达罗他胺中间体合成中杂质的发现和结构表征.pdf

Chinese J Magn Reson,2024,41(1):56-66 第 41 卷第 1 期 2024 年 03 月 Vol.41 No.1 Mar.2024 波波 谱谱 学学 杂杂 志志 Chinese Journal of Magnetic Resonance doi:10.11938/cjmr20233078 达罗他胺中间体合成中杂质的发现和结构表征 马卉芳1，童悦2，王荣繁1，谢建伟2 1.健康医学院，广州华商学院，广东 广州 511300；2.化学与生物工程学院，湖南科技学院，湖南 永州 425199 摘 要：达罗他胺是治疗前列腺癌的重要药物，在进行其合成工艺研究时，在第一步 Suzuki 偶联和第二步水解脱保护反应中，发现并纯化得到 3 个杂质 A、B 和 C，其中杂质 A 和 B 来自第一步反应，杂质 C 来自第二步反应.通过高分辨质谱（HRMS）、核磁共振氢谱（1H NMR）和核磁共振碳谱（13C NMR）表征方法，确定了杂质 A 和B 的结构，分别为初始反应原料化合物 2 的脱硼酸频哪醇酯产物和初始反应原料化合物 1 的双偶联产物；借助HRMS、1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC、1H-13C HMBC 和1H-1H NOESY 方法确定了中间体化合物 3 和杂质 C 的准确结构，对其形成机理和规避方法也进行了讨论分析.关键词：达罗他胺中间体；核磁共振；药物杂质 中图分类号：O482.53 文献标识码：A Discovery and Structural Characterization of Impurities in the Synthesis of Darolutamide Intermediate MA Huifang1*，TONG Yue2，WANG Rongfan1，XIE Jianwei2 1.School of Medicine&Health Sciences,Guangzhou Huashang College,Guangzhou 511300,China;2.College of Chemistry and Bioengineering,Hunan University of Science and Engineering,Yongzhou 425199,China Abstract:Darolutamide is an important drug for the treatment of prostate cancer.When studying its synthesis process,three impurities A,B,and C were discovered and purified in the first step of Suzuki coupling and the second step of hydrolysis deprotection reactions.Impurities A and B came from the first-step reaction,and impurity C came from the second-step reaction.The structures of impurities A and B were further determined through high-resolution mass spectrometry(HRMS),1H nuclear magnetic resonance(NMR),and 13C NMR methods.It was discovered that impurities A and B were the deborated pinacol ester product of compound 2 and the double coupling product of compound 1,respectively.The accurate structures of compound 3 and impurity C were determined using HRMS,1H NMR,13C NMR,1H-1H COSY(correlation spectroscopy),1H-13C HSQC(heteronuclear singular quantum correlation),1H-13C