基于自噬和铁死亡基因的肾透明细胞癌预后模型的建立和验证.pdf

基金项目：安徽省卫生健康委科研项目（）；安徽省省级大学生创新创业训练项目（）；安徽省高校科学研究重点项目（）；国家级大学生创新创业训练项目（）通讯作者：陈冰【基础医学】基于自噬和铁死亡基因的肾透明细胞癌预后模型的建立和验证李玉琦，罗倩，况云舒，梁 箫，卢广涛，朱晓群，陈冰（皖南医学院病理教研室，安徽 芜湖 ）摘要 目的：建立基于自噬和铁死亡相关基因的预后模型，并基于肾透明细胞癌（）的自噬基因（，）和铁死亡基因（，）模型评估预后。方法：通过癌症基因组图谱（）数据库中的 数据集识别与风险相关的 和 ，进行功能富集和肿瘤分型分析，通过单变量和多变量 回归建立 例患者的预后风险模型。多指标 用于评估模型的准确性。最后使用 数据集验证。结果：共发现 个差异表达的基因。单变量和多变量 回归确定了 个与 相关的风险相关基因：、。生存分析显示，高危组患者生存率较低，多指标 曲线下面积 ，说明模型预测准确率较高。然后基于 算法进行免疫细胞浸润评估。结论：基于 个 和 的肾透明细胞癌相关基因预后模型具有一定的准确性，可更准确地指导临床治疗。关键词 自噬；铁死亡；预后；肾透明细胞癌；免疫浸润 ：，（，）：（）（）（），：，：年第 卷第 期 ，（），：；肾细胞癌是全球最常见的肿瘤之一，发病率占所有癌症的 ，年死亡率占全球癌症死亡人数的 。其中，肾透明细胞癌（，）为肾癌最常见的类型，其比例约占 。目前，的主要危险因素包括吸烟、高血压、肥胖、药物以及其他因素 。靶向治疗和新型免疫药物治疗是当今肾透明细胞癌治疗的有效方式，尽管 的治疗前景正在发生变化 ，目前对于肾透明细胞癌预后的靶点及免疫疗法已被不断研究 ，但 的预后较差和转移后生存率下降的问题仍然未解决，需要更准确的预后模型来帮助医生更好地治疗和提高预后。自噬是一种在细胞面对致死压力时的保护机制，在自噬过程中，细胞形成自噬体使细胞分解代谢并循环利用有害成分维持营养和能量的稳态 。自噬在癌症的发生发展中至关重要，自噬可以在多个方面导致肿瘤的发生 。有研究表明：自噬具有双重作用，可以促进肿瘤的发生，并且自噬也是肿瘤抑制机制 。抑制自噬可以有效治疗肾细胞癌 ，并且一些药物对于治疗诱导自噬介导的肾癌细胞死亡也具有良好效果 。铁死亡可以调控细胞死亡，特征在于其的铁依赖积累的一种形式的脂质氢过氧化物致死水平 。越来越多的证据表明，铁死亡的诱导有助于多种形式癌症的抗癌治疗 ，其中包括肾细胞癌，索拉非尼是一种铁死亡诱导剂，它对于肾细胞癌的治疗具有一定的临床有效性 。然而铁死亡在肿瘤预后作用仍有待阐明。近年来，通过自噬基因（，）和 铁 死 亡 基 因（，）的角度来研究 的研究仍然不足。因此我们从人类自噬数据库（，）和铁死亡数据库（，）中找出所有相关基因的资料，通过癌症基因组图谱（，）数据库分析 、与预后的相关性，并在基因表达综合数据库（，）对其进行验证，从中筛选并建立可以独立预测 患者预后的多基因预后模型，从而为 的防治提供一定的理论参考。资料与方法 研究资料为了确定 患者预后的 和 ，我们从肿瘤基因组图谱（）数据库中下载了肾透明细胞癌患者的转录组数据和临床信息。在 数据库下载的转录组数据中表达的 个基因中，根据 数据库中包含的自噬基因，从中筛选出了 个自噬相关基因，根据 数据库中包含的铁死亡基因，筛选了 个铁死亡相关基因，除去重复获得的 个基因，我们共获得了 个自噬和铁死亡相关基因。例 患者的临床数据具有完整的生存信息，见表 。同时，从 （：）下载了一个微阵列数据集 ，其中包括 例患者的相应临床信息用于外部验证（表 ），微阵列数据的归一化表达矩阵可以直接从数据集中下载。探针也使用数据集中的相应注释文件进行注释。无监督聚类及亚组生存分析鉴于 有多种分型，且不同分型的预后不同，我们采用了共识聚类技术，在 中实现了 方法，并通过新的功能和可视化对其进行了扩展，包 年第 卷第 期 括项目跟踪、项目共识和集群共识图 。基于这 个基因的综合表达，我们使用 软件包对 个肿瘤样本进行了不同的亚组识别，并使用主成分分析来验证分组结果。然后进行了 生存分析和临床相关性分析。