抗SARS-CoV-2_S...gM单克隆抗体的表达及鉴定_张瑞雪.pdf

病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月抗 SARSCoV2 S 蛋白 IgM 单克隆抗体的表达及鉴定张瑞雪1，殷强玲2，黄涛1，钱振3，芜为1，王世文1，梁米芳1，孙丽娜1*，王晓芳1*（1.中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，北京 102206；2.湖北省疾病预防控制中心，武汉 430079；3.安徽医科大学 基础医学院 微生物学教研室，合肥 230032）摘要：为了寻求 SARSCoV2 IgM 抗体阳性血清质控品的替代品，本研究成功表达纯化出抗 SARSCoV2 S 蛋白IgM 单克隆抗体。研究确定了 IgM 单克隆抗体最佳表达载体为含增强子 sp163和信号肽 2的组合以及第 5d为目的蛋白收获的最佳时间。此外在研究 J链的作用时发现转染细胞时不添加 J链（nCoV163IgM3）的表达量明显高于添加 J链（nCoV163IgM3 J）时的表达量，J链对蛋白稳定性也无明显影响，且 nCoV163IgM3和 nCoV163IgM3 J抗原结合活性之间的差别无统计学意义（P0.05），nCoV163IgM3 和 nCoV163IgM3 J对本研究所检测的 WTS1、AlphaS1、BetaS1、DeltaS1、OmicronS1、BA.2S1、BF.7RBD、XBB.1S1、BQ1.1S1 等九种抗原均有结合活性，只有一株（BA.2.75RBD）逃逸。纯化后的目的蛋白经还原剂（ME）还原后显示重链分子量大小为 70kD左右，轻链分子量大小为 25kD 左右。目的蛋白均可与新型冠状病毒抗体检测试剂盒（胶体金，INNOVITA）、SARSCoV2 S蛋白 IgM 抗体酶联免疫吸附测定试剂盒（Elabscience）、抗 SARSCoV2 SRBD 蛋白人 IgM 抗体酶联免疫吸附测定试剂盒（Proteintech）等三种试剂盒反应。关键词：SARSCoV2；IgM 单克隆抗体；J链；重组蛋白中图分类号：R392.7 R373.1 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02030508DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004291截至 2022年 10月 18日，WHO 报告全球范围内已经有 622 389 418例新型冠状病毒（SARSCoV2）引发的肺炎疫情确诊病例，包括 6 548 492 人死亡，使其成为自 1918 年流感大流行以来最严重的疾病大流行。早发现、早诊断、早治疗新型冠状病毒感染（Coronavirus disease 2019，COVID19）患者是及时阻断疫情传播的关键。新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）已将血清 SARSCoV2 IgM和 IgG 抗体检测纳入确诊方法之一，血清抗体检测用作新冠病毒核酸检测的补充检测，也可用于评估疫苗接种后诱发的免疫反应。截至 2022 年 12 月 6日，全球疫苗接种已超过 130.3亿剂次，我国 89.27%的人口已完成全程接种，2.23%的人口完成一剂次接种，总计接种疫苗超过 34 亿剂次，疫苗免疫人数超过 90%1。国外一项针对 IgM 抗体的研究发现，鼻内使用 IgM 单克隆抗体可以降低 IgG 抗体产生的耐药性而提高疗效，并简化 COVID19 的预防和治疗2，说明 IgM 单克隆抗体具有更加广阔的应用前景。目前用于 SARSCoV2 IgM 检测的质控品多来源于病人血清或血浆，存在来源稀少、质量不稳定、价格昂贵等诸多问题3，故本课题旨在研究出可在细胞水平上表达的可量产、质量稳定、价格低的抗SARSCoV2 S 蛋白 IgM 单克隆抗体，以期为 IgM后续在早期诊断试剂盒及疾病治疗方面的应用奠定基础。材料与方法1 实验试剂HEK 293 细胞（源于美国典型培养物保藏中心（American Type Culture，Collection，ATCC），由本课题组保藏）；重组蛋白表达 293细胞无血清悬浮转染试剂盒（购自辰风仪器有限公司）；KOP293Ex无血 清 细 胞 培 养 液（购 自 辰 风 仪 器 有 限 公 司）；HiTrapTM IgM 纯化 HP 色谱柱（购自 Cytiva 公司）；新型冠状病毒抗体检测（胶体金）试剂（购自英诺特公司）。