地质环境中生物标志物 GDGTs 分析技术研究进展.pdf

战楠，孙青，李琪，等.地质环境中生物标志物 GDGTs 分析技术研究进展J.岩矿测试，2024，43（1）：3046.DOI:10.15898/j.ykcs.202306100077.ZHANNan，SUNQing，LIQi，etal.ResearchProgressinAnalyticalMethodsofBiomarkerGDGTsinGeologicalEnvironmentsJ.RockandMineralAnalysis，2024，43（1）：3046.DOI:10.15898/j.ykcs.202306100077.地质环境中生物标志物 GDGTs 分析技术研究进展战楠1,2，孙青1*，李琪3，谢曼曼1，尚文郁1，郝瑞霞2（1.国家地质实验测试中心，自然资源部生态地球化学重点实验室，北京100037；2.北京大学地球与空间科学学院，北京100871；3.中国科学院地质与地球物理研究所，北京100029）摘要：甘油二烷基甘油四醚脂（GDGTs）是一类来自于微生物细胞膜脂的新兴生物标志物，广泛存在于海洋、湖泊、土壤、泥炭等环境。在活体细胞中，GDGTs 通常以完整极性膜脂（IPL-GDGTs）的形式存在，而在地质环境中主要以脱去极性头基的核心脂（CL-GDGTs）的形式存在。CL-GDGTs 结构稳定、不易降解，并且对环境变化响应敏感，因此被认为是重建古气候-古环境变化的有力工具。GDGTs 结构复杂、种类多样，在环境中的含量通常较低且常与其他化合物共存，因此分析难度较高，现有技术和方法在其分离、纯化、定量等方面仍然面临挑战。本文总结了近年来 GDGTs 在分析技术方面的研究进展，概述了 GDGTs 的分类与结构，对环境中 IPL-GDGTs 和 CL-GDGTs 的分离、纯化等方法进行总结和比较，其中 CL-GDGTs 可选择多种提取方法，而极性较强、热稳定性较差的 IPL-GDGTs 应尽量选取 Bligh-Dyer 提取法。普通的分离、纯化通常采用柱层析法，而涉及 GDGTs 单体分离时，一般采用制备液相色谱法。液相色谱-质谱、核磁共振波谱、气相色谱-同位素比值质谱是 GDGTs 含量测定、结构鉴定、同位素分析的主要分析手段。本文评述了现有方法的特点和不足，并在此基础上，提出了 GDGTs 分析技术的发展方向，以期为地质环境中 GDGTs的分析研究提供启示和参考。关键词：甘油二烷基甘油四醚脂(GDGTs)；提取；分离纯化；含量分析；结构鉴定；同位素分析要点：（1）GDGTs 是来自微生物细胞膜脂的一类新兴的生物标志物，是当前古气候-古环境重建研究的良好载体和有力工具，在地质环境中广泛分布。（2）GDGTs 的结构复杂、种类多样，分析难度较高，现有分析技术在其分离、纯化、准确定量等方面仍面临挑战。（3）GDGTs 的分析研究重点需要关注方法标准化、分析效率、新组分识别及同位素分析等方面。中图分类号：O657文献标识码：A生物标志物，是从生物体中演化而来的一系列有机分子，其含量、分布特征及同位素组成能够反映地质历史时期的气候和环境变化1-2。甘油二烷基甘 油 四 醚 脂（Glycerol dialkyl glyceryl tetraethers，简称 GDGTs）是古菌或细菌细胞膜的骨架成分，也是二十世纪末发展起来的一类新兴的生物标志物3。GDGTs 在 自 然 界 广 泛 分 布，包 括 海 洋 4-6、湖泊7-10、河流11、热泉12-13、土壤14-17、泥炭18-22等环境。GDGTs 的组成对外界环境变化响应敏感，并且其核心脂结构稳定、不易降解，能够收稿日期：20230610；修回日期：20230726；接受日期：20230805基金项目：中国地质科学院基本科研业务费项目（CSJ-2022-05）第一作者：战楠，博士研究生，助理研究员，从事环境分析化学、有机地球化学研究。E-mail：。通信作者：孙青，博士，研究员，从事有机地球化学、全球气候变化、稳定同位素研究。E-mail：。2024年1月岩矿测试Vol.43,No.1January2024ROCKANDMINERALANALYSIS304630长期保存在沉积环境中，因此被认为是古气候重建研究的良好载体和有力工具23-28。目前，GDGTs 已被应用于重建早白垩纪以来的气候环境演变历史29-30。例如，Chu 等31利用湖光岩湖泊沉积物中 GDGTs 重建了末次冰消期以来中国热带地区温度变化，该结果与格陵兰冰芯记录的温度变化趋势大致相同，证实高纬度冰盖与热带陆地之间存在耦合作用；Bai 等32利用土壤中GDGTs 指标重建了青藏高原南部古海拔变化历史，为揭示印度板块与欧亚大陆板块的碰撞过程和机制提供了新线索。