拟南芥磷脂酸荧光探针的构建及应用.pdf

拟南芥磷脂酸荧光探针的构建及应用马疏言1，郑月萍1,2，郑志富1,2（1.浙江农林大学现代农学院，浙江杭州311300；2.浙江农林大学油料作物种质创新与利用研究所，浙江杭州311300）摘要：【目的目的】磷脂酸(PA)是甘油脂生物合成的前体，又是参与植物生长发育调节和各种逆境响应的重要信使物质，然而目前对植物细胞中 PA 含量动态变化的了解十分有限。本研究试图构建一种能有效监测植物细胞 PA 含量变化的荧光探针，并用之测定盐碱胁迫过程中胞内 PA 含量的变化。【方法方法】将 Spo20p 蛋白中高度专一的 PA 结合域相对应的核苷酸序列与绿色荧光蛋白基因融合，经遗传转化获得携带该融合基因的转基因拟南芥 Arabidopsis thaliana 株系，其表达受组成型启动子 UBQ10 驱动，产生的融合蛋白成为专一结合 PA 的荧光探针。随后，运用该荧光探针监测盐碱胁迫下胞内PA 含量的变化。【结果结果】构建获得 7 个不同的纯合、单插入位点转基因拟南芥株系。实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)分析显示：不同株系中融合基因的表达量存在差异。不同浓度外源 PA 处理试验显示：随着表达量的升高，PA 探针可有效监测到 2molL1PA 处理根尖 10min 后细胞中 PA 含量的变化；而当 PA 探针表达量较低时，对 PA 监测灵敏度显著下降，表明在一定程度上荧光探针对 PA 监测的灵敏度与其表达量相关联。运用 PA 荧光探针发现：盐碱胁迫处理根尖 5min 即可诱导质膜上或胞内 PA 的积累，暗示 PA 在植物早期盐碱胁迫响应中可能产生重要作用。【结论结论】本研究构建了一种可对细胞内 PA 含量进行有效监测的荧光探针，该探针可用于监测植物盐碱胁迫早期响应过程中胞内 PA 水平的变化，从而为早期逆境响应研究提供新工具。图 7 表 1 参 36关键词：磷脂酸；荧光探针；转基因；盐碱胁迫；拟南芥中图分类号：Q946.5文献标志码：A文章编号：2095-0756(2024)01-0104-09GenerationandapplicationofafluorescentprobeforphosphatidicacidinArabidopsis thalianaMAShuyan1，ZHENGYueping1,2，ZHENGZhifu1,2（1.College of Advanced Agricultural Sciences,Zhejiang A&F University,Hangzhou 311300,Zhejiang,China;2.Institute for Oilseed Crop Germplasm Innovation and Utilization,Zhejiang A&F University,Hangzhou 311300,Zhejiang,China）Abstract:Objective Phosphatidic acid(PA)serves as an important signal molecule involved in theregulationofplantgrowthanddevelopmentanddifferentresponsestovariousstressesaswellasageneralprecursorforglycerolipidbiosynthesis.However,littleisknownthusfaraboutthedynamicchangesofPAinplantcells.ThisstudyattemptedtoconstructafluorescentprobethatcaneffectivelymonitorthechangesofPAinplantcellsanduseittomeasurethechangesofintracellularPAundersaline-alkalinestresses.MethodThecorrespondingnucleotidesequenceforPA-specificbindingdomainwithintheSpo20pproteinwasfusedtothegreenfluorescentproteingene.TransgenicArabidopsis