表 数据库中 例肾透明细胞癌患者的临床特征临床特征（）临床特征（）年龄（）（）（）（）（）性别男 （）（）女 （）（）阶段 （）（）（）（）（）（）（）（）分级 （）（）（）（）表 数据库中 例肾透明细胞癌患者的临床特征临床特征（）临床特征（）年龄（）（）（）（）（）生存存活 （）（）死亡 （）（）阶段 （）（）（）（）（）（）（）（）预后风险模型的构建用单因素 回归模型和 回归分析找出预后相关的风险基因，然后将确定的相关参数纳入多因素 回归模型，以确定 患者的预后参数，获得的预后参数用于构建风险评分模型，计算患者的风险值并确定评分，将 患者分为低风险组和高风险组，使用 （）曲线分析高风险组和低风险组生存差异并进行可视化，根据风险评分然后纳入多因素 回归模型。利用 曲线对预后模型的准确性进行研究，（）曲线可以比较曲线下面积作为模型优劣的指标。数据集验证利用外部验证集验证 中多基因预后模型的预测能力和适用性。根据训练集构建的预后模型，从而得出每个患者的预后评分，根据预后评分做出 、年 曲线，根据 年 曲线的最佳截止点将患者分为高风险组和低风险组，使用 生存分析来验证预后特征。免疫细胞浸润评估 （：）是 等人开发的一种分析工具，使用基因表达数据来估计混合细胞群中成员细胞类型的丰度 。在 中，一个由 个基因组成的白细胞基因特征矩阵被称为 ，用于区分 种免疫细胞类型，包括幼稚 细胞、记忆 细胞、浆细胞、细胞、幼稚 细胞、静息记忆 细胞、活化的记忆 细胞、滤泡辅助 细胞、细胞调节（）、细胞、静息 细胞、活化的 细胞、单核细胞、巨噬细胞 、巨噬细胞 、巨噬细胞 、静息树突状细胞、活化树突状细胞、静息肥大细胞、活化肥大细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。我们利用 来估计 种免疫细胞类型在高风险组和低风险组之间的分数。统计分析肾透明细胞癌差异表达基因在分析时 用 检 验 方 法，筛 选 标 准 为：，筛选预后相关的自噬基因用单因素和多因素 分析，用 曲线分析预后的相关性。为差异具有统计学意义。预测价值较为准确。结果 差异表达的 和 从 数据库下载了 个正常样本和 个肿瘤样本的 转录数据，使用 和 共鉴定出 个相关基因，然后进行差异分析。以 ，为标准，在肾透明细胞癌和正常组织中筛选出了 个差异基因，包括 个下调基因和 个上调基因（图 ）。图 显示在 和正常样品中 个差异表达的 和 的表达情况；表 分别显示自噬相关基因和铁死亡相关基因的相关关系。年第 卷第 期 图 差异表达基因火山图、热图、箱线图注：和正常组织相关基因的差异表达。（）火山图中有 个相关的差异表达基因，红色代表上调的基因，绿色代表下调的基因，黑色代表无显著差异的基因；（）分析中 差异表达的 个相关基因，并与正常组织样本进行比较。红色为高表达，绿色为低表达。（）和正常样本中 个相关基因的表达概况，红色方框图代表肿瘤组织样本，绿色方框图代表正常样本表 筛选出的 个差异基因分别在自噬和铁死亡中的相关关系筛选的策略基因名自噬和铁死亡基因集共有的基因 从自噬基因集中筛选出（不属于铁死亡）的基因 从铁死亡基因集中筛选出（不属于自噬）的基因 肿瘤分型分析基于相关基因表达水平，使用 包确定了 例肿瘤样本的不同亚群。并计算了聚类共识和项共识结果。输出显示 （）个子组（图 ），发现 是最适合的。根据最稳定的 值将所有患者分为两个亚组。见图 所示，两个亚群表达水平大致相同，横轴表示第一主分量，纵轴表示第二主分量。主成分分析表明，亚群可以聚在一起，亚群也 年第 卷第 期 可以聚在一起。这些结果表明我们的分组是准确的。根据 图显示，亚群生存率均在下降，且 检验显示两个子类的差异有统计学意义（）。图 肿瘤分型及主成分分析图注：患者的共识聚类分析。（）的 曲线；（）当 时，曲线下面积的相对变化；（）对于 的共识矩阵；（）和 的主成分分析；（）两个子群的 生存图 识别预后相关的 和 为了确定 和 在 中的预后意义，我们分析了 个差异表达的基因与总生存期（）之间的关系。首先，使用单变量 回归模型确定了 个预后相关基因的表达水平与 相关，为了进一步确定与 患者预后显著相关的 个基因，使用 回归获得最佳 值并获得 个预后基因（图 ）。