大量研究表明 GDGTs 在古气候重建中发挥了重要作用，而进行古气候重建的前提是准确分析 GDGTs29-32。然而，GDGTs 分子结构复杂，其同系物、异构体理化性质相似，并且环境中GDGTs 的含量较低（通常在 ng/g 水平），又常与其他有机化合物共存，因此分析难度较高，现有技术在其分离、纯化、准确定量等方面仍面临挑战1，3。本文在前人研究基础上，概述了 GDGTs 的结构与分类，总结并比较了地质环境样品中 GDGTs 的提取、分离、纯化等前处理方法，评述了液相色谱-质谱、核磁共振波谱、气相色谱-同位素比值质谱等技术在含量分析、结构鉴定、同位素分析方面的研究进展，同时提出未来 GDGTs 分析技术的发展方向。1GDGTs 的结构与分类环 境 中的 GDGTs 种 类 多 样，通 常 所 说 的GDGTs 是 指 微 生 物 的 核 心 脂（Core Lipids，CL-GDGTs），其基本结构包括两个烷基长链和两个甘油分子，烷基长链末端通过醚键与甘油基团结合形成闭合环状大分子33-34。在活体细胞中，CL-GDGTs两端的甘油基团上带有由磷酸盐、醣基或葡萄糖醛酸等组成的极性头基，以完整极性膜类脂（IntactPolarLipids，IPL-GDGTs）的形式存在（图 1），但随着细胞的死亡降解，IPL-GDGTs 会丢失极性头基而转化成 CL-GDGTs16，18，35。目前，研究较多的 CL-GDGTs 主要包括两大类：类 异 戊 二烯 GDGTs（Isopernoidal GDGTs，简 称isoGDGTs）和支链 GDGTs（BranchedGDGTs，简称brGDGTs）。两者的结构既有相似性，又有明显差异（图 1）。相同点在于：两者均是由 2 条长链烷基和2 个甘油分子形成的四醚类环状化合物，并且烷基侧链上均含有一定数量的甲基和五元环或六元环。不同点在于：两者结构中甘油的立体构型不同，isoGDGTs 为甘油-1-磷酸（G-1-P）构型，而 brGDGTs为甘油-3-磷酸（G-3-P）构型；两者烷基侧链的骨架不同，isoGDGTs 的烷基侧链含有 40 个碳原子且为类异戊二烯结构12，而 brGDGTs 的侧链仅由 28个碳原子组成且为支链烷烃结构6（图 1）。isoGDGTs 主要包括 GDGT-0 到 GDGT-8（数字代表其结构中包含的环戊烷数量）、泉古菌醇（Crenarchaeol，简 称 Cren）及 其 立 体 异 构 体（Crenarchaeol regioisomer，简称 Cren）（图 1）12。isoGDGTs 的 母 源 微 生 物 是 古 菌，包 括 泉 古 菌（Crenarchaeota）、奇古菌（Thaumarchaea）、广古门菌（Euryarchaeota）等36-37。其中，泉古菌主要合成含有 04 个环戊烷的 GDGTs 和 Cren，氨氧化古菌主要合成 Cren 及 Cren，而含有 4 个环戊烷以上的isoGDGTs（GDGT-5 至 GDGT-8）仅在热泉和嗜热菌的培养液中发现38。brGDGTs 含有、和三个系列，每个系列之间相差一个 CH2。目前已发现和系列烷基侧链上的甲基可以在 C5、C6、C7位置变动，分别形成5-甲基、6-甲基和 7-甲基等位置异构体8，39-41。在立体结构方面，brGDGTs 的甘油构型只有一种反平行结构42，这与 Cren 及 Cren存在平行和反平行2 种构型不同43，并且其烷基侧链上的多个手性碳原子的立体构型也是固定的44。目前，brGDGTs的生物来源还不十分明确，但其甲基支链结构和甘油立体化学特征指示它们由细菌合成8，其稳定碳、氢同位素表明其来自兼性异养细菌21，45。培养实验也证实酸杆菌可以合成 brGDGTs 个别组分（如a、c）46-47。最新研究表明，除了酸杆菌外，变形菌、消化螺旋菌、拟杆菌、放线菌和疣菌也可能是brGDGTs 的潜在母源25-27，48。2地质环境样品中GDGTs 的提取方法与纯化技术2.1GDGTs 的提取方法地质环境样品中 GDGTs 的提取方法主要包括Bligh-Dyer 法（简称 BD 法）12，35，49-50、超声萃取法14，32，51-52、索氏抽提法53-56、加速溶剂萃取法（ASE）31，57-59和微波辅助提取法（MAE）21，59-60等（表 1）。