HMBC(heteronuclear multiple bond correlation)and 1H-1H NOESY(nuclear overhauser effect spectroscopy).The formation mechanisms and avoidance methods of these impurities were also discussed.Keywords:darolutamide intermediate,NMR,drug impurities 收稿日期收稿日期:2023-08-25;在线在线发表发表日期日期:2023-10-18 基金项目基金项目:广州华商学院校内导师制科研项目(2023HSDS37).通信通信作者作者(Corresponding author):*Tel:[phone],E-mail:.第 1 期 57 马卉芳等：达罗他胺中间体合成中杂质的发现和结构表征 引 言 前列腺癌（Prostate cancer）是发生在前列腺的上皮恶性肿瘤，是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤.该疾病在老年男性中发病率极高，现呈现低龄化且全球发病率持续上升，高居男性恶性肿瘤发病率第二位1,2.达罗他胺（Darolutamide，NUBEQA，7）是一种非甾体类雄激素受体（Androgen receptor，AR）抑制剂，具有独特于其它雄激素受体抑制剂的化学结构，能够竞争性的抑制雄激素与 AR 结合、AR 核转运和 AR 介导的转录，展现出很强的拮抗活性，从而抑制前列腺癌细胞的增殖，缩小肿瘤体积.该药由芬兰 Orion 公司与德国 Bayer 公司联合开发，目前已经在美国、欧盟、日本、中国等全球 70 多个国家和地区获得批准，广泛用于治疗非转移性去势抵抗性前列腺癌（Non-metastatic castration-resistant prostate cancer,nmCRPC）患者3-5 达罗他胺的原研合成路线如图 1 所示6-9，该反应以 4-溴-2-氯苯甲腈为起始原料，经历 Suzuki 偶联、酸性条件脱四氢吡喃（THP）、Mitsunobu 反应、酸性条件脱 Boc、缩合反应和羰基还原等 6 步反应.该路线具有合成步骤少、反应产率高、操作性强等优点 图 1 达罗他胺（7）的原研合成路线.THF：四氢呋喃；PPh3：三苯基膦；DIAD：偶氮二碳酸二异丙酯；DIPEA：N,N-二异丙基乙胺；HOBt：1-羟基苯并三唑；EDCI：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 Fig.1 Original synthesis route of darolutamide(7).THF:tetrahydrofuran;PPh3:triphenylphosphine;DIAD:diisopropyl azodicarboxylate;DIPEA:N,N-diisopropylethylamine;HOBt:1-hydroxybenzotriazole;EDCI:1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide 本文采用以上合成路线对达罗他胺的合成工艺进行研究.在合成中间体 2-氯-4(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-基)苯甲腈（化合物 3）时，通过中控高效液相色谱（HPLC）检测，在反应液中发现两个含量较高的未知杂质（分别标记为杂质 A 和 B，HPLC 含量分别为 3.90%和 0.61%，见附件材料图 S1）在合成 2-氯-4(1H-吡唑-3-基)苯甲腈（化合物 4）时，在反应液中发现一个含量较高的杂质（标记为杂质 C，HPLC 含量 1.23%，见附件材料图 S2），且随着反应时间的延长，杂质 C 的含量增加.经文献检索，这 3 个杂质的结构及形成过程在达罗他胺的工艺研究中未见有相关报道.另一方面，在药物合成工艺研究中，除了对反应条件和后处理方式进行系列优化外，药物杂质的结构确定也对工艺优化具有非常重要的指导意义，例如可以为杂质的形成、传递、去除和限度制定等提供直接的参考价值.