最后进行多变量 回归分析，构建可有效预测 患者预后的预后模型。结果显示，有 个预后相关的基因具有潜在危险因素：，（图 ）。对于 个预后相关的基因的分析结果见表 。根据这 个基因的表达水平计算每个患者的风险评分。它们的表达式为：（）（）（）（）（）（）（）（），然后制作 曲线（图 ），根据 曲线的最佳截断点将患者分为高危组和低危组进行分析。曲线显示，高危组的生存概率明显低于低危组（图 ）（）。根据风险值分析 的时间和状态（图 ），图 显示了 患者高危组和低危组预后相关基因的表达情况。然后使用单变量和多变量 回归分析患者临床特征与 和 之间的相关性。单变量 回归分析显示 ，与 患者的 相关（），见图 。但在多变量 回归分析中（图 ），只有 和 与 患者的 相关（）。基于多变量 分析的结果，构建了一个列线图（图 ）来预测 、和 年的生存概率。表 多因素 分析出的 个风险相关基因的结果 值 年第 卷第 期 图 回归分析，值误差验证，多因素 森林图，曲线及 曲线注：（）模型中调整参数选择的交叉验证；（）个基因的 系数分布；（）预后相关参数的多因素 回归分析结果森林图；（）根据表达量分析出的 年生存率 曲线；（）（）曲线显示高危组生存率低于低危组图 预后模型曲线图及单因素 、多因素 森林图及列线图注：（）风险评分与患者生存结果的分布；（）显示种风险相关 和 表达概况的热图。单因素和多因素独立预后分析：（）单因素和（）多因素 回归分析显示，预后风险评分与 独立相关（）；（）诺模图显示根据各性状对应的评分可以预测生存率 基于预后相关基因的模型预测效率及验证多指标 曲线用于评估风险模型在 患者临床预后中的有效性。风险评分的 ，表明它具有竞争力（图 ）。为了验证基因预后特征的预测能力，使用 作为外部验证集（）来评估，结果显示，验证集的 生存曲 年第 卷第 期 线显示高危组的预后比低危组更差（图 ），分析显示，验证集 的 表现为 （图 ）。综上所述，基因预后特征在预测 患者的 方面表现良好。图 的各项指标 曲线，生存曲线，及 、年生存率 曲线注：多指标 曲线的预后分析，被认为有意义。（）；（）；（）；（）的 ，因此可以被筛选出来；（）验证集 （）曲线；（）验证集的 生存曲线 风险评分与免疫细胞浸润的关系进一步分析了预后模型与免疫细胞浸润的相关性，使用了 方法结合 特征矩阵，图 总结了在训练组和验证组中，低风险和高风险肾透明细胞癌中免疫浸润的相对比例，图 反映了训练组风险高的患者在树突状细胞，巨噬细胞 ，肥大细胞的比例较高，浆细胞，滤泡辅助性 细胞，调节性 细胞中比例较低。上述结果表明相关风险评分可能与各种免疫抑制状态有关。见图 。图 免疫浸润箱线图注：（）训练组中高低风险组免疫浸润的相对比例；（）验证组中高低风险组免疫浸润的相对比例；（）训练组中高低风险组在树突状细胞、巨噬细胞 、肥大细胞、浆细胞、滤泡辅助性 细胞，调节性 细胞的表达比例 年第 卷第 期 讨论有研究表明，自噬能参与多个信号通路，从而影响肾透明细胞癌的发展 。细胞系能提高自噬水平，因此抑制 中的自噬是一种有效的治疗策略 。信号通路在 中过表达，其抑制剂参与自噬，因此针对此通路是治疗 的有效方法 。是一种依赖铁和活性氧的调节性细胞死亡形式，对癌症的发展具有重要的作用 。等一些信号通路参与 的调节，提示对癌症治疗有一定的作用 。通路可以通过调节细胞易感性从而调节铁死亡的进展，这对 有一定的治疗潜力 。自噬通过铁蛋白降解调节铁死亡，铁死亡的调节剂被转运到溶酶体并通过自噬过程发挥其功能 ，这两者之间的关系是密不可分的，因此基于两者之中建立 的预后模型可以对 的治疗提供一定的帮助。本研究分析了来自 患者的高通量 数据并确定了与预后相关的 和 ，有 个差异表达基因，其中 个下调基因和 个上调基因。然后对这些基因进行单变量，多变量 回归分析和 回归分析，最终得到 个基因（，）与 患者的预后相关。在确定了预后基因后，研究了 个基因特征并研究了其在 患者中的预后价值。高风险组患者的预后明显低于低风险组患者。此外，此预后模型可以预测不同的性状，例如年龄，性别，等。对生存率和各性状进行了 分析，根据 得出的结果证明预后模型具有一定的预测能力。最后，使用外部验证提高其预测价值。