BD 法最早被应用于提取真核生物和细菌中的细胞膜脂，以氯仿-甲醇（21，V/V）为提取液，后经不断改良，如增加萃取液中甲醇的比例，加入少量的酸（如盐酸、三氯乙酸、磷酸盐缓冲液），使其对脂类物第1期战楠，等：地质环境中生物标志物 GDGTs 分析技术研究进展第43卷31OOOOOHHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOIam/z 1022Ibm/z 1020Icm/z 1018OOOOOHOOOOOHIIam/z 1036IIbm/z 1034IIcm/z 1032OOOOOHOOOOOHOOOOOH5IIa6m/z 1036IIb6m/z 1034IIc6m/z 1032OOOOOHOOOOOHOOOOOH666IIIam/z 1050IIIbm/z 1048IIIcm/z 1046OOOOOHHOOOOOOHHOOOOOOHHO555OOOOOHHO5555IIIa6m/z 1050IIIb6m/z 1048IIIc6m/z 1046OOOOOHHO66OOOOOHHOOOOOOHHOOOOOOHHO66666IIa7m/z 1036OOOOOH756IIIa7m/z 1050OOOOOHHO77OOOOOHHO77支链 GDGTs类异戊二烯 GDGTsOOHOGDGT-0m/z 1302GDGT-1m/z 1300GDGT-2m/z 1298GDGT-3m/z 1296OOOOOHHOOHOOOOOHOHOOOOOHOHOOOOHOGDGT-4m/z 1294OHOOOOHOGDGT-5m/z 1292OHOOOOHOOOHOGDGT-6m/z 1290GDGT-7m/z 1288GDGT-8m/z 1286OHOOOOHOOHOOOOHOOHOOOOHOOOHOOOOH55完整极性膜类脂 GDGTs单葡萄糖头基 IPL-GDGTMonoglycosylGDGTOHOHOOHGDGTHO磷酸葡萄糖头基 IPL-GDGTPhosphohexoseGDGTOHOHOOHO PHOGDGTO糖醛酸头基 IPL-GDGTGlycuronicacidGDGTOHOHOOHGDGTHOO磷酸甘油头基 IPL-GDGTPhosphatidylglycerolGDGTHOOPGDGTOHOOH双葡萄糖头基 IPL-GDGTDiglycosylGDGTOHOHOOHOHOOOHHOGDGTHO胆碱磷酸头基 IPL-GDGTPhosphocholineGDGTNOPGDGTOOHOHCrenm/z 1292Crenm/z 1292图1环境中常见的支链 GDGTs、类异戊二烯 GDGTs 和完整极性膜类脂 GDGTs 的分子结构图Fig.1MolecularstructuresofbrGDGTs,isoGDGTsandIPL-GDGTsintheenvironment.第1期岩矿测试http：/2024年32质的提取率可达 90%以上3，59，61。超声波萃取法通常采用甲醇、甲醇-二氯甲烷（11，V/V）、二氯甲烷等为提取液，超声萃取 23 次以保证提取效率52，59。索氏抽提法通常采用二氯甲烷-甲醇混合溶剂为萃取液，加热回流提取 2472h，其萃取效率较高，但溶剂消耗量大且耗时、费力53-56。ASE 法是目前 CL-GDGTs 的主流提取方法，通常以二氯甲烷-甲醇为提取溶剂，在温度 100120、压力12001500psi 条件下，静态萃取 510min，循环萃取 23 次57-59。2020 年 Auderset 等62提出一种 ASE 分步提取法，通过不同极性溶剂萃取，从土壤和沉积物中依次分离出正构烷烃、长链烯酮及GDGTs 三种组分。MAE 法是一种利用微波加热技术对固体样品提取的方法，通常以二氯甲烷-甲醇为提取溶剂，在一定温度、压力和微波辐射下，萃取1020min，该法操作简单、快速高效、节省溶剂、选择性好，但由于微波反应器的普及程度不高，所以目前应用还较少28，59-60。不 同 方 法对 GDGTs 的 提 取 效 率 不 尽 相同50-51，63-64。Schouten 等51比较了超声萃取、索氏抽提和 ASE 萃取三种方法对 isoGDGTs 的提取效率，发现三种方法得到的古气候指标（TEX86）值在1 误差范围内基本一致。Huguet 等59比较了BD 法、超声法、索氏抽提法、ASE、MAE 等多种提取方法，认为索氏提取法对于 IPL-GDGTs 的提取效果最佳，优于常用的 BD 法。