thalianalinesbearingthefusiongeneunderthecontrol收稿日期：2023-06-08；修回日期：2023-07-27基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目(32100209)；浙江省自然科学基金青年基金资助项目(Q21C020003)；国家自然科学基金面上基金资助项目(31871660)作者简介：马疏言(ORCID:0009-0007-5802-6691)，从事植物生理生化与代谢调控研究。E-mail:。通信作者：郑志富(ORCID:0000-0002-8247-5629)，教授，从事植物生化和代谢研究。E-mail:浙江农林大学学报，2024，41（1）：104112Journal of Zhejiang A&F Universitydoi:10.11833/j.issn.2095-0756.20230355oftheconstitutivepromoterUBQ10wasthengeneratedviagenetictransformation.TheresultingfusionproteinconstitutedafluorescentprobespecificallybindingtoPA.Subsequently,thisprobewasemployedtomonitorthe changes of cellular PA under saline-alkaline stresses.Result Seven transgenic A.thaliana lineshomozygousforsingleinsertionofthefusiongenewasgenerated.RealtimequantitativePCR(RT-qPCR)analysis showed that expression levels of the fusion gene varied among different lines.Experiments withvariousexogeneousPAconcentrationsrevealedthatastheexpressionlevelofthePAprobeincreased,itcouldeffectivelymonitorthechangesofcellularPAintheroottipstreatedwith2molL1exogenousPAfor10min,whereas this was not the case when the expression level of the probe was low,indicating that thesensitivityoftheprobeforPAdetectionis,toacertaindegree,associatedwithitsexpressionlevel.BasedonthisfluorescentPAprobe,PAaccumulationattheplasmamembraneorintheintracellularspacewasevidentintheroottipsundersaline-alkalinestressesfor5min,implyingthatPAmayplayimportantrolesinearlyplantresponsestosaline-alkalinestresses.ConclusionAfluorescenceprobeforeffectivemonitoringofcellularPAwasdevelopedinthisstudy.ThisprobecanmonitorthealterationsincellularPAlevelduringearlyplantresponsestosaline-alkalinestresses,therebyprovidinganewtooltostudyearlyresponsestovariousstresses.Ch,7fig.1tab.36ref.Key words:phosphatidicacid;fluorescentprobe;transgene;saline-alkalinestress;Arabidopsis thaliana磷脂酸(phosphatidicacid，PA)是一种常见的细胞甘油磷脂，也是最简单的膜脂之一1。