研究中有多个基因被证明与肾透明细胞癌的预后相关，在 种基因中，有 种基因在该癌症中上调。（真核翻译起始因子 结合蛋白 ）的沉默可以增强辐射诱导的自噬从而调控某些辐射易感性癌细胞的表达 ，同时受 抑制剂的影响，能够降低肾细胞癌中的 ，这表明该基因有可能成为肾癌的新型治疗靶点 。在 应激引起的细胞死亡中起着重要作用，自噬机制与 应激诱导的细胞凋亡密切相关 ，因此 在一定程度上调节自噬。可表现出双重性质，诱导细胞死亡，并且还参与自噬的诱导 ，可以作为“桥接分子”，在癌细胞中作为自噬的直接调节剂发挥作用 ，组织中的 水平高于相邻的正常组织，并且高表达水平 的患者预后较差 。有研究报道铁死亡相关基因 的差异表达可能是预测肾癌预后的有效指标 ，可通过二甲双胍调节细胞死亡过程继而调节自噬预防肿瘤的发生，因此 对肾癌的预后有一定意义 。对于其他基因则报道较少，但是综上所述，此研究揭示了 个基因表达水平与 患者的 之间的相关性。如果更深入地探索其在 中的作用，则其可能成为 潜在的治疗靶点。本研究深入探究了预后模型和免疫浸润的关联，结果显示：高风险组与免疫细胞的相关性及功能更为密切，并且高风险组在树突状细胞、巨噬细胞 、肥大细胞的比例上升，浆细胞，细胞中比例下降。一些免疫反应会影响正常铁死亡的过程发生，从而导致一些退行性疾病，同时中断免疫系统的促铁死亡功能会导致致癌基因和肿瘤抑制基因作用 。另外，免疫原性细胞死亡依赖于自噬，癌细胞依赖自噬释放 和肿瘤抗原，导致 激活；自噬可以促进 ，但免疫检查点可以促进有效的 介导的肿瘤根除 。树突状细胞在血液循环中可以迁移到肿瘤组织，诱导 和 细胞破坏肿瘤细胞 ，与本研究结果表现一致。巨噬细胞标志物 的转录物水平增加与 患者的存活率降低显著相关 。有研究表明肥大细胞的数量在 患者的数量上升，这一点与本研究结果相似 。浆细胞和 细胞在肿瘤免疫的调节作用是众所周知的 。报道显示浆细胞和 细胞均与 的不良预后相关 。这些结果表明，高风险人群预后较差可能与肿瘤免疫失调所致相关，关于自噬和铁死亡通过肿瘤免疫影响 年第 卷第 期 的预后仍需进一步的探讨。本研究对于 个差异表达基因进行富集分析，以进一步为 患者提供准确的预后。将 和 的分子特征与 的临床相关性相关联，并筛选出 个与风险相关的基因。自噬和铁死亡机制可以更好地为肾透明细胞癌的治疗提供依据。我们根据患者的风险值对患者进行分组，以更好地协助医生进行临床诊断，为肾透明细胞癌的研究提供新的见解。但本研究存在一定的局限性，首先是验证组的样本量较小；其次，自噬及铁死亡影响 患者预后的分子机制及其对临床治疗的意义有待进一步研究。综上所述，本研究确定了 个与预后风险相关的基因，并确定其与免疫浸润显著相关，为肾透明细胞癌的治疗提供了新的见解，为临床诊治做出了贡献。但仍需要进一步的研究来验证这些结论。参考文献 ，（）：，（）：，（）：，（）：储昭阳，朱向明，江峰，等 通过影响肿瘤微环境中免疫成分改善肾透明细胞癌的预后 右江民族医学院学报，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（），：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：？，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：（下转第 页）年第 卷第 期 科杂志，（）：，林上进，杨丰建，范永前老年退行性腰椎管狭窄症微创手术治疗进展 国际骨科学杂志，（）：余可谊单侧入路双通道脊柱内镜的发展简史、全球现状与中国使命 中国修复重建外科杂志：肖亚杰，申杨勇，陈京峰，等单侧双通道内镜手术治疗腰椎管狭窄症安全性的 分析 中国临床神经外科杂志，（）：陈涛，程子官，张弛单侧双通道脊柱内镜技术在治疗腰椎管狭窄症中的应用进展及思考 按摩与康复医学，（）：沈天宇，柏刚，陈瑞，等单侧双通道内镜技术与显微内镜技术治疗退变性腰椎管狭窄症的 分析 临床荟萃，（）：，（）：吴永超大力开展双通道脊柱内镜手术 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