基于此，本文以 4-溴-2-氯苯甲腈（化合物 1）为原料，首先与 1-(2-四氢吡喃基)吡唑-5-硼酸频哪醇酯（化合物 2）在钯催化下发生 Suzuki 偶联，随后在盐酸-乙醇溶液中脱保护基四氢吡喃（THP），得到化合物 4（图 2）为进一步确证杂质结构，我们58 波 谱 学 杂 志 第 41 卷 在两步反应中收集并纯化得到三个杂质 A、B 和 C，HPLC 检测纯度均在 95%以上.对于杂质 A 和 B，因其结构与产物 3 相差较大，利用 HRMS 和一维 NMR（1H NMR 和13C NMR）即可确定其结构；而杂质 C为化合物 3 的同分异构体，综合运用 HRMS、一维和二维 NMR（1H-1H COSY、1H-13C HSQC、1H-13C HMBC和1H-1H NOESY）对其进行结构解析，同时对产生异构体 C 的反应历程也进行了推测.研究结果对达罗他胺的合成工艺研究和原料药的质量控制具有重要的指导作用.图 2 化合物 3 和 4 的合成路线及杂质 A、B 和 C 的结构 Fig.2 The synthesis route of intermediate 3 and 4,and the structures of impurities A,B and C 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 实验所用起始物 4-溴-2-氯苯腈（化合物 1）购于浙江省平湖市艾柏化工有限公司；1-(2-四氢吡喃基)吡唑-5-硼酸频哪醇酯（化合物 2）购于上海韶远试剂有限公司；双三苯基膦二氯化钯（Pd(Ph3)2Cl2）购于上海凌凯医药科技有限公司；氘代氯仿（CDCl3）和氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）（含 0.03%的四甲基硅烷（TMS）购于北京伊诺凯科技有限公司；薄层板 GF254、层析硅胶（200300 目）、碳酸钠、三乙胺、盐酸、四氢呋喃（THF）、乙腈、乙醇、正己烷和乙酸乙酯等均为国产市售试剂.所有试剂均未进一步纯化.一维（1H NMR 和13C NMR）和二维（1H-1H COSY、1H-13C HSQC、1H-13C HMBC 和1H-1H NOESY）NMR 数据采集在 Bruker AVANCE III 400/600 MHz 核磁共振波谱仪上进行1H NMR 的工作频率为 400 MHz或 600 MHz，13C NMR 的工作频率为 101 MHz 或 151 MHz，实验温度为 298.2 K，均采用标准脉冲程序.高分辨质谱（HRMS）采用 Agilent 1260 Infinity/6530 Q-TOF 系统，配备电喷雾离子源（ESI）1.2 化合物 3、杂质 A 和 B 的合成 化合物 3 参照文献报道方法制备7-9，合成路线如图 2 所示，具体方法如下：将化合物 1（8.00 g，36.96 mmol）、化合物 2（12.95 g，46.57 mmol）、碳酸钠（9.40 g，88.70 mmol）、24 mL 水和 Pd(PPh3)2Cl2（0.13 g，0.19 mmol）依次加入到 80 mL THF 中，氮气置换 3 次，置于预先加热至 45 的恒温油浴中搅拌反应 3 h.经薄层色谱（TLC，V正己烷:V乙酸乙酯=10:1）检测至化合物 1 反应完全后，将反应液降温至 30.第 1 期 59 马卉芳等：达罗他胺中间体合成中杂质的发现和结构表征 减压旋转蒸发浓缩去除有机相，向残留液中加入 96 mL 水，在 30 下搅拌 30 min 后过滤，滤饼用无水乙醇（64 mL）打浆，并在 30 下搅拌 1 h，降温至10 继续搅拌 1 h 后过滤.滤饼于 50 下真空干燥 12 h，得化合物 3（7.60 g，收率 71.5%）将上述抽滤后的滤液浓缩，残留液经柱层析梯度洗脱分离（洗脱剂为正己烷和乙酸乙酯的混合液，v/v，50:1、20:1、15:1、8:1），分别得杂质 B（白色固体，0.10 g）和杂质 A（无色油状，0.22 g）杂质 A 和 B 的1H NMR 和13C NMR 数据（谱图见附件材料图 S3 和 S4）和 HRMS数据结果如下：杂质 A：1H NMR(400 MHz,CDCl3)：H 7.57(d,J=2.5 Hz,1H)，7.52(s,1H)，6.27(t,J=2.2 Hz,1H)，5.36(dd,J=9.7,2.7 Hz,1H)，4.044.00(m,1H)，3.69-3.63(m,1H)，2.121.99(m,3H)，1.681.55(m,3H).13C NMR(101 MHz，CDCl3)：C 139.54，127.56，105.97，87.52，67.78，30.50，24.96，22.48.HRMS(ESI)m/z：M+H+C8H13N2O+，理论值：153.102 2，实测值：153.102 7.