几乎所有生物体内都会产生 PA，包括酵母2、动物3和植物4等。在植物中 PA 的合成主要包括 2 种方式：第 1 种是从头合成途径，3-磷酸甘油先后在 3-磷酸甘油酰基转移酶和溶血磷脂酸脂酰基转移酶的作用下发生连续 2 步酰化反应生成 PA，这也是 PA 合成的主要途径5；第 2 种是磷脂的降解途径，磷脂降解又可分为2 种，一种是磷脂酶 D 通过水解某些结构磷脂直接生成 PA69，另一种是磷脂酶 C 通过水解磷脂酰肌醇生成二脂酰甘油10，继而经二脂酰甘油激酶磷酸化生成 PA11。PA 作为一种结构膜脂，磷酸基团头部能够以“静电/氢键开关模型”的方式与蛋白质结合12。在该模型中，PA 结合蛋白中带正电荷的碱性氨基酸残基1317，可以吸引磷脂双分子层上的负电荷，并通过静电作用影响膜环境，继而与 PA 头部的磷酸基团形成氢键，产生一个稳定的蛋白质结合位点。PA 这种携带负电荷并且在生理条件下呈圆锥体的独特分子构型18，使得 PA 结合蛋白的结构域能够特异性的与其结合，保证了生物膜结构的稳定和功能的发挥。除了作为膜脂的一个结构成分以及甘油脂合成的前体物质，PA 还是一个关键信号分子，在多种生物学过程中发挥重要作用。正常条件下，行使信号功能的 PA 含量甚微；在植物应答各种生物与非生物胁迫过程中 PA 水平则会迅速升高，但这种积累往往是短暂的。这说明生物体拥有一套严格控制信号分子 PA 含量的机制，这对调节 PA 信号传递强度、维持细胞物质与能量代谢的动态平衡至关重要1922。尽管 PA 拥有多种功能，但目前对于细胞内 PA 含量的动态变化仍知之甚少，这主要受 PA 检测手段的限制。过去主要采用诸如薄层层析、高效液相色谱和放射性同位素标记等理化手段对其含量进行测定23。近年来，质谱分析技术的应用使得对包括 PA 在内的各种脂质的测定更准确和高效2425。然而，这些理化手段都只能对组织器官中 PA 总量与种类进行定量或定性分析，无法捕捉细胞内 PA 的动态与瞬时变化信息。通常认为，内质网上的 PA 含量相对较高，这有助于促进磷脂和三酰甘油的合成2627；而质膜和细胞器中行使信号功能的 PA 含量甚微。显然，采用理化测定会掩盖胞内 PA 的真实变化。因此，亟需开发一种能可视化分析细胞内 PA 的工具。大量研究表明：生物体中 PA 结合蛋白种类繁多，这些蛋白中的 PA 结合域(phosphatidicacidbindingdomains，PABD)结构亦存在差异。其中一些 PABD 因与 PA 结合专一性强，被用来开发多种 PA 探针2833。酵母蛋白 Spo20p 中的 PA 结合域已被证实具有极强的专一性33，只结合 PA 而不结合其他磷脂。目前基于这一 PABD 所开发的 PA 探针在医学研究中应用广泛，但在植物中的应用却有限34。因此，本研究旨在构建基于 Spo20p 中的 PABD 的植物 PA 荧光探针，为剖析植物早期应答逆境胁迫的细胞分子机制提供新工具。第 41 卷第 1 期马疏言等：拟南芥磷脂酸荧光探针的构建及应用1051材料与方法1.1植株培养1.1.1土壤基质的培养将拟南芥 Arabidopsis thaliana 种子置于含有湿润滤纸的培养皿中，4 冰箱内避光放置 3d 后将其点播在湿润的土壤基质上(V营养土V蛭石V珍珠岩=311)。将播种后的盆栽用透明塑料盖覆盖，置于2425 室温、50%60%湿度、14h 光照/10h 黑暗的植物培养箱中培养，7d 后揭去塑料盖间苗。1.1.2培养基的培养将拟南芥种子进行消毒，加入适量灭菌过的蒸馏水，在 4 冰箱内避光放置 3d，点播在 1/2MS 培养基上，置于植物培养间中培养。1.2PA 荧光探针的构建1.2.1pSY06-GFP-PABD 载体的构建酵母蛋白 Spo20p 中存在一个高度专一的 PA 结构域(PABD)，该PABD 由 40 个氨基酸残基构成，只结合 PA 而不结合其他磷脂3334，因此，本研究选择该 PABD 与荧光蛋白融合，构建 PA 荧光探针。