36婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定.pdf

中中华华人人民民共共和和国国国国家家标标准准GB 5413.192010中中 华华 人人 民民 共共 和和 国国 卫卫 生生 部部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定 National food safety standard Determination of free biotin in foods for infants and young children,milk and milk products GB 5413.192010 I 前 言 本标准代?GB/T 5413.19-1997?婴幼儿配方食品和乳粉 游离生物素的?定?本标准附录A为规?性附录?本标准所代?标准的历次版本发布情况为?GB 5413-1985?GB/T 5413.19-1997?GB 5413.192010 1 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定 1 范围 本标准规定了婴幼儿食品和乳品中游离生物素的?定方法?本标准适用于婴幼儿食品和乳品中游离生物素的?定?2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必?可少的?是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准?是?注日期的引用文件，?新版本?包括所?的修改单?适用于本标准?3 原理 利用植物乳杆菌?Lactobacillus plantarum?对游离生物素的特?性和灵敏性，定量?定出试?中?物质的含量?在含?除?物质以外所?营养成分的?养?中，微生物的生长?物质含量呈线性关系，?据透光率?标准工作曲线进行比较，?可计算出试?中?物质的含量?4 试剂和材料 除非另?规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二?水?4.1 菌株?植物乳杆菌?Lactobacillus plantarum?，ATCC 8014?4.2 生物素?d-Biotin 或 Vitamin H?标准品?C10H16N2O3S?纯度?99%?4.3?养?4.3.1 乳酸杆菌琼脂?养?见附录 A?4.3.2 乳酸杆菌肉汤?养?见附录 A?4.3.3 生物素?定用?养?见附录 A?注：一?商品化合成?养?效果良好，商品化合成?养?按标签说明进行配制?4.4 乙醇溶液?50%?4.5?酸溶液?3%?量取 3mL?酸加入到水中，定容至 100 mL?4.6 氢?化?溶液?0.5 mol/L?称取 20 g 氢?化?溶于 1000 mL 水中?4.7 氯化?溶液?9 g/L?称取 9.0 g 氯化?溶解于 1000 mL 水中，分装试管，每管 10 mL?121灭菌 15 min?4.8 标准溶液的制备 4.8.1 生物素标准贮备液?100 g/mL?称取生物素标准品?4.2?用乙醇溶液?4.4?定容至生物素浓度为 100 g/mL，贮于冰箱中?4.8.2 生物素标准中间液?1 g/mL?吸取 1 mL 生物素标准贮备液?4.8.1?，用乙醇溶液?4.4?定容至 100 mL?4.8.3 生物素标准工作液?10 ng/mL?吸取 1 mL 生物素标准中间液?4.8.2?，用乙醇溶液?4.4?定容至 100 mL?4.8.4 标准曲线工作液 GB 5413.192010 2 分两个浓度，高浓度溶液的浓度为 0.2 ng/mL?浓度溶液的浓度为 0.1 ng/mL?从工作液中?4.8.3?吸取两次各 5 mL，用水分别定容到 250 mL 和 500 mL?注?所?标准溶液要储?于冰箱内?4.8.1?4.8.2?和 4.8.3 保?期?个?，4.8.4 临用前配制?5 仪器和设备 除微生物实验室常规灭菌及?养设备外，?他设备和材料如?5.1 天?感量为 0.1 mg?5.2 pH 计?