收稿日期：20221028；接受日期：20230131作者简介：张瑞雪（1996），女，从事抗体免疫、传染病检测及预防研究，Email：*通讯作者：孙丽娜（1978），女，研究员，从事基因工程抗体方向研究，Email：；王晓芳（1971），女，研究员，从事传染病预防控制工作，Email：开放科学（OSID）病 毒 学 报39卷2 重组抗体基因获得与表达载体的构建从 NCBI数据库获取人 IgM 重链和 Kappa 轻链恒定区基因序列，nCoV163IgM 重链和 Kappa 轻链可变区基因序列来源于课题组前期通过噬菌体抗体库技术筛选的 nCoV163（F163）IgG 抗体可变区，其抗原表位是 S蛋白的 S1RBD 区域4。先将恒定区基因序列通过酶切位点克隆到载体 pcDNA3.4中，再在可变区基因序列前添加不同的信号肽和增强子后克隆到含恒定区序列的载体中。目的基因全序列设计如下：酶切位点 1增强子信号肽IgG 重/轻链可变区人 IgM 重/轻链恒定区终止子酶切位点 2。三种不同表达载体的设计区别见表 1。全部基因序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。3 细胞培养与转染使用 KOP293Ex 无血清细胞培养液正常培养HEK 293 细胞，原始细胞传代至 1020 代可用于细胞蛋白表达。转染前观察细胞状态，使用细胞计数仪计数并稀释至细胞密度为 2106，且活率大于98%时可进行细胞转染。按照重组蛋白表达 293细胞无血清悬浮转染试剂盒说明书，稀释质粒与 TA293 以 1：6 的质量体积比混合室温孵育 10 min 后转染细胞，37培养 24 h 后加入 KE293（HEK 293 细胞蛋白表达增强剂）和 KTFeed（瞬时蛋白表达营养添加剂）。每 24 h 观察细胞状态记录细胞数量和细胞活率，并留样保存。直至细胞活率降至 50%以下，且蛋白表达量无明显上升时收获细胞上清。4 目的蛋白的检测采 用 双 抗 体 夹 心 法 酶 联 免 疫 吸 附 试 验（ELISA）检测细胞上清表达量。首先用抗 链抗体（200 ng/孔，每孔 100 L）包被酶标板，4过夜孵育；次日用洗涤缓冲液（PBST）洗涤 3 次后，每孔加入 250 L PBS 溶 解 的 5%脱 脂 奶，37 封 闭 1h，PBST 洗板 3 次；加入梯度稀释的目的 IgM 单克隆抗体 50 L（空白质粒转染的细胞上清做阴性对照）和新鲜稀释的酶标抗体（抗人 IgMHRP）50 L 于上述已包被的反应孔中，37孵育 1h，PBST 洗板 5次；各反应孔中加入现配的 TMB 底物溶液 100 L，暗反应 10min后加入 2 mol/L 的硫酸终止液终止反应，使用酶标仪读取吸光度值（450 nm）。采用间接法 ELISA 检测蛋白的结合活性。首先用 SARSCoV2 S1蛋白或 RBD 蛋白（200ng/孔，每 孔 100 L）包 被 酶 标 板，4过 夜 孵 育；次 日 用PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 250 L PBS 溶解的5%脱脂奶，37封闭 1h，PBST 洗板 3次；加入梯度稀 释 的 目 的 IgM 单 克 隆 抗 体 100 L 37 孵 育30min，PBST 洗板 5 次；加入新鲜稀释的酶标抗体（抗人 IgMHRP）100 L 于上述已包被的反应孔中，37孵育 30min，PBST 洗板 5 次；各反应孔中加入现配的 TMB 底物溶液 100 L，暗反应 10 min 后加入 2 mol/L 的硫酸终止液终止反应，使用酶标仪读取吸光度值（450 nm）。5 蛋白纯化向含有 IgM 抗体的细胞上清中加入硫酸铵（最终浓度为 0.8M）后使用 0.45 m 的滤膜过滤。同时用结合缓冲液（20 mM 磷酸钠，0.8 M 硫酸铵，pH 为7.5）平衡 HiTrapTM IgM 纯化 HP 色谱柱，将过滤后含有硫酸铵的蛋白上清上样至少过柱三次，再用结合缓冲液洗平基线平衡色谱柱，之后用洗脱缓冲液（20 mM 磷酸钠，pH 为 7.5）洗脱目的蛋白。使用紫外分光光度计检测目的蛋白含量，并通过聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳（SDSPAGE）检测蛋白纯度及表达水平。6 试剂盒鉴定购入新型冠状病毒抗体检测试剂盒（胶体金，INNOVITA）、SARSCoV2 S 蛋白 IgM 抗体酶联免疫吸附测定试剂盒（Elabscience）、抗 SARSCoV2 SRBD 蛋白人 IgM 抗体酶联免疫吸附测定试剂盒（Proteintech）等三种试剂盒，按照其说明书鉴定此次研究表达出的 IgM 单克隆抗体，观察并记录反应结果。