根据 PAPD 核苷酸序列33设计引物(表 1)进行 PCR 扩增，获得与该PABD 相对应的 DNA 片段；同时 PCR 扩增获得 GFP 基因编码区序列。随后，利用无缝克隆试剂盒(生工)，将 GFP 和 PABD 片段克隆至植物表达载体 pSY06 的限制性内切酶位点 KpnI 和 PstI 之间，获得重组质粒 pSY06-GFP-PABD。PABD 连接至 GFP 基因编码区的 3端，构成 GFP-PABD 融合基因，该融合基因的表达由组成型启动子 UBQ10 驱动。重组质粒中的插入片段经菌落 PCR、KpnI 和 PstI 双酶切以及测序验证正确后，采用热激法将质粒转化至农杆菌 Agrobacterium tumefaciensGV3101，用于后续拟南芥遗传转化。表1相关引物序列Table1Sequenceofrelatedprimers用途引物名称引物序列(53)PABD基因合成ZYP301CCTGCTAATTTCAAGGCTAATTCATTGCTGTTCGCTCGAGATCTGAGTCCGGACTGCAGGTTGGATCCGGTACCGAGCTZYP302GAAGACGTGATAGGCTACATGTGAAGCTTAAATCCTTGAGGAATAAAATCCACAAACAACTTCACCCAAAZYP303TGCTTCCTGAACAATTGTCCATTCTAGATTCTGTCTTGTTGATATCAAGACCTGCTAATTTCAAGGCTAAZYP304GTACCCAAGCTTCACATGTAGCCTATCACGTCTTCTGCTTCCTGAACAATTGTCCZYP305CACAAACAACTTCACCCAAACTGTCGGTTCGATGACGCCACTAAGACTAGTTAAGGTACCGGCGTAATCATGGTCPABD基因克隆ZYP308TCCGGACTCAGATCTCGAGCZYP309AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTCGFP基因克隆ZYP306TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGAZYP307AGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATCCGGACTCAGATCTCGAGC转基因拟南芥鉴定MSY01TGGTGTTAGTTTCTAGTTTGTGCGMSY02TCATCATGACAGATCTGCGC表达量分析ZYP389GACCACTACCAGCAGAACACCZYP390CTTGTACAGCTCGTCCATGC1.2.2拟南芥的遗传转化、筛选及鉴定以哥伦比亚野生型拟南芥(WT)为植物材料，利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥。将获得的 T1代拟南芥种子进行表面消毒，均匀铺在含有草铵膦(10mgL1)和特美汀(50mgL1)的 1/2MS 筛选培养基上进行筛选。将具有除草剂抗性的阳性苗移栽到土壤中继续培养，3 周后提取叶片 DNA 并设计引物(表 1)进行 PCR 鉴定，对 T2和 T3代转基因株系进行除草剂抗性的遗传分析，最终筛选得到纯合单插入位点转基因株系。1.3转基因拟南芥中目的基因表达量分析以在 1/2MS 培养基中生长 7d 的转基因拟南芥根系作为测定材料，使用高纯度 RNA 提取试剂盒(全106浙江农林大学学报2024 年 2 月 20 日式金)提取 RNA 并对其进行纯度检测和浓度测定。取等量 RNA，使用反转录试剂盒(翌圣)进行单链cDNA 的合成。选择拟南芥肌动蛋白基因 Actin 为内参基因，设计引物(表 1)进行实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)，并对数据采用 2Ct法进行分析。1.4PA 荧光探针转基因拟南芥的表型观察将野生型和转基因株系种子点播在 1/2MS 方形培养基上，竖直培养 6d 后，挑选长势均匀一致的幼苗(每个基因型，20 株)，分别转移至含有 0 和 50mmolL1NaCl 的 1/2MS 固体培养基中继续竖直培养，7d 后观察表型。