随后，Lengger 等63比较了BD 法、索氏抽提法和ASE 法，发现三种提取方法对CL-GDGTs 的提取效率基本一致且良好，但对IPL-GDGTs 的提取效率则呈现：ASE 法索氏抽提法BD 法，其原因可能是较高的温度（ASE 法100，索氏抽提法 65）导致部分 IPL-GDGTs 降解，而常温下进行的 BD 法更好地保护了 IPL-GDGTs 的极性头基。王欢业等50对比了 BD 法和超声萃取法的提取效率，指出 BD 法对于 IPL-GDGTs 的提取效果更好，而超声萃取法对于 CL-GDGTs 的提取效率更高，但两种方法得到的古气候指标（TEX86、MBT、CBT）数值一致，说明不同提取方法并不影响古气候指标的计算。之后，Yang 等64也证实对于含有极性头基的 OH-GDGTs，使用 BD 法比超声萃取法的提取效率更高。综上可知，CL-GDGTs 的提取可以选择多种方法，而对于极性较强、热稳定性较差的IPL-GDGTs，应尽量选取 BD 法。2.2GDGTs 的分离与纯化方法在得到总脂类提取物后，需要从中进一步分离、纯化 GDGTs，这个过程通常采用柱层析法51，59-61，少数情况下采用制备液相色谱法40，65-66。前者适合常规的含量分析，后者或两者联用适合 GDGTs 的结构鉴定和同位素分析。柱层析法通常采用硅胶、氧化铝（Al2O3）等吸附剂作为固定相填料51，59-61。Al2O3作为固定相时，通常以正己烷-二氯甲烷、甲醇-二氯甲烷为淋洗液31，51，57。硅胶作为固定相时，通常以正己烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-乙酸乙酯等为洗脱液58，66。收集到的洗脱液通常包括非极性和极性两部分，其中 GDGTs 存在于极性组分，将其用氮表1地质环境样品中 GDGTs 的不同提取、分离、纯化方法Table1Differentextraction,separationandpurificationmethodsofGDGTsingeologicalenvironmentsamples.样品类型提取方法及提取剂分离及净化方法参考文献土壤BD 法，甲醇-二氯甲烷-磷酸缓冲液硅胶柱，正己烷/乙酸乙酯、乙酸乙酯、甲醇Pitcher 等（2009）土壤超声萃取法，甲醇、甲醇-二氯甲烷硅胶柱，正己烷/二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇Bai 等（2017）土壤、湖泊沉积物BD 法，甲醇-二氯甲烷-磷酸缓冲液硅胶柱，正己烷/乙酸乙酯、甲醇Buckles 等（2014）土壤、湖泊沉积物索氏抽提法，甲醇-二氯甲烷Al2O3柱，正己烷/二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇Hu 等（2016）黄土ASE，二氯甲烷-甲醇硅胶柱，二氯甲烷/乙酸乙酯Lu 等（2016）泥炭超声萃取法，二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇硅胶柱，正己烷/甲醇Zheng 等（2018）泥炭MAE，二氯甲烷-甲醇硅胶柱，二氯甲烷/甲醇Naafs 等（2017）海洋沉积物索氏抽提法，甲醇-二氯甲烷Al2O3柱，正己烷/二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇Liao 等（2020）海洋沉积物BD 法，甲醇-二氯甲烷-磷酸缓冲液硅胶柱，正己烷/乙酸乙酯制备 HPLC，正己烷/异丙醇Zhu 等（2013）湖泊沉积物ASE 法，二氯甲烷-甲醇Al2O3柱，二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇Chu 等（2017）湖泊沉积物ASE 法，二氯甲烷-甲醇Al2O3柱，正己烷/二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇Li 等（2023）湖泊沉积物ASE 法，二氯甲烷-甲醇Al2O3柱，二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇制备 HPLC，正己烷/异丙醇Weber 等（2015海洋、湖泊沉积物MAE 法，二氯甲烷-甲醇Al2O3柱，正己烷/二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇Escala 等（2009）湖泊水体悬浮颗粒物BD 法，甲醇-二氯甲烷-磷酸缓冲液Al2O3柱，正己烷/二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇Kumar 等（2019）第1期战楠，等：地质环境中生物标志物 GDGTs 分析技术研究进展第43卷33气吹干，溶解于合适的溶剂，过滤后即可上机分析3，40。