表 1三种不同表达载体的设计区别Table 1Design differences of three different expression vectorsNamenCoV163IgM1nCoV163IgM2nCoV163IgM3DesignKozak+signal peptide 1+nCoV163 heavy/light chain variable region+hIgM heavy/light chain constant regionKozak+signal peptide 2+nCoV163 heavy/light chain variable region+hIgM heavy/light chain constant regionSp163+signal peptide 2+nCoV163 heavy/light chain variable region+hIgM heavy/light chain constant region注：a.信号肽 1：MKWVTFISLLFLFSSAYS；b.信号肽 2：MGWSCIILFLVATATGVHS。Notes：a.signal peptide 1：MKWVTFISLLFLFSSAYS；b.signal peptide 2：MGWSCIILFLVATATGVHS.3062期张瑞雪，等.抗 SARSCoV2 S蛋白 IgM 单克隆抗体的表达及鉴定结 果1 IgM 单克隆抗体最佳表达载体的确定三种载体之间增强子和信号肽的不同，导致细胞上清中的蛋白表达量存在明显差异。nCoV163IgM1 和 nCoV163IgM2 只有信号肽不同，结果显示 nCoV 163IgM2 的 细 胞 上 清 表 达 量 更 高，而nCoV163IgM2 和 nCoV163IgM3 之间只有增强子不相同，结果 nCoV163IgM3细胞上清中的蛋白表达量比 nCoV163IgM2 高（图 1A）。综合以上结果确定含 sp163 和信号肽 2 的组合为 IgM 单克隆抗体的最佳表达载体。2 J链对目的蛋白表达量的影响为确定 J 链对目的蛋白表达量的影响，本研究 在 转 染 细 胞 时 设 置 两 组 实 验，nCoV163IgM3组（重链：轻链=11）和 nCoV163IgM3 J 组（重链：轻 链：J 链=10101），结 果 显 示 nCoV163IgM3 组 细 胞 上 清 中 蛋 白 表 达 量 明 显 高 于 nCoV163IgM3 J 组，前 者 稀 释 至 8 000 倍 依 旧 可 以 检测 到，后 者 稀 释 至 1 000 倍 时 方 可 检 测 到（图 1B）。3 转染后细胞培养状态监测结果及每天产量监测转染细胞后每日监测其状态，包括细胞数量和活率，并留取样本。发现细胞数量在第 5 d达到最高峰，细胞活率也在第 5 d 下降至 50%左右（图 2A），继续培养至第 7 d时细胞活率下降至 30%。采用双抗体夹心法 ELISA 和 SDSPAGE 实验检测每日留取的样本上清，结果均显示随着天数增加，目的蛋白表达量逐渐增加（图 2B）；另外 SDSPAGE 结果显示随着天数增加，除目的蛋白外杂蛋白的表达量也增加。综合以上结果，最终确定第 5 d为细胞上清中目的蛋白收获的最佳时间。4 蛋白稳定性检测结果设置两组对照实验，检测 J 链对蛋白稳定性的影响。第一组实验在收获后细胞上清后、收获后第7 d、第 14 d 和第 56 d 分别测定在不同条件下保存5（40，反复冻融 1、3、15 次，4，室温，37）的nCoV163IgM3和 nCoV163IgM3 J细胞上清的活性。结果显示短期保存条件对抗体活性的影响没有显 著 性 差 异（P0.05），同 时 nCoV 163IgM3 和 nCoV163IgM3 J相比，J链的存在并未对表现出能够提高抗体的短期稳定性（图 3A、图 3B）。在上组实验结果的基础上设置第二组实验，以 37为起点，3为梯度，共设置六个温度梯度（3752），将nCoV163IgM3和 nCoV163IgM3 J上清各自稀释100倍后检测其在不同温度保存 5h后的活性以确定温度稳定性（4保存的样本为对照）。结果显示随着温度上升，nCoV163IgM3 和 nCoV163IgM3 J抗体的活性没有明显变化，均在一定范围内波动，52保存 5 h的抗体活性与 4对照相当，说明 J链在温 度 稳 定 性 的 测 试 中 也 没 有 发 挥 增 强 作 用（图 3C）。5 蛋白纯化结果使用 AKTA 蛋白纯化系统纯化目的蛋白后，SDSPAGE 鉴定纯化结果证明 HiTrapTM IgM 纯化图 1细胞上清中的蛋白表达量注：A.