1.5PA 荧光探针灵敏度分析将在 1/2MS 方形培养基上竖直培养 6d 的幼苗分别浸泡在含有 0、2 和 10molL1PA 的 1/2MS 液体培养基中，依次处理 5、10、15 和 20min 后，利用荧光显微镜(ZEISS，AxioImager2)对拟南芥根尖分生区 PA 的分布进行观察并拍照。1.6盐碱胁迫下根尖 PA 的检测将含 PA 荧光探针的拟南芥转基因株系种子点播在 1/2MS 方形培养基上，竖直培养 6d，选择均匀一致的幼苗分别浸泡在含有 100mmolL1NaCl、10mmolL1NaHCO3和兼含两者的 1/2MS 液体培养基中，处理 5、10 和 15min 后用荧光显微镜观察根尖分生区 PA 的分布。2结果与分析2.1PA 荧光探针的设计及其转基因拟南芥的获得如图 1 所示：该载体以 pSY06 为骨架，由 35S启动子驱动植物选择标记基因草铵膦抗性基因(bar)的表达，而 GFP-PABD 融合基因的表达则由 UBQ10 启动子驱动。barGFP35S Promoter UBQ10 Promoter35S TerminatorUBQ10 TerminatorPABD图1pSY06-GFP-PABD 载体图Figure1VectordiagramofpSY06-GFP-PABD采用农杆菌花序侵染法将 GFP-PABD 融合基因转入拟南芥，获得 T1代转基因种子。对 T1代幼苗进行草铵膦(10mgL1)抗性筛选与 PCR 鉴定，获得 56 个含融合基因的独立转基因株系。随后，对相应株系的 T2代幼苗(每个株系约 300 株)继续进行草铵膦除草剂抗性筛选。卡方测验显示：符合 3(阳性苗数)1(阴性苗数)分离规律的株系共 8 个，这些株系为含单插入位点的转基因株系。再对 T2代各个株系不同植株的自交后代(T3代)进行除草剂抗性筛选，最终获得 7 个纯合、单插入位点转基因拟南芥株系，分别为 8-1、11-1、13-12、25-5、42-4、48-1 和 53-1。2.2不同转基因株系 PA 荧光探针表达量的分析为了明确不同转基因株系 PA 荧光探针表达量的差异，对上述 7 个转基因株系进行了目的基因的表达量测定。RT-qPCR 结果(图 2)显示：当将转基因株系 8-1 中融合基因的相对表达量设为参考值“1”，其余 6 个株系(11-1、13-12、25-5、42-4、48-1 和 53-1)的 相 对 表 达 量 分 别 为 1.74、15.91、0.72、1.06、1.69 和 1.52。株系 13-12 的 PA 探针的表达量最高，是其他株系的 922 倍，为 PA 探针高表达转基因株系；相应地，将株系 48-1 作为 PA 探针低表达材料。2.3PA 荧光探针对拟南芥生长发育的影响为了明确 PA 荧光探针的表达是否会对植物生长发育产生影响，比较分析了野生型拟南芥和不同转基因株系在整个生长发育周期的表型差异。土培生长实验显示：野生型与转基因拟南芥株系的叶片生长无明显差异，高表达转基因株系(13-12)与低表0841216208-111-1 13-12 25-5株系42-448-153-1相对表达量图2不同转基因拟南芥株系中 GFP-PABD 融合基因的相对表达量Figure2RelativeexpressionleveloftheGFP-PABDfusiongeneintransgenicA.thalianalines第 41 卷第 1 期马疏言等：拟南芥磷脂酸荧光探针的构建及应用107达转基因株系(48-1)之间亦无可见表型差异(图 3A)。另外，在含有 0 和 50mmolL1NaCl 的 1/2MS 培养基中生长时，野生型与不同转基因株系之间也未表现出生长速率的差异(图 3B)。这些结果说明：在一定范围内 PA 荧光探针的表达不会影响拟南芥的正常生长发育，这一特性有助于合理解释特定条件下胞内 PA 变化对植物生长发育产生的影响。ABWT11-113-1248-10 mmol L1 NaCl50 mmol L1 NaCl13-1248-1WTA.PA荧光探针转基因株系13-12和48-1与野生型(WT)拟南芥地上部的表型比较，标尺为2 cm；B.PA荧光探针转基因株系11-1、13-12和48-1与野生型(WT)拟南芥，在1/2 MS培养基以及含50 mmol L1 NaCl的1/2 MS 培养基中培养13 d后的表型比较，标尺为2 cm。