一株动物源乳酸菌的胞外产物免疫原性研究_刘少杰.pdf

今日畜牧兽医1xperimental study on onlineE实验研究一株动物源乳酸菌的胞外产物免疫原性研究刘少杰1，杨红亚1，张异岗1，段美玲4，于莉莉1，张金朝1，康梓哲2，康社强2，陆 安1，3（1.石家庄九五堂生物科技有限公司 052160；2.河北诺达生物科技（赞皇）有限公司 051230；3.石家庄燕科生物科技有限公司 050200；4.青岛市市级公园管理服务中心 266033）摘要：以乳酸菌的胞外产物（ECP）为此次试验研究对象，经过对 L-2 ECP 的提取，制备 ECP 疫苗，给小鼠免疫后，通过脾淋巴细胞增殖试验、间接 ELISA 测血清 IgG 水平以及致病菌攻菌保护试验，来对L-2 ECP的免疫原性进行探究。结果表明：ECP 疫苗不仅可以刺激小鼠机体产生细胞免疫，还可以诱导产生较高水平的体液免疫，降低致病性大肠杆菌对小鼠的致死率。结论：L-2 ECP 具有较好的免疫原性，可刺激小鼠机体同时产生细胞免疫和体液免疫，对小鼠有一定的相对保护效果。关键词：乳酸菌；胞外产物；免疫原性乳酸菌作为一类能产乳酸，革兰氏阳性，兼性厌氧的益生菌，其种类繁多，被广泛应用于人的食品行业、动物饲料添加剂、日化用品以及保健品当中。乳酸菌作为消化道常在菌群之一，它与人和动物的健康息息相关1，据有关报道乳酸菌可以促进动物机体的消化吸收能力，在肠道中具有抢占作用位点从而来抑制有害菌的生长使肠道菌群达到稳定的生理活性。除此之外还有学者研究表明，乳酸菌不仅可以稳定机体的肠道微生态环境，还可以帮助机体增强免疫防御能力，激活巨噬细胞、促进淋巴细胞增殖从而提高机体的特异性和非特异性免疫，从而达到抗炎、防癌变的效果2。胞外产物（Extracellularproducts,ECP）是指细菌在培养过程中分泌出来的代谢产物和活性物质的总称3，其主要成分包括脂类、有机酸、糖类、生物碱、细菌素等，目前已有较多关于致病菌 ECP 的研究，包括大肠杆菌、巴氏杆菌、单胞菌等，研究表明 ECP 具有不同程度的致病性以及良好的免疫原性，可以为动物机体提供可靠的免疫保护屏障4，本试验以乳酸菌ECP 为试验材料，对其免疫保护效果进行评价以及作用机理进行初步探索。1 材料与方法1.1 试验材料乳酸菌分离株 L-2 分离于鸡肠道中，致病性大肠杆菌分离株 EC-CL 分离于病死狐肝脏内，L-2、EC-CL 都经基因序列比对鉴定为乳酸菌、大肠杆菌。试验动物昆明鼠，购于北京维通利华试验动物技术有限公司，试验前经过预饲养未发现异常情况。主要试剂仪器：MRS 肉汤青岛海博营养肉汤青岛海博BCA 试剂盒Thermo弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂SIGMAMTT 试剂盒碧云天（Beyotime）青链霉素双抗液SolarbioConASolarbio细胞培养板Thermo胎牛血清（FBS）Thermo1640 基础培养基Thermo红细胞裂解液Thermo超声波细胞破碎仪（HN-1000Y）上海达洛科学仪器有限公司酶标仪（Infinite M200 Pro）瑞士 TecanIX53 倒荧光倒置显微镜奥林巴斯CO2培养箱Thermo微电脑培养箱（SPX-300B-G 型）上海博讯实业有限公司医疗设备厂1.2 L-2 ECP 的提取参考文献5使用饱和硫酸铵沉淀法制备 L-2ECP。首先挑取在固体培养基上活化好的单菌落接种到 1LMRS 液体培养基中，37静置培养 24h 左右，将菌液 6500r/min 低温离心10min，收集上清液，用 0.22m 滤器过滤除菌，之后使用饱和硫酸铵 4沉淀过夜。6500r/min 低温离心 10min，留沉淀并用无菌中性 PBS 重悬，之后利用透析袋将重悬液中的硫酸铵除去，使用PEG-20000将ECP浓缩，最后对ECP进行菌检，-20备用。1.3 L-2 ECP 蛋白总含量的测定采用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒方法测定总蛋白含量。