杂质 B：1H NMR(400 MHz,CDCl3)：H 7.967.85(m,2H)，7.787.71(m,1H)，7.697.63(m,2H)，6.61(dd,J=20.0,1.6 Hz,1H)，6.46(dd,J=6.8,1.6 Hz,1H)，5.185.12(m,2H)，4.103.94(m,2H)，3.563.48(m,2H)，2.592.55(m,2H)，2.121.86(m,3H)，1.741.52(m,5H),1.271.25(m,1H)，0.88(t,J=6.4 Hz,1H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)：C 141.79，139.72，139.64，139.54，138.98，138.86，134.91，134.89，134.50，134.43，133.89，133.75，131.42，131.36，130.96，130.92，129.12，117.39，117.25，112.74，112.60，109.13，109.08，109.03，108.97，107.81，107.76，107.69，107.65，84.60，84.57，67.62，67.59，67.55，67.37，29.51，29.33，29.30，24.79，24.71，22.82，22.58.HRMS(ESI)m/z：M+K+C23H25KN5O2+，理论值：442.164 0，实测值：442.164 6.1.3 化合物 4 和杂质 C 的合成 化合物 4 参照文献报道方法制备7-9，合成路线如图 2 所示，具体方法如下：将化合物 3（10.00 g，34.83 mmol）溶于 40 mL 乙醇中，在 25 下缓慢滴加 10 wt%的盐酸水溶液（2.54 g，含 HCl 6.97 mmol），滴加完毕后，置于预先加热至 35 的恒温油浴中搅拌反应 1 h.TLC（V正己烷:V乙酸乙酯=10:1）检测至化合物 3 反应完全.随后，向反应液中滴加 10 wt%的 NaOH 水溶液调节 pH10，降温至 0 后继续搅拌 1 h后过滤，滤饼用 20 mL 水淋洗后，于 60 下真空干燥 12 h，得化合物 4（6.67 g，收率 94.1%），其1H NMR和13C NMR 数据（谱图见附件材料图 S5）和高 HRMS 结果如下：化合物 4：1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)：H 13.27(s,1H)，8.14(s,1H)，7.98(s,2H)，7.88(d,J=1.6 Hz,1H)，6.98(d,J=1.6 Hz,1H).13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)：C 147.85，140.53，136.33，135.41，131.18，126.21，124.60，116.71，110.31，104.02.HRMS(ESI)m/z：M+H+C10H7ClN3+，理论值：204.032 3，实测值：204.033 0 如前所述，化合物 4 在制备过程时，HPLC 检测反应液中其含量为 1.23%（附件材料图 S2）而在获得上述固体化合物 4 后，对其再次进行 HPLC 检测，发现固体中仍然混有杂质 C，含量为 1.50%，稍高于反应液中的含量（附件材料图 S6）为了能更快的富集得到该杂质以便对其进行结构确证，我们对化合物 4 的合成条件进行了适当的调整，提高了反应温度并适当延长了反应时间，具体方法如下：将化合物 3（10.00 g，34.83 mmol）溶于 40 mL 乙醇中，在 25 下滴加 10 wt%的盐酸水溶液（2.54 g，含 HCl 6.97 mmol），滴加完毕后升温至 60 下搅拌反应 6 h.随后将反应液冷却至室温，向其滴加 10 wt%的 NaOH 水溶液调节pH10，降温至 0 继续搅拌 1 h 后过滤，滤饼用 20 mL 水淋洗，收集滤饼即为化合物 4 的粗品.