细胞培养过程中的注意事项及试剂配制.doc

细胞培养过程中的注意事项及试剂配制一.常用设备 准备室的设备： 单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4冰箱（放置serum和培养用液）。二.无菌操作 无菌室的灭菌： 1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3来苏尔或者新洁尔灭或者0.5过氧乙酸擦拭。 2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3新洁尔灭擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5过氧乙酸，再用紫外灯照射3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌：用75酒精（3新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示： 1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。三.器械的清洗和消毒 玻璃器械洗消： (1)新的玻璃器皿的洗消： 1.自来水刷洗，除去灰尘。2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。7.高压消毒后烘干(2)旧的玻璃器皿的洗消： 1刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）5.烘干备用：由于高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消： 金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。橡胶和塑料： 橡胶和制品通常解决方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的解决程序： 1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注旨在超净台内取出使用时应当立即将螺旋旋紧。 2. 胶塞烘干后用2氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水解决30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（牢记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 4. 胶头可用75酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。 5.塑料培养瓶，培养板，冻存管： 6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用23周时间洗除残留的氧化乙烯。用20230100000rad的r射线消毒塑料制品效果最佳。 为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现笔迹，从而可以鉴定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC126H2o)2g，30盐酸10m1，蒸馏水88m1。 注意事项： 1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多由于其将使空气流畅受阻，会减少高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。 2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。四.细胞培养用液的配制与消毒 器材与试剂： 干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。具体环节： (1)水的制备： 细胞培养用水必须非常纯净，不具有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.(2)PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)： 1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充足溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准拟定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。 2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 (3) 胰蛋白酶溶液的配制与消毒： 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反映不同样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度导致细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克减少胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用品有血清培养液或者胰酶克制剂终止胰酶对细胞的作用。 1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4内过夜。 2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20保存以备使用。 (4)青、链霉素溶液的配制于消毒 1. 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。 2.具体操作均在超净台内完毕。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。 3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位1微克？(5).RPMI1640的制备与消毒： 1.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充足搅拌至粉剂所有溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。 2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。 3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4冰箱内待用。 5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4时两周有效）。 (6)血清的灭活： 细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56水浴中灭火30分钟后，再通过抽滤方可加入培养基中使用。 (7)HEPES溶液： HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N-a-hydroxythylpiperazine-N- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达成缓冲能力。 1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下： 准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4保存。 注意：由于现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。 (8)谷氨酰胺： 合成培养基中都具有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺少要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应当补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4下放置1周可分解50，故应单独配制，置于-20冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4冰箱中储存2周以上时，应重新加入本来的谷氨酰胺。 一般培养液中谷氨酰胺的含量为14mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充足搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 (9)肝素溶液的配制： 具有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。由于现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为 。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。 (10) 型胶原酶： 0.1型胶原酶溶液同胰蛋白酶同样配制和消毒灭菌。注意：由于型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20保存。 (11).明胶溶液： 由于明胶难于过滤，所以配制0.1明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）即解决无菌分装药品的问题。另一方面要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充足摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中，4保存。 (12)其他培养用液的配制： 20ug/ml内皮生长因子， 注意事项： 1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。 2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。 3.配制RPMI1640培养基时由于还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。 五.细胞传代培养（消化法） 具体操作： (1)传代前准备： 1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴锅内预热。2.用75酒精擦拭通过紫外线照射的超净工作台和双手。 3.对的摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作并且可减少污染。 4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观测细胞。 8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。(2)胰蛋白酶消化； 1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最佳，最佳消化温度是37。 2. 显微镜下观测细胞：倒置显微镜下观测消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表白此时细胞消化适度。 3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 (3)吹打分散细胞： 1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。(4)分装稀释细胞： 1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。2.显微镜下观测细胞：倒置显微镜下观测细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应当不低于5105/ml。最后要做好标记。 (5)继续培养： 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25时为一个，占50为，占75时为。 传代细胞培养注意事项： 1.严格的无菌操作 2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应当注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。 附：EDTA（0.02乙二胺四乙酸二钠）消化液配方： EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。 六.细胞的复苏 细胞复苏的原则快速融化：必须将冻存在-196液氮中的细胞快速融化至37，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞导致损害。具体操作 (1)实验前准备： 1.将水浴锅预热至37 2.用75酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。 3.