1.4 L-2 ECP 致病性检测选取健康昆明鼠 30 只，随机分成 6 组，5 个重复/组，设置 5 个试验组和 1 个对照组，试验组分别腹腔注射浓度为230g/mL2倍比稀释至14.375g/mL浓度的无菌ECP0.2mL/只，对照组注射等体积的无菌生理盐水，连续观察 1 周，记录各组小鼠的异常情况。1.5 EC-CL 半数致死量的测定挑取 EC-CL 单菌落接种于营养肉汤培养基中，37摇菌培养至对数期，10000r/min 离心 2min，弃上清，无菌生理盐水冲洗菌泥，计数菌落，调整菌液浓度从 1.6109CFU/mL10 倍比稀释至 1.6105CFU/mL，腹腔注射小鼠，5 只/组，0.2mL/只。利用寇氏法测定 EC-CL 半数致死量。1.6 L-2 ECP 蛋白疫苗的制备将 ECP 使用无菌 PBS 调整到需要的使用浓度，将 ECP 进行水浴灭活后与等体积的弗氏佐剂加入离心管中，将两种液体进行充分的搅拌震荡使其乳化，搅拌震荡 15min 左右，察看乳化效果（乳化液滴在水面不散开为宜）。小鼠第一次免疫使用弗氏完全佐剂制备疫苗。剩下两次免疫时使用弗氏不完全佐剂制备疫苗，制备方法同第一次。1.7 L-2 ECP 蛋白疫苗免疫小鼠将 50 只健康昆明母鼠，随机分为两组，25 个重复/组。分为 ECP 免疫组（a）和对照组（b）。第一次免疫：将含有基金项目：河北省引进国外智力项目“动物源乳酸菌筛选分离鉴定与替抗微生态制剂的研究”；河北省重点研发计划项目乡村振兴技术创新专项“畜禽粪污智能发酵工艺装备及高效除臭保氮菌剂的开发与应用”，项目编号 223222909D作者简介：刘少杰(1996-)，男，河北石家庄人，兽医师，硕士研究生，主要从事微生态菌株筛选与发酵研究工作通信作者：陆安(1982-)，男，河北石家庄人，高级兽医师，硕士研究生，主要从事微生态与中药科研及发酵工艺研究工作2xperimental study on onlineE实验研究60gECP 的乳化疫苗经皮下多点注射给（a）组小鼠进行疫苗免疫；（b）组小鼠皮下注射等量 PBS 与弗氏佐剂乳化的疫苗进行免疫；第一次免疫后第 14 天，使用弗氏不完全佐剂疫苗进行第二次免疫；第一次免疫后的第 3 周按照第二次免疫方法进行第三次免疫。1.8 血清采集第一次免疫前各分组随机挑选 3 只小鼠，摘眼球采血离心取血清作为对照。之后每隔 1 周各组进行一次采血取血清，3 只/组，连采 4 周。采集的新鲜血液置于 37培养箱中让其血清快速析出，2500r/min 离心 15min，取血清于无菌离心管中，-20冻存备用。1.9 脾细胞制备随机从（a）、(b)两组各取 3 只小鼠，脱颈处死，剖取脾脏用于脾细胞的制备。首先将取出的脾脏置于无菌容器中，针刺脾脏，用灭菌 PBS 将脾细胞吹出，得到细胞悬液。细胞悬液2500r/min，离心 8min，弃上清，用 1mL 细胞裂解液将沉淀重悬后再次离心，之后用 PBS 将裂解液洗脱干净，离心留沉淀，最后使用 1640 血清双抗的培养基将细胞重悬并作适当稀释，显微镜下计数脾细胞。1.10 淋巴细胞增殖试验在 96 孔细胞板中，每份脾细胞悬液重复 9 孔，100L/孔，每份细胞的前 3 孔加入 10g/mL 的 ConA10L/孔，作阳性对照组；中间 3 孔加入 10g/mL 的 ECP10L/孔，作为试验组；最后 3 孔加入单纯 1640，作为阴性对照组；37厌氧培养相中培养 3d，使用 MTT 试剂盒法，在 OD570nm 下测其吸光值，并计算刺激指数。刺激指数（SI）=（试验组 ConA 和 ECP 刺激平均 OD 值-培养液平均 OD 值）（试验组未刺激平均 OD 值-培养液平均 OD 值）。1.11 间接 ELISA 测定免疫小鼠血清 IgG 水平EC-CL 全菌蛋白制备：将 EC-CL 接种到营养肉汤平板上培养，待长出单菌落后，挑单菌落接种到 15mL肉汤液体培养基中，37震荡培养12h,3500r/min，离心10min，弃上清。用灭菌PBS对菌泥洗涤2次，15mL/次，最后用 15mLPBS 重悬菌泥，进行超声破碎，离心，将上清过滤除菌，并测定蛋白浓度，冻存备用。