粗品HPLC 检测，杂质 C 的含量增加至 17.34%（附件材料图 S7）柱层析梯度洗脱分离（洗脱剂为正己烷和乙酸乙酯的混合液，v/v，50:110:1）后，得到杂质 C（0.83 g）60 波 谱 学 杂 志 第 41 卷 2 结果与讨论 2.1 杂质 A 和 B 的分析 在第 1 步 Suzuki 偶联反应的中控 HPLC 分析发现，反应液中主要含有少量未反应完的原料化合物 1和化合物 2、产物即化合物 3、三苯基氧磷（来自于钯催化剂）、杂质 A 和 B，以及少量脱 THP 产物即化合物 4（即第 2 步产物）；而按实验部分 1.2 节所述的操作，得到经真空干燥后的固体化合物 3 中仍含有其它组分，如原料化合物 1、三苯基氧磷、杂质 A 和 B，以及化合物 4，具体的 HPLC 含量如表 1 所示（谱图见附件材料图 S1 和 S8）经 HRMS、1H NMR 和13C NMR 表征，杂质 A 为原料化合物 2 的脱硼酸频哪醇酯产物，而杂质 B 则为原料化合物 1 的双偶联产物.这两个杂质的含量与反应中原料化合物 2 的用量、钯催化剂、反应温度、碱的强弱均有一定的关系.反应结束后，产物 3 主要通过乙醇打浆的方式纯化，得到的固体中，化合物 3 的含量由 92.75%提高到 98.46%，杂质 A 和 B 的含量则由 3.90%和 0.61%分别下降至 0.04%和 0.14%由此可知，无水乙醇打浆处理的方式对产物 3 的纯化是比较成功的，大部分的杂质 A均留在母液中，且其在化合物 3 中的少量残留对后续反应基本没有影响.而杂质 B 因含有类似化合物 3 的结构单元，它的残留会参与后续反应，但因其只有 0.14%的含量，在后续中间体合成中又有其它的纯化步骤，所以对终产品影响不大如杂质 B 含量较大，需考虑对终产品质量的影响 表表 1 Suzuki 偶联反应中各组分偶联反应中各组分 HPLC 含量分析含量分析 Table 1 The content of each component in the Suzuki coupling reaction by HPLC 名称 化合物 1 化合物 2 化合物 3 三苯基氧磷 杂质 A 杂质 B 化合物 4 反应液中含量 0.25%1.10%92.75%0.52%3.90%0.61%0.67%固体中含量 0.35%0 98.46%0.07%0.04%0.14%0.85%2.2 化合物 3 和杂质 C 的 HRMS 图谱分析 化合物 3（C15H14ClN3O）和杂质 C（C15H14ClN3O）的 HRMS 图见附件材料图 S9.图 S9(a)中信号最强峰m/z 204.031 3为准分子离子峰MTHP+，图 S9(b)中信号最强峰m/z 310.073 0为准分子离子峰M+Na+，分别与两个化合物的理论值（MTHP+：m/z 204.032 3 和M+Na+：m/z 310.071 8）接近.因化合物 3 和杂质C 是异构体，仅从质谱图无法确定二者的准确结构.2.3 化合物 3 和杂质 C 的 NMR 数据分析 化合物 3 和杂质 C 的化学结构及相关碳原子的编号如图 2 所示.2.3.1 化合物化合物 3 和杂质和杂质 C 的的1H NMR 和和13C NMR 化合物 3 和杂质 C 的1H NMR 谱图见附件材料图 S10 所示.两个化合物的1H NMR 谱除高场吡喃环部分有些许差异外，其它部分比较相似，均显示有 13 组质子信号.低场区H 7.587.79 为苯环的三个质子信号和吡唑环上的一个质子信号；H 6.46 归属为 H-9；H 5.15 归属为 H-11；H 4.17、H 3.64 归属为 H-15，H 1.622.59 为 H-12、H-13 和 H-14.可能由于吡喃环在空间距离上与苯环靠的更近，使得化合物 3 中 H-12的两组氢的化学位移相差较大，分别为H 2.59 和H 1.90，而杂质 C 中 H-12 的化学位移则为H 2.19 和H 2.13.化合物 3 和杂质 C 的1H-1H NOESY 结果也证实这个推测（见附件材料图 S11 和 S12）其中，化合物 3 中的 H-6 与 H-11，H-7 与 H-11 和 H-15 相关；而在杂质 C 中，则可以看到 H-10 与 H-11 和 H-12 相关.然而，这种差异还不足以解析两个化合物的准确结构，需要借助其他二维谱进一步确认.第 1 期 61 马卉芳等：达罗他胺中间体合成中杂质的发现和结构表征 化合物 3 和杂质 C 的13C NMR 谱图见附件材料图 S13 所示.两个化合物均显示有 15 组碳原子信号.主要的不同点是图 S13(a)的C 141.1 与图 S13(b)的C 148.5，其它的信号都很相近.