柱层析色谱法的操作性强、分离效果好，但操作繁琐、溶剂消耗量大、容易产生误差。Sanchi等67提出一种采用固相萃取装置进行自动分离、净化的方法，使操作更简单、误差更小、重现性更高。对于 IPL-GDGTs，其含有的某些极性头基在硅胶柱净化、无水硫酸钠干燥、受热等过程中极易脱落63。为了避免 IPL-GDGTs 在分离、净化过程中损失，Huguet 等59提出一种间接测定 IPL-GDGTs的方法：首先把总脂类提取物平均分为两份，一份用Al2O3柱分离、净化，得到 CL-GDGTs 的含量；另一份在酸性条件下水解，使 IPL-GDGTs 丢失极性头基转化为 CL-GDGTs，由此得到的水解产物即是（IPL+CL）-GDGTs 的 总 和。最 后，用（IPL+CL）-GDGTs 减去 CL-GDGTs，差值即为 IPL-GDGTs 含量。但需注意这种“差减法”的误差比直接测量法大，尤其当 IPL-GDGTs 的浓度比 CL-GDGTs 低时应谨慎使用59。制备液相色谱法主要用于分离在柱层析法中不易分离或易损失的组分，如某些 GDGTs 单体、异构体或带有不稳定头基的 IPL-GDGTs22，39，66，68。Weijers 等18和 Weber 等40利用氨基制备色谱柱，通过制备液相色谱反复分离、纯化，从 brGDGTs 混合物中分离出高纯度、高浓度的 Ib 和 IIIa5，6组分。Zhu 等66采用两根极性正交的半制备色谱柱（一根分离正相体系的二醇基柱，一根分离反相体系的C18柱），通过制备液相色谱，从总脂类提取物中成功分离出 2 种带有糖苷头基的 IPL-GDGTs。3地质环境样品中 GDGTs 的分析技术地质环境中 GDGTs 的分析主要涉及含量分析、结构鉴定、同位素分析三方面，相关分析主要借助于高效液相色谱-质谱仪（HPLC-MS）3，51-54、气相色谱-质谱仪3，63，69-70、核磁共振波谱仪18，41，71和气相色谱-同位素比值质谱仪40，65，72。3.1GDGTs 含量分析CL-GDGTs 的分析通常采用高效液相色谱-大气压化学电离源-质谱法（HPLC-APCI-MS）。色谱柱一般选择氨基柱、氰基柱、硅胶柱等正相色谱柱，流动相一般选择正己烷-异丙醇51，73或者正己烷-乙酸乙酯55，74。采用 2 根 UPLC 色谱柱或 4 根HPLC 色谱柱串联，可以使 brGDGTs 的同分异构体（如a5、a5，6、a6与a7）达到较好的分离效果8，39-41，73。在正相液相色谱体系下，GDGTs 各组分的出峰顺序按照其质荷比（m/z）从大到小依次排列（图 2）。isoGDGTs 的 M+H+范围在 m/z12861304之间，出峰顺序通常为：GDGT-0GDGT-1GDGT-2GDGT-3 GDGT-4=Cren Cren。brGDGTs 的M+H+范围在 m/z10181050 之间，3 个系列的整体出峰顺序为：，系列内的出峰顺序为：abc，IIaIIbIIc，IaIbIc，但相邻系列组分的出峰顺序有时存在交叉的情况8。同分异构体（如a、b）的出峰顺序与其烷基侧链上甲基的位置有关，通常为：C5C6C7（图 2）。IPLs-GDGTs 带有极性头基，通常采用反相液相色谱（RP-HPLC）-电喷雾离子源-质谱仪（ESI-MS）分析59，66，75。Zhu 等66运用反相超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱，建立了一种可同时分析IPL-GDGTs 和 CL-GDGTs 的方法，该方法比传统的正相方法（HPLC-APCI-MS）的灵敏度更高、色谱峰形更尖锐，并且能够得到与之一致的古气候指标值。在该方法基础上，Chen 等75将 RP-HPLC-ESI-MS与多反应监测（MRM）技术结合，建立了一种更适合分析 IPL-GDGTs 的方法，其采用的 MRM 模式比常用的选择离子扫描（SIM）模式具有更好的特异性和灵敏度，提高了方法的准确度、稳定性及重现性，并且检出限更低。在质谱方面，单四极杆质谱和三重四极杆质谱是当前 GDGTs 分析最常用的质谱检测器。定量分析 通 常在 SIM 模 式 下 进 行，该 模 式 通 过 采 集GDGTs 各组分的特征离子 M+H+，使其灵敏度和重现性比全扫模式更好51。