不同载体的细胞上清蛋白表达量；B.J链对细胞上清蛋白表达量的影响Figure 1Protein expression level in cell supernatantNotes：A.Protein expression level in cell supernatant with different vectors；B.Effect of J chain on protein expression level in cell supernatant 307病 毒 学 报39卷HP 色谱柱 对 IgM 单 克 隆 抗 体 具 有 富 集 作用，纯度90%。nCoV163IgM3和 nCoV163IgM3 J经还原剂（巯基乙醇，ME）还原后显示重链分子量大小为 70kD左右，轻链分子量大小为 25kD左右；对照 IgG 还原后重链分子量大小为 55kD 左右，轻链分子量大小为 25kD 左右，符合预期结果；变性非还原电 泳 结 果 显 示 对 照 IgG 抗 体 为 单 体，分 子 量 在150kD 左右；而 nCoV163IgM3 和 nCoV163IgM3 J因分子量较大而聚集在加样孔处无法进入蛋白分离胶（图 4A）。使用紫外分光光度计定量，换算后nCoV 163IgM3 单 克 隆 抗 体 产 量 为 50mg/L 和 nCoV163IgM3 J单克隆抗体产量为 15mg/L。6 纯化后 IgM 抗体与新冠变异株抗原结合活性验证用 SARSCoV2 WTS1、AlphaS1、BetaS1、Delta S1、Omicron S1、BA.2 S1、BF.7 RBD、BA.2.75RBD、XBB.1S1、BQ1.1S1 等抗原包被ELISA 板，间接法检测 nCoV163IgM3 和 nCoV163IgM3 J的抗原结合活性。发现在十种不同抗原中，nCoV163IgM3 和 nCoV163IgM3 J 除了对BA.2.75RBD 无结合活性外，对其他九种抗原均有结合活性（图 4B、图 4C），同时 t检验结果显示 nCoV163IgM3 和 nCoV163IgM3 J 的对相同抗原结合活性之间的差别均无统计学意义（P0.05），即说明J链不影响抗体的结合活性。7 试剂盒鉴定结果将 nCoV163IgM3和 nCoV163IgM3 J梯度稀释后与新型冠状病毒抗体检测试剂盒（胶体金，INNOVITA）反应，结果显示目的蛋白均与检测卡中 的 IgM 反 应；而 不 与 IgG 反 应，因 而 确 定 其 为 图 2目的蛋白最佳收获时间注：A.细胞数量及活率；B.每日细胞上清蛋白表达量Figure 2Optimal harvest time of target proteinNotes：A.Cell number and viability；B.Daily protein expression level in cell supernatant图 3细胞上清中蛋白的稳定性注：A.不同保存条件对 nCoV163IgM3稳定性的影响；B.不同保存条件对 nCoV163IgM3 J稳定性的影响；C.温度稳定性Figure 3Protein stability in cell supernatantNotes：A.Effect of different storage conditions on the stability of nCoV163IgM3；B.Effect of different storage conditions on the stability of nCoV163IgM3 J；C.Temperature stability 3082期张瑞雪，等.抗 SARSCoV2 S蛋白 IgM 单克隆抗体的表达及鉴定SARSCoV2 IgM 特异性抗体，稀释到 1g/mL 时检 测 卡 中 IgM 检 测 孔 仍 能 显 示 出 条 带，稀 释 到0.1g/mL 时则检测不出（图 5A）。SARSCoV2 S蛋 白 IgM 抗 体 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 试 剂 盒（Elabscience）鉴 定 结 果 显 示 nCoV 163 IgM3 和nCoV163IgM3 J 均可与包板的 S 蛋白反应，其中nCoV163IgM3稀释到 62.5ng/mL 时及 nCoV163IgM3 J 稀释到 31.75ng/mL 时的 OD 值与阳性对照相当（图 5B）。