图 S13(a)中，C 108.0141.1 共有 10 个碳，归属于苯环、吡唑环和与苯环相连的氰基碳；C 84.6 归属于吡喃环上的 C-11；C 67.6 归属于吡喃环上的 C-15；C 22.829.5 上的 3 个碳归属于 C-12、C-13 和 C-14，具体的精确归属需要进一步借助1H-1H COSY、1H-13C HSQC 和1H-13C HMBC.2.3.2 化合物化合物 3 和杂质和杂质 C 的二维的二维 NMR 区别于一维 NMR，二维 NMR 可以将 NMR 信号分别在两个独立的坐标展开，可有效减少谱线的拥挤和重叠，从而准确提供自旋核之间耦合的信息10-12.当一维1H NMR 和13C NMR 无法确认化合物结构时，可采用二维 NMR 进行进一步的归属.化合物 3 和杂质 C 的1H-13C HSQC、1H-1H COSY 和1H-13C HMBC全谱分别见图 3(a)、4(a)、5(a)和 3(b)、4(b)、5(b).以化合物 3 为例，在图 3(a)的1H-13C HSQC 谱图中可以看到C 108.0 和C 84.6 分别与前面一维 NMR确定的 H-9 和 H-11 相关，归属为 C-9 和 C-11.在图 4(a)的1H-1H COSY 谱图中，从 H-9 的H 6.46 可以找到与其相关的H 7.64，归属为 H-10.由1H-13C HSQC 归属与 H-10 相关的 C-10 即C 139.7.通过图 5(a)的1H-13C HMBC 的图，H-10 与 C-8 和 C-9 相关，找到C 141.1，归属为 C-8.H-9 与 C-5、C-8 和 C-10 相关，确定 C-5 即C 136.2.H-11 与 C-8、C-12、C-13 和 C-15 相关，找到C 29.5、C 22.8 和C 67.6，分别归属为C-12、C-13 和 C-15.H-14 与 C-12、C-13 和 C-15 相关，找到H 1.62 与H 1.78，归属为 H-14.通过1H-1H COSY 可看出H 7.59 与H 7.78 相关，再通过1H-13C HMBC 找到与 C-8 相关的只有 H-6，所以，H 7.59 与H 7.78 分别归属 H-6 和 H-7，进一步通过1H-13C HSQC 分别找到C 127.4 和C 134.1，归属为 C-6 和 C-7.H-7 相关的 C-1、C-3 和 C-5，其中 C-5 对应的前面已归属，因 C-3 与氯原子相连，去屏蔽作用更强，所以C 137.2 归属为 C-3，C 115.7 归属为 C-1.至此，最后一个氢H 7.79 归属为 H-4，根据1H-13C HSQC 找到C 130.2，归属为 C-4.通过1H-13C HMBC，找到与 H-4 相关的 C-2、C-6 和 C-8，其中 C-6 和 C-8 前面已经归属，所以C 113.0 归属为 C-2.综上，借助二维 NMR 准确地归属了化合物 3 的所有 NMR 数据.图 3 (a)化合物 3 和(b)杂质 C 的1H-13C HSQC 谱图 Fig.3 1H-13C HSQC spectrum of compounds 3(a)and impurities C(b)(a)(b)87654322030405060708090100110120130140876543220304050607080901001101201301401HHCC62 波 谱 学 杂 志 第 41 卷 图 4 (a)化合物 3 和(b)杂质 C 的1H-1H COSY 谱图 Fig.4 1H-1H COSY spectrum of compounds 3(a)and impurities C(b)图 5 (a)化合物 3 和(b)杂质 C 的1H-13C HMBC 谱图 Fig.5 1H-13C HMBC spectrum of compounds 3(a)and impurities C(b)通过同样方法也可归属杂质 C 的所有 NMR 数据，两个化合物的碳氢归属分别见表 2 和表 3，对于化合物 3，从1H-13C HMBC 图可以看出，H-11 和 C-8、C-12、C-13 和 C-15 存在相关峰；而杂质 C 中 H-11则与 C-10、C-12、C-13 和 C-15 存在相关峰.因此，化合物 3 中 H-11 和 C-8 相关，杂质 C 中 H-11 与 C-10相关，这是两个物质区分的主要依据，HMBC 局部放大谱图如图 6(a)和 6(b)所示.