATCC PTA6475SpyCas9外源性CRISPR/Cas9 结合 ssDNA 实现高效点突变（100%）38L.caseiLC2WSpyCas9D10A外源性快速精准实现基因敲除和插入，效率为25%62%42乳杆菌L.plantarumWCFS1SpyCas9外源性CRISPR/Cas9 辅助 dsDNA，利用抗生素基因和 loxP 位点两步插入（效率 53.3%）46L.plantarumAR113SpyCas9外源性评价了 bsh 基因的功能，为筛选高耐胆盐菌株提供依据47L.brevisATCC367SpyCas9外源性RecE/T 辅助 CRISPR/Cas9 可以实现单基因缺失（效率 50%100%）43L.crispatusNCK1350Cascade.Cas3内源性首次在乳杆菌中利用内源性系统，实现了p-gtf 基因的敲除44李泳靓等：乳酸菌基因组编辑技术研究进展表 1CRISPR 介导的基因编辑Cas 系统在乳酸菌基因编辑方面必将得到广泛应用。3SSR 介导的基因整合或串联扩增位点特异性重组（Site-specific recombination，SSR）发生在特定的位点之间，由重组酶催化核心的氨基酸向 DNA 骨架发起攻击并介导双链交换实现重组48。由于位点特异性重组只发生在特异性位点之间，因此它具有高效、专一、适用面广等特点49。位点特异性重组系统根据氨基酸序列的同源性及催化机制的不同可分为酪氨酸重组酶和丝氨酸重组酶50，它们通常源于噬菌体、转座子、环状质粒及微生物基因组51。其中，原噬菌体介导的整合酶系统在乳酸菌基因组整合中的研究和应用最为广泛52，其原理是通过识别宿主的细菌结合位点（attB），使其与自身的噬菌体结合位点（attP）形成联会复合体，从而实现 DNA 链的切割与交换，生成含有重组产物 attL 和 attR 的原噬菌体48（见图 1）。噬菌体酪氨酸重组酶系统中整合系统、Cre-loxP 和 Flp 系统的研究与应用最为广泛。Cre 重组酶可以介导基因组染色体上的 loxP 位点与环状 DNA上的 loxP 位点之间的重组。可惜的是，Cre 重组是可以自由逆转的。整合过程中，环状分子上的位点和染色体上的位点发生重组导致染色体插入环状DNA 中。然而，整合的 DNA 两侧留有两个相同方向的 loxP 位点，如果重组酶依然存在，插入的基因就会再次被切除，并且从动力学角度上看，分子内切除是优先于分子整合的，因此插入产物在重组酶存在时并不稳定53。虽然可以通过改造 loxP 位点或瞬时提供重组酶来解决这一问题54-55，但 Cre 系统通常不用于基因整合，而是作为辅助手段加以应用。Xin 等56从 L.casei BL23 基因组的前噬菌体 PLE3 中鉴定出一个与-Red 系统类似的 LCABL_13040-50-60系统，实现了 BL23 菌株的基因敲除、插入和精确点突变。利用 Cre-lox 系统去除整合过程中留下的筛选标记，成功将 gfp 和 faeG 基因插入并在染色体上表达。Petersen57利用整合酶 TP901 将乳酸乳球菌KF147 的木糖利用基因 xylABR 和 xyylt 分两步整合到了 MG1363 的染色体上，但单整合酶系统会将整个质粒包括抗生素选择标记整合到染色体上，限制了迭代整合的可能性，因此需要利用 Cre-loxP 系统切除抗生素筛选标记。丝氨酸重组酶家族也称为倒位/解离酶系。而随着研究的不断深入，一类分子量较大、介导整合和切离的重组酶被单独划分出来，称为大型丝氨酸重组酶58。与酪氨酸家族相比，丝氨酸整合酶不需要辅助因子来结合或弯曲 DNA，其对底物结构的要求也很低，体外实验中，只要有合适的缓冲液、纯化的整合69-第 3 期第 53 卷工业微生物整合切离attBattPattLattR酶及编码 attP 和 attB 的 DNA，无论底物是否具有超螺旋结构都能发生高效的重组59。但是目前关于丝氨酸整合酶的研究并不多，其中较为深入的只有链霉菌噬菌体编码的 C31 整合酶60和分枝杆菌噬菌体编码的 Bxb161，可惜的是，并没有这两种整合酶在乳酸菌中应用的报道。此外，其他丝氨酸整合酶在乳酸菌中的应用也鲜有报道，Alvarez 等62解析了整合酶 A2 的结构和序列特征并将其成功应用于大肠杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌中，整合频率为103，整合效率达到了 100%。