但由于四极杆质谱的分辨率不高，SIM 模式会导致 isoGDGTs 和 brGDGTs产生不同程度（18%36%）的离子损失，在一定程度上降低了定量结果及古气候指标的准确性76。近年来，功能强大的高分辨率质谱也开始应用于GDGTs 的分析，如静电场轨道阱质谱（Orbitrap-MS）77-78、傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）55，79。高分辨质谱与 HPLC 联用，可以实现样品中 GDGTs 结构和组成的全面表征，并有助于GDGTs 未知组分的鉴定。在离子源方面，CL-GDGTs 极性较低，所以通常采用常压化学电离子源（APCI）。与电喷雾源（ESI）相比，APCI 源的离子产率更高、准分子离子峰的强度更高3，51。近年来，也报道了采用大气压光致电离（APPI 源）成果77，79。APPI 源是一种新电离技术，其电离原理与 APCI 源相似，但其电离能量更低，对弱极性的 CL-GDGTs 的第1期岩矿测试http：/2024年34电离效果比 APCI 源更好，因此在未来分析中有很大潜力77，79。目前，GDGTs 定量分析主要采用内标法，通常以 GTGT-C46作为内标47，根据内标与待测组分M+H+离 子 的 峰 面 积 及 相 对 校 正 因 子 来 计 算GDGTs 含量。但实际上，C46内标与 GDGTs 各组分的理化性质、色谱行为、离子化效率、质谱响应等并不完全相同，因此根据其计算的 GDGTs 各组分含量并不十分准确。今后，随着 GDGTs 商用标准物质及同位素内标的出现，将改善定量分析的准确性。m/z 1036m/z 1034m/z 1032IIcIIb5GDGT-2GDGT-0GDGT-1m/z 1302m/z 1300m/z 1298354045505560TICm/z 1296m/z 1294m/z 1292CrenCrenGDGT-4GDGT-3IIIa6m/z 1050m/z 1048m/z 1046IIIa5IIIb6IIIb5IIIc5IIIb7IIb6IIa6IIa5Ia354045505560保留时间(min)m/z 1022m/z 1020m/z 1018IbIc相对强度图中分析条件：在正己烷-异丙醇梯度洗脱下，以 2 根 BEHHilic 色谱柱（150mm2.1mm1.7m）和 1 根硅胶色谱柱（150mm2.1mm1.9m）串联，经 HPLC-APCI-MS 分析，实现 GDGTs 各组分良好分离。Analyticalcondition:undergradientelutionofn-hexane/isopropanol,thegoodseparationofGDGTswereachievedbyHPLC-APCI-MSmethodwithtwoBEHHiliccolumns(150mm2.1mm1.7m)andonesilicacolumn(150mm2.1mm1.9m)intandem.图2内蒙古双沟山天池湖泊沉积物中 GDGTs 的液相色谱总离子流图和提取离子流图Fig.2Total ion chromatogram(TIC)and extracted ion chromatogram(EIC)of GDGTs identified in lake sediment of LakeShuanggoushan,InnerMongolia.ThechromatogramgeneratedbyHPLC-APCI-MSshowingtheelutionorderofbrGDGTsandisoGDGTswithM+H+ions.第1期战楠，等：地质环境中生物标志物 GDGTs 分析技术研究进展第43卷35不同化合物在不同仪器上或同一台仪器在不同时间检测时，会因为仪器的设置参数或状态的改变而导致响应值发生改变，因此开展 GDGTs 分析方法验证十分必要。2009 年，Schouten 等80组织了全球 15 个实验室间的比对，采用 HPLC-APCI-MS 法对 2 个海洋沉积物样品进行分析，通过比较 2 种GDGTs 古气候指标来评估分析方法的准确性和可靠性。比对结果表明，TEX86指标在实验室内的重复性结果和实验室间的再现性结果均较好，对应的温度误差分别在 12 之间和 34 之间；而 BIT 指标在同一实验室内的重复性较好，但实验室间的再现性结果不理想，其原因可能是 BIT 指标同时涉及brGDGTs 和 isoGDGTs，而两者在不同质谱仪上的响应差异较大，导致 BIT 值有较大不同80。