在超净工作台中按顺序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 (2)取出冻存管： 1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。 2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。(3)迅速解冻： 1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。(4)平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min(5)制备细胞悬液： 1.吸弃上清液。2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。(6)细胞计数： 细胞浓度以5105/ml为宜。(7)培养细胞 将复合细胞计数规定的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37和5CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。初学者易犯错误： 1水浴锅未预热或者未预热到37。 2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。3.离心前忘掉平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。4.一次复苏细胞过多，忘掉更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。七.细胞计数 实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。具体操作： (1)准备工作： 取一瓶传代的细胞，按照传代细胞培养（消化法）中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。 (2)细胞悬液制备： 细胞悬液的制备方法是用0.25的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。(3)细胞计数： 1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。 2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。 3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边沿缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 4.记录四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观测，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格具有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。 5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml（四个大格子细胞数/4) 2104 说明：公式中除以4由于计数了4个大格的细胞数。公式中乘以2由于细胞悬液于染液是1：1稀释。 公式中乘以104由于计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）1.0mm（宽）0.1mm（高）0.1mm3 而 1ml1000mm3(4)细胞计数要点： 1.进行细胞计数时，规定悬液中细胞数目不低于104个/ml，假如细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中； 2.规定细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 3.取样计数前，应充足混匀细胞悬液，特别时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确； 4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。假如细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。 5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。(5)初学者易犯的错误： 1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。 2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。 3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。 (6)本实验特殊试剂的配制： 4台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4保存。使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4即可。八.细胞的冻存 1.先将冻存管放入4冰箱，约40min。 2.接着置于-20冰箱，约30-60min。 3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。 4.置于液氮罐中长期保存。 5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。 注意事项： 1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它自身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于减少冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最佳戴上手套操作。 2.不宜将冻存细胞放置在0-60这一温度范围内过久，低温损伤重要发生在这一温度区内，是“危险温区”。 3.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。细胞冻存、解冻方法与细胞计数细胞冻存、解冻方法与细胞计数一、细胞冷冻保存1.材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene5000-0020)、0.4（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)2、冷冻保存方法：（1）传统方法: 冷存管置于410分钟-2030分钟-801618小时(或隔夜)-液氮槽vaporphase长期储存。-20不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，导致细胞大量死亡，亦可跳过此环节直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微减少一些。（2）程序降温：运用已设定程序的等速降温机以-1-3/分钟之速度由室温降至（-80以下）-120，再放在液氮槽vaporphase长期储存。合用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、环节：（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处在指数生长期。（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为510），使细胞浓度为15106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，12ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为8090致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micronFGLPTelflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以510ml小体积分装，4避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在启动后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可减少细胞受损。DMSO也许引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。（4）冷冻保存之细胞浓度：normal human fibroblast:13106cells/mlhybridoma:13106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。adherent tumor lines:57106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需13106cells/mlother suspensions:510106cells/ml，human lymphocyte须至少5106cells/ml。（5）冷冻保护剂浓度为5或10DMSO，若是不拟定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。（6）冻存可用10%90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有助于细胞悬浮而少沉积（4度时），复苏存活率在80%90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞导致伤害，导致细胞之死亡。2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。3、材料37恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、环节：（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管也许爆裂之伤害。（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。（3）将新鲜培养基置于37水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。（4）取出冷冻管，立即放入37水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内所有融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:101:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入具有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理：（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm20.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。（3）存活测试之环节为dyeexclusion，运用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，假如细胞不易吸取trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完毕，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；由于台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa+/Mg+freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。3、环节：（1）取50l细胞悬浮液与50l trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。（2）取少许混合液(约15l)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观测，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。注：4大格细胞总数稀释倍数104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm0.1cm0.01cm=10-4ml计数板计数时，最适浓度为510105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。5、范例：T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；细胞数/ml：60.751042（稀释倍数）=1.22106；细胞数/flask（10ml）：1.2210610ml=12.2106存活率：225/24392.6%