精度?0.02?5.3 分光光度计?5.4 涡旋混合器?5.5 离心机?转速?2000 转/分?5.6 恒温?养箱?36 1?5.7 冰箱?2 5?5.8 无菌吸管?10 mL 样?0.1 mL 刻度核 或微量移液器或吸头?5.9 瓶口分液器?0 mL10 mL?5.10 锥形瓶?200 mL?5.11 容量瓶?A 类?100 mL，250 mL，500 mL?5.12 单刻度移液管?A 类?容量 5 mL?5.13 漏斗?直?90 mm?5.14 定量滤纸?直?90 mm?5.15 试管?18mm180 mm?注：玻璃仪器使用前，用活性剂?桂磺酸?或家用洗涤剂加入到洗涤用水中?可?对?玻璃?定管及?他必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后在 200?热 2 h?6 分析步骤 6.1 接种菌悬液的制备 6.1.1 将冻?菌株?4.1?活化后，转接到乳酸杆菌琼脂?养?4.3.1?中，36 1?养过夜?再转接 23 代来增强活力?然后再将?从固体?养?转接到乳酸杆菌肉汤?养?4.3.2?中?养?6.1.2 将乳酸杆菌肉汤中的?养液以 2000 转/分?离心 2 min3 min，倾出?清液，加入 10 mL 氯化?溶液?4.7?，混匀，再离心 2 min3 min，如?清洗 3 次4 次，吸适量该菌悬液于 10 mL 氯化?4.7?中，?6.1.3 用分光光度计以氯化?溶液?4.7?做空?，于 550 nm?长?菌悬液?6.1.2?的透光率，使?透光率在 60%80%之间?6.2 样品的处理 6.2.1 干粉样品 称取一定量?品?精确至 0.0001 g?于 250 mL?角瓶中，该?品应含 0.2 g0.5 g 生物素?继续6.2.3?骤?6.2.2 液体样品 吸一定量的液体?品于 250 mL?角瓶中，该?品应含 0.2 g0.5 g 生物素?继续 6.2.3?骤?6.2.3 样品的提取 GB 5413.192010 3 加入?酸溶液?4.5?100 mL，121 水解 30 min，冷?后用氢?化?溶液?4.6?调节 pH 至 4.50.2，定量转到 250 mL 容量瓶中，用水定容，充分混合?用滤纸过滤，?去?初的?毫升?吸取滤液 5 mL，加入?20 mL 水，用氢?化?溶液?4.6?调 pH 为 6.80.2,定量转到 100 mL 容量瓶中，用水定容?6.3 标准曲线的制作 按表 1 顺序加入水?标准曲线工作液?4.8.4?和生物素?定用?养?4.3.3?于?养管中，一式?份?表1 标准曲线的制作 试管号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 水?mL?5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 标准曲线工作液 0.1 ng/mL?mL?0 0 1 2 3 4 5 0 0 0 标准曲线工作液 0.2 ng/mL?mL?0 0 0 0 0 0 0 3 4 5?养?mL?5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6.4 待测液的制作 按表 2 顺序加水?品溶液?6.2.3?和生物素?定用?养?4.3.3?于?养管内，一式?份?每份?品需带?品空?试管一只，管内分别加入5 mL?液和5 mL?养?表2 待测液的制作 试管号 1 2 3 4?品空?水?mL?4 3 2 1 0?品溶液?mL?1 2 3 4 5?养?mL?5 5 5 5 5 6.5 灭菌 将6.3和6.4中所?的试管盖?试管帽，放入灭菌釜内，121 灭菌5 min?商品?养?按标签说明进行灭菌?6.6 接种 从灭菌釜内取出试管，将试管迅速冷?至30 以?将接种菌悬液?6.1.2?用滴管或移液器向?述试管中各滴加一滴?50 L?，?中标准曲线管中未接种空?S1和?品空?除外?6.7?养 将试管放入?养箱内，36 1?养19 h20 h?6.8 测定 对每支试管进行视觉检查，接种空?