2013 年，第二轮全球实验室间比对分析表明两种指标的结果均比第一次有所改善，TEX86指标的再现性温度误差降低至 1.33.0，与海洋其他古温度指标的误差相近81。但 BIT 指标实验室间的再现性结果依然不理想，这可能与仪器结构、参数设置等有关。Escala等60和 Schouten 等80-81建议后续可采用已知BIT 值的样品先对质谱进行校正，再进行 BIT 指标的测定。3.2GDGTs 结构鉴定GDGTs 的 结 构 鉴 定 通 常 借 助 高 分 辨 质 谱（HRMS）、气相色谱-质谱（GC-MS）和核磁共振波谱（NMR）18，42，63，70。依据 HRMS 提供的质子化分子离子峰的精确质量数及其同位素峰的相对丰度，可以推测 GDGTs 的分子式77，79。再根据质谱的一级、二级碎片离子，结合质谱裂解规律，可以推测出 GDGTs 可能分子结构41-42。但是，应用 HRMS不能揭示同分异构体间的微小结构差异（如a5与a6）39。“醚键裂解法”是将结构复杂的 GDGTs 转化为分子量更小、结构更简单的组分，以便进行更精准的结构解析。该法通过裂解 GDGTs 分子结构中的醚键，将其转化为卤代烃和甘油两部分，再将卤代烃还原为支链烷烃，之后用 GC-MS 对烷烃进行分析。根据特征碎片离子、保留时间、保留指数等信息，结合文献和质谱标准谱库，可以推断出烷烃部分的结构，再结合甘油的构型，最终得到 GDGTs 完整的分子结构39-41，72，82-83。在电子轰击电离源下，烷烃的支链节点通常会优先断裂，形成强度较高的特征碎片离子，这一规律可以用来判断烷烃侧链上甲基支链的位置，从而实现 5-甲基、6-甲基等 brGDGTs 位置异构体的鉴别39-41。上述方法最初用于鉴定isoGDGTs的分子结构69-70，近来也被用于 brGDGTs 和 OH-GDGTs 等物质的结构解析39-41，82。常规气相色谱的工作温度上限在 300350之间，难以将 GDGTs 汽化，而高温气相色谱（HT-GC）的工作温度上限达到 400450，可以将 GDGTs 汽化而实现直接分析。Weijers 等18和 Pancost 等72运用配有火焰离子化检测器的 HT-GC，在 140420的程序升温下实现 CL-GDGTs 的分析。Sutton 等83利用 HT-GC 结合飞行时间质谱仪，在 20min 内实现isoGDGTs 的快速分析。核磁共振氢谱（1H-NMR）、碳谱（13C-NMR）及二维核磁共振技术（如 HSQC、HMBC、COSY）也是解析 GDGTs 结构时常用的分析手段，其提供的大量分子结构信息可与 HPLC-MS、GC-MS 等结果相互验证18，44，71，82。但 NMR 的局限性在于其灵敏度较低且为非选择性分析，故要求测试样品的纯度高（通常90%），并且待测组分的含量达到 mg 级才能保证信号强度。但是，将 GDGT 单体从结构相似的同系物、异构体中分离、富集并不容易，Liu 等82从1kg 干重的海洋沉积物中仅分离出 0.6mg 的 GDGT单体。鉴于此，目前只有个别 GDGTs 组分（如a、b、a）的结构得到 NMR 验证18，44，71。今后，可以尝试应用天然产物、药物代谢等领域常用的HPLC-NMR 联用技术，简化操作流程，实现更高效、便捷的 GDGTs 结构解析84。3.3GDGTs 同位素分析GDGTs 的同位素组成蕴含着重要的生物和环境信息65，85-90。在缺氧环境中，可以通过测定沉积物中 isoGDGTs 的 13C 值，揭示是否存在甲烷厌氧氧化古菌61。湖泊沉积物和湖水悬浮颗粒物中brGDGTs 的 13C 值，可以帮助判断 brGDGTs 的来源 及 其 母 源 细 菌 的 代 谢 途 径 87-88。海 洋 中isoGDGTs 的 13C 值可以指示在古海洋生产力的演变历史89。海洋沉积物中 isoGDGTs 的14C 年龄可以揭示其母源微生物的来源68，还可以与海洋中其他生物标志物（如浮游有孔虫、长链烯酮）的年龄对比验证90-91。当前，稳定碳、氢同位素分析主要采用气相色谱-同位素比值质谱（GC-C/TC-IRMS）技术40，61，65，87-89。在分析前，GDGTs 先要经过“醚键裂解”转化为分子量更小、挥发性更强的烷烃，然后再进行 GC-C/TC-IRMS 分析61，69-70，85。Pearson 等89利用线轴微燃烧技术建立一种直接测定 isoGDGTs 碳同位素的第1期岩矿测试http：/2024年36方法，避免了“醚键裂解”过程可能引起的同位素分馏效应，提高了方法的准确度和精密度（在 1 范围内误差仅为0.25），但该法由于涉及仪器改装因此并不普及。