(a)(b)87654321.52.02.58765432234567813.03.54.04.55.05.56.06.57.07.50HHHH(a)(b)203040506070809010011012013014087654322030405060708090100110120130140115087654321HHCC第 1 期 63 马卉芳等：达罗他胺中间体合成中杂质的发现和结构表征 图 6 化合物 3(a)和杂质 C(b)的局部1H-13C HMBC 谱图 Fig.6 Partial 1H-13C HMBC spectrum of compounds 3(a)and impurities C(b)表表 2 化合物化合物 3 的的 NMR 数据归属数据归属 Table 2 NMR assignments of compound 3 No.1H NMR 13C NMR HMBC(1H13C)1H-1H COSY H C 1 N/A 115.7 N/A N/A 2 N/A 113.0 N/A N/A 3 N/A 137.2 N/A N/A 4 7.79(1H,d,J=1.4 Hz)130.2 C-2,6,8 N/A 5 N/A 136.2 N/A N/A 6 7.59(1H,dd,J=8.0,1.5 Hz)127.4 C-2,3,4,7,8 H-7 7 7.78(1H,d,J=8.1 Hz)134.1 C-1,3,5 H-6 8 N/A 141.1 N/A N/A 9 6.46(1H,d,J=1.8 Hz)108.0 C-5,8,10,11 H-10 10 7.64(1H,d,J=1.6 Hz)139.7 C-8,9 H-9 11 5.15(1H,dd,J=10.0,2.4 Hz)84.6 C-8,12,13,15 H-12 12 1.90(1H,m),2.59(1H,m)29.5 C-11,13,14 H-11,13 13 1.62(1H,overlap),2.12(1H,m)22.8 C-11,12,14,15 H-12,14 14 1.62(1H,overlap),1.78(1H,m)24.8 C-12,13,15 H-13,15 15 3.64(1H,m),4.17(1H,m)67.6 C-11,13,14 H-14(a)(b)5.820304050607080901001101201301405.702030405060708090100110120130140150105.605.505.405.305.205.105.65.45.25.04.84.64.4HHCCClNCNNO1235679101112131415HMBC1H-1H COSY864 波 谱 学 杂 志 第 41 卷 表表 3 杂质杂质 C 的的 NMR 数据归属数据归属 Table 3 NMR assignments of impurity C No.1H NMR 13C NMR HMBC(1H13C)1H-1H COSY H C 1 N/A 116.3 N/A N/A 2 N/A 111.6 N/A N/A 3 N/A 137.1 N/A N/A 4 8.01(1H,d,J=1.4 Hz)126.7 C-2,3,6,8 N/A 5 N/A 139.3 N/A N/A 6 7.81(1H,dd,J=8.1,1.5 Hz)124.1 C-2,4,8 H-7 7 7.68(1H,d,J=8.1 Hz)134.1 C-1,3,5 H-6 8 N/A 148.5 N/A N/A 9 6.67(1H,d,J=2.5 Hz)104.2 C-8,10 H-10 10 7.70(1H,d,J=2.5 Hz)129.7 C-8,9 H-9 11 5.45(1H,dd,J=9.6,2.6 Hz)88.0 C-10,12,13,15 H-12 12 2.13(1H,m),2.19(1H,m)30.6 C-11,13,14 H-11,13 13 1.75(1H,overlap),2.09(1H,m)22.3 C-11,12,14,15 H-12,14 14 1.67(1H,m),1.75(1H,overlap)24.9 C-12,13,15 H-13,15 15 3.76(1H,m),4.11(1H,m)68.0 C-11,13,14 H-14 2.4 杂质 C 形成机理及影响因素 从杂质 C 的结构来看，形成机理如图 7 所示.推测为在酸性条件下，化合物 3 脱保护生成化合物 4 和THP；而化合物 4 在酸性条件下可重新与 THP 反应生成杂质 C.