然而传统的整合酶系统往往将整个质粒连同抗性标记一起整合到基因组中，不仅受制于质粒的构建，还留有额外的抗性标记，为解决这一问题研究者开发出了双整合酶系统63和体外组装64以增强噬菌体整合酶系统的实用性。噬菌体系统的最大优势在于其对实际插入片段的大小没有限制，然而这种方法也存在一些缺点，其中最主要的就是为了保证预期位点的高效插入，必须要严格保证 att 位点的正交性，以免出现整合混乱的情况。但由于同属的噬菌体 att 位点具有一定相似性65，很难完全保证其独立、正交，因此常选择使用不同来源的噬菌体系统，但其能否在乳酸菌中成功应用尚有存疑；此外，由于目前在乳酸菌中广泛使用的噬菌体系统利用内源性染色体附着位点，因此插入位置选择的灵活性大大降低；同时，该方法还是会在染色体上留下一个 att 疤痕，要将其去除仍需要结合其他手段，例如同源重组、CRISPR 等，使该方法变得更加繁琐。图 1位点特异性基因重组4总结展望乳酸菌作为一种公认的安全微生物（Generallyrecognized as safe,GRAS），被广泛应用于食品、医药、化学品生产等各领域中。但乳酸菌，特别是乳杆菌属的低同源重组能力大大限制了其多方面的发展和应用。过去三十年间，乳酸菌的基因编辑迎来了高速发展，从以往利用乳酸菌内源性同源重组系统进行基因组编辑，到当前运用 CRISPR/Cas 技术高效、快速地进行基因组修饰，技术手段在不断地升级，人们也正在向更高的编辑效率大步迈进。同时，伴随着CRISPR/Cas 基因组编辑技术的出现，大型代谢通路的无标记多位点整合在传统同源重组的基础上变得更加可行。然而，包括 CRISPR/Cas 技术在内，关于大型DNA 构建的多拷贝整合方法的研究大多集中在模型微生物（例如大肠杆菌、链霉菌和酵母等）上，在非模式菌株中却表现不佳66。当前在乳酸菌中很难找到一类通用的基因编辑工具，因此开发多元化的基因编辑工具，编辑策略彼此互补，并基于此建立适用于不同种乳酸菌的基因编辑系统仍然任重道远。最后，尽管基于外源 DNA 的染色体整合将有效克服质粒系统的障碍用于目标产物的生物合成，但染色体整合基因/通路的拷贝数增加可能会引发严重的代谢负担和生长缺陷67。因此，应结合启动子工程、前体工程、生物合成基因的扩增和代谢途径的动态控制等手段，组合应用于微生物的菌株改良68。参考文献1 DE VOS W M.Gene expression systems for lactic acidbacteria J.Current Opinion in Microbiology,1999,2(3):289-295.2 PIJKEREN J-P V,BARRANGOU R.Genome editing ofFood-Grade lactobacilli to develop therapeutic probioticsM.Bugs as Drugs,2018:389-408.3 费苏,夏永军,艾连中,等.乳酸菌在肠道内黏附定殖的研究进展 J.工业微生物,2020,50(02):58-62.4 AMENU D.Overview of Anticancer activity of Lactic Acidbacteria J.International Journal of Advanced Research inBiological Sciences(IJARBS),2017,4:166-177.70-第 3 期第 53 卷李泳靓等：乳酸菌基因组编辑技术研究进展5 ZUOF,MARCOTTEH.Advancingmechanisticunderstanding and bioengineering of probiotic lactobacilliand bifidobacteria by genome editing J.Current Opinionin Biotechnology,2021,70:75-82.6 樊斌,陈欢,宋婉莹,等.乳酸菌基因改造技术研究进展J.中国生物工程杂志,2020,40(06):84-92.7 RUSSELL W M,KLAENHAMMER T R.Efficient systemfor directed integration into the Lactobacillus acidophilusand Lactobacillus gasseri chromosomes via 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