抗 SARSCoV2 SRBD 蛋白人 IgM抗体酶联免疫吸附测定试剂盒（Proteintech）鉴定结果显示 nCoV163IgM3和 nCoV163IgM3 J均可与SRBD 蛋白反应，且 nCoV163IgM3、nCoV163IgM3 J 及试剂盒中的阳性质控品之间的差异无统计学意义（P0.05）（图 5C）。图 4纯化 IgM 功能鉴定注：A.SDSPAGE结果：1、2 及 3 的 loading buffer中未加还原剂 ME，4、5及 6 的 loading buffer中添加还原剂 ME，1和 4为 nCoV163IgM3，2和 5为 nCoV163IgM3 J，3和 6为 IgG抗体对照；B.nCoV163IgM3抗原结合活性验证结果；C.nCoV163IgM3J抗原结合活性验证结果Figure 4Purified IgM functional qualificationNotes：A.SDSPAGE results：reducing agent ME was not added in loading buffer of 1，2 and 3，reducing agent ME was added in loading buffer of 4，5 and 6，1 and 4 were nCoV163IgM3，2 and 5 were nCoV163IgM3 J，3 and 6 were IgG antibody control；B.The results of the nCoV163IgM3 antigenbinding activities；C.The results of the nCoV163IgM3 J antigenbinding activities图 5试剂盒鉴定结果Figure 5 Identification results of test kits注：A.新型冠状病毒抗体检测试剂盒（胶体金，INNOVITA）；B.SARSCoV2 S蛋白 IgM 抗体酶联免疫吸附测定试剂盒（Elabscience）；C.抗SARSCoV2 SRBD蛋白人 IgM 抗体酶联免疫吸附测定试剂盒（Proteintech）Notes：A.2019nCoV Ab Test（colloidal gold，INNOVITA）；B.SARSCoV2 Spike Protein IgM ELISA Kit（Elabscience）；C.AntiSARSCoV2 SRBD protein Human IgM ELISA Kit（Proteintech）309病 毒 学 报39卷讨 论呼吸道飞沫传播是 SARSCoV2 最主要的传播途径6，是社区、医院等聚集性疫情暴发的主要原因，此外还可通过气溶胶传播7和接触传播8等。人群对 SARSCoV2 具有普遍易感性，早诊断、早隔离 COVID19患者和 SARSCoV2无症状感染者可以及时阻断疫情传播，保护人们的身体健康。临床针对 SARSCoV2 的检测方法主要包括实验室核酸检测和血清特异性抗体检测。核酸检测受实验室检测条件、实验操作人员技术、检测时间等多方面的限制，而血清抗体检测具有操作简单、技术要求低、出结果时间快等优点，成为核酸检测的重要补充9。由于 IgM 抗体是病原体感染人体后免疫系统出现最早的抗体10，检测 IgM 抗体有助于确定感染发生的时间，血清 SARSCoV2 IgM 抗体阳性时提示可能有急性感染的存在11。目前国内针对新冠的疫苗接种已经覆盖良好，疫苗接种后及时评估群体免疫水平对调整疫情防控策略具有指导性意义，血清抗体滴度则是疫苗免疫效果的重要指标，IgM 单克隆抗体亦可在评估疫苗免疫效果时提供对照。本研究前期根据增强子和信号肽的不同设计了三种 IgM 单克隆抗体表达载体，增强子可增加基因转录的频率，信号肽引导新合成的蛋白向分泌通路转移12，二者均可增加重组蛋白表达量。研究发现含有增强子 sp163 和信号肽 2 的表达载体目的蛋白产量最高。实验过程中通过对细胞状态的观察及细胞上清目的蛋白每日表达产量的监测，最终确定第5 天为目的蛋白最佳收获时间。IgM 抗体单体形式的分子量约为 190kD，其重链分子量约为 70kD，轻链分子量约为 25kD；人体内分泌的 IgM 抗体有两种存在形式含有 J 链的五聚体（分子量为 900kD 左右）和不含有 J 链的六聚体（分子量为 1 050kD 左右）13。本研究还发现，转染细胞时添加 J链会降低目的蛋白的表达量，与国内杜等人的研究结果相符14；但是在不同保存条件稳定性和温度变化稳定性的检测中，nCoV163IgM3 和 nCoV163IgM3 J稳定性测试结果相当，J 链的存在并未提高目的蛋白的稳定性，且纯化后的 nCoV163IgM3和 nCoV163IgM3 J 抗原结合活性没有显著性差异，故本研究认为转染细胞表达 IgM 单克隆抗体的过程中可不添加 J链；但是由于重链，轻链，J链均在细胞内单独表达，细胞转染的效率和细胞的状态等均可能对蛋白表达的效果产生影响，关于 J 链的具体作用还需进一步研究。