小鼠血清中 IgG 的测定：将制备的全菌蛋白按 1g/孔的剂量于包被液混合包被在96 孔板，100L/孔，4包被过夜，PBST 溶液对 96 孔板洗涤，重复 3 次，将 96 孔板水分拍净；使用 5%脱脂奶对 96 孔板封闭，200L/孔，4封闭过夜，PBST 溶液洗板，重复 3 次；将采集的（a）、(b)组小鼠血清与 PBST 溶液按 1：50 混匀，加到96 孔板中，100L/孔，37孵育 1h，PBST 洗板 3 次；将羊抗小鼠二抗进行 104 稀释，100L/孔，加到 96 孔板中，37孵育 1h，PBST 洗板 3 次；加入显色液，100L/孔，37避光显色 6min；加入终止液，酶标仪读取 OD450nm 吸光值。1.12 免疫小鼠对致病性大肠杆菌的保护效果观察将在平板上划线培养好的 EC-CL 单菌落，接种到 NB 液体培养基中，37培养 10h，灭菌 PBS 洗去培养基，调整菌液浓度备用。第一次免疫后第 4 周，从（a）、(b)两组中各挑选 10只小鼠，对其进行 EC-CL4 倍半数致死量的攻菌，观察 1 周，观测免疫 L-2ECP 对 EC-CL 的保护效果。2 结果2.1 L-2 ECP 蛋白总含量将制备的 ECP 使用标准蛋白质检测绘制标准曲线（图 1），测得 L-2ECP 样品蛋白浓度为 0.23g/L，-80保存，用于后续试验。图 1 蛋白标准曲线图2.2 L-2 ECP 致病性结果将单纯的 ECP 注射到小鼠腹腔，经过连续 1 周的观察，各剂量组小鼠精神状态良好（图 2），无死亡情况，原浓度注射也可以确保其安全性，表明该 ECP 符合探究其免疫原性的标准。2.3 EC-CL 半数致死量结果用 EC-CL 菌株分剂量梯度进行小鼠腹腔注射，连续观察1 周 EC-CL 菌株的致病性，并记录小鼠死亡情况。计算其半数致死量为 1.01107CFU（表 1）。表 1 EC-CL 菌株半数致死量攻菌剂量（CFU）死亡率LD50（CFU）3.21085/51.011073.21073/53.21062/53.21050/53.21040/5对照组0/52.4 淋巴细胞增殖试验L-2ECP 疫苗免疫 4 周后，（a）（b）两组随机取 3 只小鼠进行脾细胞增殖试验。由图（3）可知，在 ConA 阳性刺激试验中，均能刺激（a）（b）小鼠脾细胞的增殖，刺激指数相接近；在 L-2ECP 刺激试验中，ECP 能刺激（a）脾细胞的增殖，但刺激指数低于阳性刺激，未能刺激（b）脾细胞的增殖，说明 L-2ECP疫苗可以刺激小鼠产生一定程度的细胞免疫。图 3 小鼠脾细胞增殖试验图 2 小鼠注射 ECP 的表现今日畜牧兽医32.5 小鼠血清中 IgG由图 4 可知，免疫 L-2ECP 小鼠血清中 IgG 水平有一个明显的升高趋势，在 0 3 周抗体水平呈上升趋势，在第 4 周的血清中抗体水平虽有下降，但依然高于对照组。结果表明，免疫 L-2ECP 可刺激小鼠机体产生良好的体液免疫，且免疫后 1周就会有明显的抗体产生，第 3 周抗体水平达到最高。免疫组 对照组免疫时间抗体水平0 1周 2周 3周 4周1.61.41.210.80.60.40.20图 4 小鼠血清抗体水平2.6 对小鼠的保护效果由表 2 可知，免疫 L-2ECP 的小鼠对致病性大肠杆菌的侵袭有一定的保护作用，免疫组小鼠在 24h 出现少量死亡，而对照组在 12h 只出现精神状态差的情况，到了 24h 出现大量死亡。直到 1 周观察期结束，免疫组仍有 5 只小鼠存活，相对保护率为 50%；而对照组小鼠全部死亡，死亡率 100%。表 2 免疫小鼠保护情况12h24h36h48h7d死亡率免疫组（a）（死亡数）较为活泼（0/10）个别沉郁（3/10）精神沉郁（2/7）有所好转（0/7）无异常（0/7）50%（5/10）对照组（b）（死亡数）精神萎靡（1/10）极度萎靡（7/9）全部死亡（2/2）-100%(10/10)3 讨论胞外产物作为一种较为复杂的蛋白产物，在致病菌方面已有较多的报道称，ECP 在致病菌打破动物机体防御体系时起着关键作用，可以协同细菌增加侵袭能力，且 ECP 自身也具有一定的致病性，李永杰3等研究表明许氏平鲉注射美人鱼发光杆菌的 ECP 后会出现肝脾肿大、腹腔有血水以致死亡的现象，并且该 ECP 对小鼠 MCFS 细胞产生一定毒性作用；张志强6，葛艳7研究报道迟缓爱德华菌的 ECP 对斑马鱼、剑尾鱼具有一定的毒害作用；关于益生菌胞外产物的相关报道鲜有，益生菌本身不具有致病性，但其代谢产物分泌出来蛋白的安全性有待考证，本试验从乳酸菌入手，对 L-2 的胞外产物进行了提取并对其致病性进行了检测，发现其 ECP 对小鼠无致病性，与吴8报道的水产菌的 ECP 安全性一致。