试管 S1 内?养液应是澄清的，如果出现浑?，则结果无效?6.8.1 以接种空?试管 S1 做对照，?定?高浓度标准曲线试管的吸光度，两小时后重新?定?两次结果透光率差值若小于 2%，则取出全部检验管?吸光度 A?6.8.2 以接种空?试管 S2 为空?，调节吸光度为 0，依次读出?他每支试管的吸光度 A，?品空?的吸光度 A 一并读出?6.8.3 用涡旋混合器充分混合每一支试管?也可以加一滴消?剂?后，立?将?养液移入比色皿内进行?定，?长为 550 nm，?读数稳定 30 s 后，读出吸光度 A，每支试管稳定时间要相同?以生物素标准品的含量为横坐标，吸光度 A 为纵坐标作标准曲线?6.8.4?液?养试管中，?品空?试管吸光度应小于 0.05?若?品空?试管吸光度大于 0.02，加入?液 1 mL 的试管的吸光度值要减去?品空?试管吸光度值的 1/5，加入?液 2 mL 的试管的吸光GB 5413.192010 4 度值要减去?品空?试管吸光度值的 2/5，以?类推，作为计算结果的依据?据?液的吸光度 A，从标准曲线中查得该?液中生物素的浓度，再?据稀释因子和称?量计算出试?中生物素的含量?吸光度值超出标准曲线管 S3S10?围的试?管要舍去?6.8.5 对每个编号的?液试管，用每支试管的吸光度值计算每毫升该编号?液生物素的含量，并计算该编号?液的生物素含量?均值，每支试管?得的该浓度?得超过该?均值的15%，超过者要舍去?如果符合该要?的管数少于所?四个编号?液总管数的 2/3，需要重新检验?如果符合该要?的管数大于等于原来管数的 2/3，重新计算每一编号的?效试?管中每毫升?定液生物素含量的?均值，以?均值计算全部编号试?管的总?均值 Cx，用于计算试?中的生物素含量?7 分析结果的表述 试?中生物素的含量按公式 样1核 计算?1001000=fmCXx 样1核 式中?X试?中生物素的含量，单?为微克每?克?g/100 g?Cx6.8.5 中计算所得的总?均值，单?为纳克?ng?m试?的质量，单?为克?g?f稀释倍数?以重复性条件?获得的两次独立?定结果的算术?均值表示，结果保留两?效数?8 精密度 在重复性条件?获得的两次独立?定结果的绝对差值?得超过算术?均值的 10%?9 其他 本标准检出限为 20.0 g/kg?GB 5413.192010 5 附录 A?规范性附录?养?和试剂 A.1 乳酸杆菌琼脂?养?A.1.1 成分 胨化乳 15.0 g，酵母浸膏 5.0 g，葡萄糖 10.0 g，番?100 mL，磷酸二氢钾 2.0 g，聚山梨糖单?酸酯 1.0 g，加水至 1000 mL，调节 pH 至 6.80.2?25 5?A.1.2 制法 在 A.1.1 中加入 10.0 g 琼脂，加热煮?，使琼脂溶化?混合均匀后分装试管，每管 10 mL?121 高压灭菌 15 min，备用?A.2 乳酸杆菌肉汤?养?A.2.1 成分 胨化乳 15.0 g，酵母浸膏 5.0 g，葡萄糖 10.0 g，番?100 mL，磷酸二氢钾 2.0 g，聚山梨糖单?酸酯 1.0 g，加水至 1000 mL，调节 pH 至 6.8 0.2?25 5?A.2.2 制法 将 A.2.1 成分加热煮?，混合均匀后分装试管，每管 10 mL?121 高压灭菌 15 min?A.3 生物素测定用?养?A.3.1 成分 维生素?定用酪蛋?酸 12.0 g，葡萄糖 40.0 g，乙酸?20.0 g，L-胱?酸 0.2 g，DL-色?酸 0.2 g，?酸腺嘌呤 20.0 mg，盐酸鸟嘌呤 20.0 mg，尿嘧啶 20.0 mg，盐酸?胺素 2.0 mg，?黄素 2.0 mg，烟酸 2.0 mg，泛酸钙 2.0 mg，盐酸吡哆醇 4.0 mg，p-?苯甲酸 200.0 g，磷酸氢二钾 1.0 g，磷酸二氢钾 1.0 g，?酸镁 0.4 g，氯化?20.0 mg，?酸?铁 20.0 mg，?酸锰 20.0 mg，加水至 1000 mL，pH 6.80.2?25 5?A.3.2 制法 将?述成分溶解于水中，调节 pH，备用?