由于 nCoV163IgM 的抗体可变区来源于 nCoV163（F163）IgG 抗体，故本研究中的IgM 单克隆抗体所针对的抗原表位和 F163 抗体相同，为 SARSCoV2 S 蛋白的 S1RBD 区域，该位置在 SARSCoV2 中不保守，但在检测的十种抗原中只有一株（BA.2.75RBD）逃逸，对其他九种抗原尤其北京本轮疫情暴发的 Omicron BF.7 RBD 抗原有很强的结合活性。本研究构建了 IgM 单克隆抗体表达载体，成功表达纯化出抗 SARSCoV2 S 蛋白 IgM 单克隆抗体，可作为血清 SARSCoV2 IgM 检测的质控品在体外诊断中发挥作用，同时为体外 IgM 单克隆抗体的表达提供了思路，也为 IgM 抗体的在疾病治疗方面的应用奠定了基础。参考文献：1 Our World in Data.Coronavirus（COVID 19）Vaccinations DB/OL.（2022 12 07）.https：/Ourworldindata.Org/CovidVaccinations.2 Ku Z，Xie X，Hinton P R，Liu X，Ye X，Muruato A E，Ng D C，Biswas S，Zou J，Liu Y，Pandya D，Menachery V D，Rahman S，Cao Y，Deng H，Xiong W，Carlin K B，Liu J，Su H，Haanes E J，Keyt B A，Zhang N，Carroll S F，Shi P，An Z.Nasal Delivery of an IgM Offers Broad Protection From SARS CoV 2 VariantsJ/OL.Nature，2021，595（7869）：718 723.DOI：10.1038/s41586021036732.3 张括.人兔嵌合型抗弓形虫 Igm 抗体基因库的构建和抗弓形虫 Igg抗体参考物质的研究 D：北京协和医学院，2016.4 Qu Y，Zhang X，Wang M，Sun L，Jiang Y，Li C，Wu W，Chen Z，Yin Q，Jiang X，Liu Y，Li C，Li J，Ying T，Li D，Zhan F，Wang Y，Guan W，Wang S，Liang M.Antibody Cocktail Exhibits Broad Neutralization Activity Against SARS CoV 2 and SARS CoV 2 VariantsJ/OL.Virologica Sinica，2021，36（5）：934 947.DOI：10.1007/s12250021004094.5 Draber P，Draberova E，Novakova M.Stability of Monoclonal IgM Antibodies Freeze Dried in the Presence of TrehaloseJ/OL.J Immunolo Methods，1995，181（1）：37 43.DOI：10.1016/0022 1759（94）00326r.3102期张瑞雪，等.抗 SARSCoV2 S蛋白 IgM 单克隆抗体的表达及鉴定6 罗丹，王霆，谭忠元，郭珊，余志，刘艳，张源，王宝香，高源，王汉中，梅红，郑振华.新型冠状病毒-从基础研究到临床 J.中国科学：生命科学，2021，51（11）：15081522.7 Eslami H，Jalili M.The Role of Environmental Factors to Transmission of SARS CoV 2（COVID 19）J/OL.AMB Express，2020，10（1）：92.DOI：10.1186/s13568020010280.8 van Doremalen N，Bushmaker T，Morris D H，Holbrook M G，Gamble A，Williamson B N，Tamin A，Harcourt J L，Thornburg N J，Gerber S I，LloydSmith J O，de Wit E，Munster V J.Aerosol and Surface Stability of SARSCoV2 as Compared with SARSCoV1 J/OL.N Engl J Med，2020，382（16）：15641567.DOI：10.1056/NEJMc2004973.9 中华人民共和国国家卫生健康委员会.