图3野生型拟南芥与 3 个 PA 荧光探针转基因株系的表型比较Figure3PhenotypiccomparisonbetweenwildtypeandthreetransgeniclinesofA.thalianabearingPAfluorescentprobe2.4荧光探针监测 PA 的灵敏度随着荧光探针表达量的增加，细胞内的荧光强度也会增强，这会导致 PA 检测的信噪比下降；相反，荧光探针表达量过低则会影响 PA 检测的灵敏度。为了获得检测灵敏度和信噪比都较高的 PA 荧光探针，用不同浓度的外源 PA 处理荧光探针表达量存在差异的转基因株系，进而在荧光显微镜下观察根尖 PA 的积累情况。结果(图 46)显示：野生型拟南芥在有、无外源 PA 处理下，根尖细胞自发荧光的WT48-113-120 min5 min10 min15 min20 min将在1/2 MS培养基中培养了6 d的野生型(WT)拟南芥、含有PA荧光探针的低表达量转基因株系(48-1)和高表达量转基因株系(13-12)，分别在无外源PA的1/2 MS液体培养基中依次处理0、5、10、15和20 min后，用荧光显微镜观测拟南芥根尖分生区PA的分布。标尺为50 m。图4无外源 PA 处理下 PA 探针在野生型和 2 个转基因拟南芥株系根尖中荧光强度的差异分析Figure4AnalysisofdiscrepancyinfluorescentintensityofPAprobebetweenwildtypeandtwotransgeniclinesofA.thaliana108浙江农林大学学报2024 年 2 月 20 日强度无明显差别。另外，在不同浓度外源 PA 处理下，荧光探针低表达的转基因株系(48-1)的根尖分生区的 PA 含量变化未能被捕捉到。相反，对于荧光探针高表达的转基因株系(13-12)，2 和 10molL1PA 分别处理 10和 5min 后，其根尖分生区细胞的胞内或质膜上的 PA 积累清晰可见(图 5)。当外源PA 浓度低时，随着处理时间延长，细胞中 PA 积累减少(图 5)，这很可能是因为作为甘油脂合成前体物质的 PA 已被转化为其他物质。而当外源 PA 浓度升至 10molL1时，处理 10、20min 后依然可见细胞中的 PA 呈点状分布(图 6)。这些结果说明：荧光探针表达量较高的转基因株系(13-12)可被用于监测细胞中 PA 含量的变化。WT48-113-125 min10 min15 min20 min将在1/2 MS培养基中培养了6 d的野生型(WT)拟南芥、含有PA荧光探针的低表达量转基因株系(48-1)和高表达量转基因株系(13-12)，分别在含2 mol L1外源PA的1/2 MS液体培养基中依次处理5、10、15和20 min后，用荧光显微镜观测拟南芥根尖分生区PA的分布。标尺为50 m。图5外源 PA(2molL1)处理下 PA 荧光探针对 PA 监测灵敏度的分析Figure5SensitivityanalysisofPAfluorescentprobemonitoringPAundertreatmentwith2molL1exogenousPAWT48-113-125 min10 min15 min20 min将在1/2 MS培养基中培养了6 d的野生型(WT)拟南芥、含有PA荧光探针的低表达量转基因株系(48-1)和高表达量转基因株系(13-12)，分别在含10 mol L1外源PA的1/2 MS液体培养基中依次处理5、10、15和20 min后，用荧光显微镜观测拟南芥根尖分生区PA的分布。标尺为50 m。图6外源 PA(10molL1)处理下 PA 荧光探针对 PA 监测灵敏度的分析Figure6SensitivityanalysisofPAfluorescentprobemonitoringPAundertreatmentwith10molL1exogenousPA2.5荧光探针检测盐碱胁迫下拟南芥根尖 PA 的含量变化为了进一步验证PA 荧光探针的实用性，利用荧光探针表达量较高的转基因株系(13-12)检测盐碱胁迫条件下根尖细胞中 PA 含量的变化。