关于胞外产物的报道表明，ECP 除了具有致病性之一缺点之外，ECP 本身还具有一大优点被广大研究人员所关注，那就是它的免疫原性，本试验所采用的 L-2 菌株为乳酸菌，有大量文章报道益生菌极其代谢产物可以激活机体的免疫应答，提高机体防御能力，益生菌可以激活机体巨噬细胞、NK 细胞以及其它细胞因子从而增强机体非特异性免疫，同时还可以诱导淋巴组织分泌产生特异性抗体9。于晨龙10研究表明通过给小鼠灌服乳酸菌可以对小鼠血清中 IL-2、IL-4 和肿瘤坏死因子产生影响，并且可以改善小鼠血清 T 淋巴细胞亚群含量；邓玲玲11研究发现益生菌的代谢产物可以抑制 TGEV 在细胞内的复制，并且代谢产物可以使 IPEC-J2 细胞产生 TLR7 和 iNOS，从而提高猪对 TGEV 的抵抗能力；马春全12研究发现，雏鸡使用益生菌后能显著提高细胞免疫及体液免疫，T、B 淋巴细胞数量及增殖反应显著增高，IgG、IgA、IgM 水平提升明显；盛守新13以乳酸菌胞外多糖为疫苗佐剂，发现胞外多糖可以显著提高IgG 水平，T 淋巴细胞增殖能力也大大提高，并且以胞外多糖为佐剂可以降低小鼠感染金黄色葡萄球菌的死亡率，减轻金黄色葡萄球菌对脏器的损伤。本试验首先对 L-2ECP 的安全性进行了检测，在确保 L-2ECP 无致病性后，探究其免疫原性尤为重要，将 L-2ECP 制成亚单位疫苗来评测疫苗的免疫保护效果。结果发现，L-2ECP 疫苗既可以刺激小鼠脾细胞增殖产生细胞免疫，也可以激发小鼠的体液免疫产生较高水平的特异性抗体IgG；免疫 L-2ECP 疫苗可以为小鼠抵抗致病性大肠杆菌提供较好的保护，保护率为 50%。本试验结果与其它前期研究结果符合性高，以期为新疫苗的开发提供理论支撑，但仍有不严谨之处，如是否不同菌株都有良好的免疫保护效果，产生免疫保护效果的机理等问题都有待进一步的去探究。4 结论乳酸 L-2ECP 具有较高的免疫原性，其制备的疫苗可以有效激活小鼠机体的细胞免疫和体液免疫，为机体提供强有效的保护，使小鼠受致病性大肠杆菌的侵袭致死率显著降低。参考文献1 何江波.羊瘤胃源乳酸菌的分离筛选及其菌剂制备方法研究 D.西安:西北农林科技大学,2021.2 陈相如.微生态制剂对断奶羔羊胃肠道菌群、机体免疫和人工感染球虫的影响 D.郑州:河南农业大学,2021.3 李永杰,于永翔,王印庚,等.高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种胞外产物的毒力特性分析 J.微生物学报,2022,62(8):2995-3006.4 王洪彬.美人鱼发光杆菌胞外产物的主要生物学特性分析及免疫保护评价 D.秦皇岛:河北科技师范学院,2019.5 刘少杰.秦皇岛地区狐源大肠杆菌分离鉴定与胞外产物免疫原性研究 D.秦皇岛:河北科技师范学院,2021.6 张志强,李永慧,杨楠,等.迟缓爱德华菌胞外产物的致病性及生物活性分析 J.中国兽医学报,2018,38(11):2141-2146.7 葛艳，陈怀青，陆承平.迟缓爱德华氏菌胞外产物的细胞毒性和动物致病性 J.中国兽医学报,2000(1):34-37.8 吴秋仙,刘学伟.黄海希瓦氏菌胞外产物特性研究 J.水产养殖,2020,41(5):33-37.9 刘辉,季海峰,单达聪,等.益生菌对动物免疫机能影响的研究进展 J.饲料与畜牧,2010(11):49-51.10 于晨龙.传统乳制品中益生乳酸菌筛选及免疫调节功能的研究 D.呼和浩特:内蒙古农业大学,2014.11 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