新型冠状病毒肺 炎 防 控 方 案（第 九 版）EB/OL.（2022 06 28）.Http：/Www.Gov.Cn/Xinwen/2022 06/28/5698168/Files/9585944023424F45a4B4D522B5F5C034.Pdf J.10曹雪涛.医学免疫学 M.北京：人民卫生出版社，2018：3536.11王玉珀，任丽萍，张明霞.新型冠状病毒 IgM 和 IgG 抗体检测结果分析及抗体数值变化监测 J.中国药物与临床，2021，21（06）：10211022.12Ramezani A，Mahmoudi M 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230032，China）Abstract：In order to create a substitute for the positive serum control of SARS CoV 2 IgM antibody，a monoclonal IgM antibody against SARSCoV2 S protein was successfully expressed and purified in this study.The optimal expression vector for IgM monoclonal antibody was determined to be a combination containing enhancer sp163 and signal peptide 2.The fifth day of culture was the optimal time for target protein harvest.In addition，when investigating the effect of J chain，this study found that the expression level of transfected cells without J chain（nCoV163IgM3）was significantly higher than that with J chain（nCoV163IgM3 J），and J chain showed no significant effect on protein stability.There was no significant difference on antigenbinding activity between nCoV163IgM3 and nCoV163IgM3 J（P0.05）.Both nCoV163IgM3 and nCoV163IgM3 J showed antigenbinding activity against nine antigens tested in this study，including WTS1，AlphaS1，BetaS1，DeltaS1，OmicronS1，BA.2S1，BF.7RBD，XBB.1S1，and BQ1.1S1，but only one strain（BA.2.75RBD）escaped.The target protein showed the heavy chain molecular weight was about 70 kD and the light chain molecular weight was about 25 kD after reduction with reducing agent（ME）.The target protein can react with three new coronavirus antibody detection kits，including 2019nCoV Ab Test（colloidal gold，INNOVITA）、SARSCoV2 Spike Protein IgM ELISA Kit（Elabscience）and AntiSARSCoV2 SRBD protein Human IgM ELISA Kit（Proteintech）.Key words：SARSCoV2；IgM monoclonal antibody；Jchain；recombinant protein Corresponding authors：SUN Lina，Email：；WANG Xiaofang，Email： 312