结果显示：盐、碱单独或混合处理转基因株系，5min 后即可在根第 41 卷第 1 期马疏言等：拟南芥磷脂酸荧光探针的构建及应用109尖分生区细胞中观察到 PA 的点状分布(图 7)。因此推断，本研究构建的 PA 荧光探针可用于监测逆境条件下植物细胞中 PA 含量的变化。另外，盐碱胁迫可快速诱导 PA 积累这一现象表明在植物早期逆境响应中 PA 发挥某种重要作用。ck100 mmol L1 NaCl10 mmol L1 NaHCO3100 mmol L1 NaCl+10 mmol L1 NaHCO3WT13-12的混合溶液处理5 min后，在荧光显微镜下观测拟南芥根尖分生区PA的分布。标尺为50 m。将在1/2 MS方形培养基上培养6 d的野生型(WT)拟南芥和高表达量转基因株系(13-12)的幼苗，分别用ck(无胁迫)、100 mmol L1 NaCl、10 mmol L1 NaHCO3以及100 mmol L1 NaCl和10 mmol L1 NaHCO3图7单独或混合盐碱胁迫下 PA 在转基因拟南芥根尖分生组织中的分布Figure7DistributionofPAintheroottipmeristemofatransgenicA.thalianalinebearingPAsensorundersalineandalkalinestresses,aloneorincombination3讨论已知 PA 在植物生长发育与逆境响应过程中发挥重要作用，但由于缺乏 PA 的可视化分析工具，对细胞中 PA 含量动态变化的了解十分有限。这一方面限制了 PA 作用机制的研究，另一方面给评估基因工程手段操控植物细胞 PA 含量变化所产生的实际应用效果带来困难。因此，本研究将酵母蛋白Spo20p 中对 PA 高度专一的结合域与荧光蛋白融合，成功构建了可对细胞内 PA 进行可视化检测的荧光探针。为了使荧光探针适用于监测整个生长周期不同组织细胞中的 PA 水平，选择组成型表达启动子UBQ10 驱动 GFP-PABD 融合基因的表达。研究发现：植物细胞中 PA 的检测灵敏度与 PA 荧光探针的表达量密切相关，表达量较高的荧光探针可有效检测到外源 PA 处理带来的胞内 PA 水平的变化，而表达量较低的探针检测效果则相反。如 13-12 株系中 PA 荧光探针的表达量高于其他株系，该株系经 2molL1外源 PA 处理 10min，其根尖细胞中 PA 的点状分布即可被观察到，这也说明外源 PA 能够被拟南芥根尖快速吸收，继而与 PA 荧光探针结合。鉴于已有研究中常用浓度高于 10molL1的外源 PA 检测 PA 探针的灵敏度35，本研究中构建的荧光探针可有效监测到 2molL1外源 PA 处理所带来的细胞内 PA 含量的变化，推测基于 13-12 转基因株系的 PA 荧光探针具有较高的 PA 检测灵敏度。需要指出的是，PA 荧光探针使用过程中，样品处理时间的延长和观察光源的增强均会使植物细胞造成某种损伤，导致细胞产生自发荧光，从而降低 PA 检测的信噪比。因此在实验过程中，需尽量缩短植物样本的制片时间及荧光观察的时间，以提高观察结果的真实性。盐碱地中盐和碱是 2 种共存但不同的非生物胁迫，共同影响植物的正常生长发育。利用本研究构建的 PA 荧光探针发现：盐胁迫处理 5min 就会造成 PA 在细胞中的积累，这与已有的研究结果一致22,36。同时，碱胁迫和盐碱混合胁迫也会快速诱导 PA 的积累。因此，为了全面了解植物早期逆境响应机制，有必要监测早期细胞中 PA 含量的动态变化。本研究开发的 PA 荧光探针为这些方面的研究提供了重要技术支撑。4结论本研究成功构建了一种基于酵母蛋白 Spo20p 中 PA 结合域的荧光探针，可有效监测植物细胞中PA 含量变化。应用该探针发现盐碱胁迫可快速诱导拟南芥根尖细胞质膜上和胞内 PA 的积累，这一结果110浙江农林大学学报2024 年 2 月 20 日表明 PA 在植物对盐碱胁迫早期应答过程中发挥重要作用。5参考文献ZHUKOVSKYMA,FILOGRANAA,LUINIA,et 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