该反应历程表明杂质 C 比化合物 3 在酸性条件下的稳定性更好，并且随着反应温度的提高和反应时间的延长，杂质 C 含量会进一步增加.图 7 杂质 C 的形成机理 Fig.7 Mechanism of the formation of impurity C 为了验证这个结论，作者研究了反应温度和反应时间对反应产物和杂质 C 的影响，结果如表 4 所示.当反应温度为 20 时，该反应进行 1 h（编号 1），产物化合物 4 的含量仅为 33.25%；延长反应时间到 5 h，则基本反应完全，进一步延长至 22 h，产物 4 的含量基本没变化，但杂质 C 的含量由 0.47%增加到 1.20%（编号 23）升高反应温度到 30 或 40 时，该反应在 1 h 内即可反应完全，但杂质 C 的含量均比ClNCNNO12345679101112131415HMBC1H-1H COSY8第 1 期 65 马卉芳等：达罗他胺中间体合成中杂质的发现和结构表征 20 反应时要高，并且随着反应时间的延长，杂质 C 含量也增多（编号 47）当反应温度继续升高到 50 或 60 时，反应 1 h 后的结果均显示产物化合物 4 的含量下降，而杂质 C 的含量则显著上升，温度越高该趋势越明显（编号 6、8 和 9）因此，对于第二步脱保护基 THP，反应温度选择 2030，反应时间控制在 5 h 以内为最佳，此时产物化合物 4 的含量高，杂质 C 的含量较低.表表 4 反应温度和反应时间对脱保护反应的影响反应温度和反应时间对脱保护反应的影响 Table 4 Effects of reaction temperature and time on deprotection reaction 编号 反应温度/反应时间/h HPLC 含量/%化合物 4 化合物 3 杂质 C 1 20 1 33.25 65.92 0.05 2 20 5 97.62 0.74 0.47 3 20 22 97.58 0.29 1.20 4 30 1 97.63 0.29 1.06 5 30 5 97.32 0.43 1.37 6 40 1 97.32 0.35 1.42 7 40 5 90.31 2.21 6.74 8 50 1 94.19 1.20 3.74 9 60 1 85.06 3.00 11.07 3 结论 本文在达罗他胺合成的第一步 Suzuki 偶联和第二步水解脱保护反应中，分离纯化得到 3 个杂质 A、B和 C，借助 HRMS 和一维 NMR 确定了杂质 A 和 B 的结构，其中 A 为化合物 2 的脱硼酸频哪醇酯产物，而 B 为化合物 1 的双偶联产物.借助 HRMS、一维和二维 NMR，特别是1H-13C HMBC 谱，确定了化合物3 和杂质 C 的结构，并完整归属了这两个同分异构体的谱图信号，同时对杂质 C 的形成过程及规避措施进行了分析和研究.实验结果为达罗他胺的药物合成工艺研究提供了有益的科学参考.利益冲突 无 附件材料（可在波谱学杂志期刊官网 http:/ 获取）图 S1 化合物 3 合成过程中反应液的 HPLC 谱图及各组分分布 图 S2 化合物 4 合成过程中反应液的 HPLC 谱图及各组分分布 图 S3 杂质 A 的1H NMR 和13C NMR 谱图 图 S4 杂质 B 的1H NMR 和13C NMR 谱图 图 S5 化合物 4 的1H NMR 和13C NMR 谱图 图 S6 化合物 4 粗品的 HPLC 谱图及各组分分布 图 S7 化合物 4 粗品的 HPLC 谱图及各组分分布（提高反应温度，延长反应时间）图 S8 化合物 3 纯化后的 HPLC 谱图及各组分分布 图 S9 (a)化合物 3 和(b)杂质 C 的 HRMS 谱图 66 波 谱 学 杂 志 第 41 卷 图 S10 (a)化合物 3 和(b)杂质 C 的1H NMR 谱图 图 S11 化合物 3 的1H-1H NOESY 谱图 图 S12 杂质 C 的1H-1H NOESY 谱图 图 S13 (a)化合物 3 和(b)杂质 C 的13C NMR 谱图 参考文献：1 FERLAY J,COLOMBET M,SOERJOMATARAM I,et al.Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018:GLOBOCAN sources and methodsJ.Int J Cancer,2019,144(8)