Lin 等86提出一种测定 IPL-GDGTs 糖苷头基 13C 的方法，该法将 IPL-GDGTs 水解得到的糖苷头基衍生、净化，再由 GC-C-IRMS 测定，结果表明糖苷头基比其烷烃骨架更富集 13C（偏移量可达15），这种分子内稳定同位素分测试技术为探索GDGTs 头基和骨架的代谢提供新的视角和方式。GDGTs 氢同位素组成可以指示氢的来源、重建降水、海拔等变化趋势，但目前相关研究较少22，70。Huguet 等22应用稳定同位素探针技术，将富含brGDGTs 的天然泥炭样品在重水和13C 标记的碳酸氢钠中培养，然后利用 IR-GCMS 测定培养后样品brGDGTs 的D 和13C 值，首次量化了泥炭中brGDGTs的生产率。Kaneko 等70提出了一种运用 GC-IRMS 测定 isoGDGTs 烷基侧链 D 值的方法，该法通过“醚键裂解法”将 isoGDGTs 转化为卤代烃，利用 H2/PtO2将卤代烃还原为饱和烃，再通过 GC-IRMS 分析获得氢同位素组成。结果表明，醚键裂解过程不存在 D 分馏效应，而 H2/PtO2氢化过程存在一定程度的 D 分馏，但通过质量平衡校正，可以获得较准确的 D 值70。2021 年，Lengger 等92利用 HT-GC 结 合 IRMS 开 发 了 一 种 可 直 接 测 定GDGTs 中 D 值的方法，该法不需要“醚键裂解”等过程，操作简单、分析误差小，但由于 HT-GC 尚未普及，因此其应用仍然有限。近年来，放射性碳同位素技术在 GDGTs 高精度定年、古环境示踪、海洋碳循环等研究中逐渐兴起68，90-91。放射性碳同位素的分析主要借助加速器质谱仪，测试样品的最低含碳量约为 100gC93。为满足测试要求，一般需要从大量环境样品中提取、分离、纯化，才能获取足够量、纯度高的 GDGTs 单体18，90，如 Haghipour 等94从 3kg 土壤样品中仅提取出 15gC。2021 年，Gies 等90提出一种无需分离 GDGTs 单体，仅按 brGDGTs 和 isoGDGTs 分类即可测定14C 的方法，将初始的取样量降低至 500g，大幅简化了前处理操作，并且对于年龄小于 1800y的样品，只需 20gC 的上样量就可以获得准确、精密的14C 年龄结果。4结语与展望近二十年来，GDGTs 的分析技术和方法取得长足进步，这为古气候重建、全球气候变化等研究提供了极大助力。目前，地质环境中 GDGTs 的样品前处理方法已相对成熟，以 HPLC-MS、GC-MS、NMR、GC-IRMS 为主的技术手段也成为分析 GDGTs 的重要工具，但现有方法在分离、纯化、准确定量等方面仍然存在一些问题亟待解决：标准化问题。当前已有多种 GDGTs 分析方法，但尚缺乏测定 GDGTs的标准化方法和程序，不同实验室和实验人员使用的前处理方法、仪器方法和数据处理方法的差异，均会影响结果的比较和重复性的验证。方法效率问题。现有提取、分离和纯化方法较为复杂，操作难度较高；HPLC-MS 定量分析用时较长，分析效率较低。GDGTs 未知组分问题。环境中仍然存在一些结构未知的 GDGTs 新组分。样品中这些未知组分的存在，不仅可能影响分析结果的准确性，还可能给古气候指标带来误差。因此，建议今后分析方法的发展应重点考虑以下方面：建立 GDGTs 标准分析方法。亟需开展GDGTs 分析方法标准化研究，并建立相应的质量控制与评价体系，从而提高分析结果的可靠性及可比性。开发便捷、高效的 GDGTs 分析方法。包括：开发分离性能更好的色谱柱，以简化现有串连 24根色谱柱的 HPLC 方法；开发操作更简单、自动化程度更高的提取、分离及净化方法；运用高精度的HRMS，开发更加灵敏、准确的定性及定量方法。开展环境中 GDGTs 未知组分的识别与结构解析研究。综合运用 HPLC-HRMS、GC-MS、NMR 等技术手段，进一步识别环境中 GDGTs 未知组分，从而更好地表征环境中 GDGTs 的分布及组成。加强GDGTs 同位素技术方法研究。亟待开发进样量更小、操作更简便的同位素技术及方法，并拓展其应用。第1期战楠，等：地质环境中生物标志物 GDGTs 分析技术研究进展第43卷37Research Progress in Analytical Methods of Biomarker GDGTs inGeological EnvironmentsZHAN Nan1,2，SUN Qing1*，LI Qi3，XIE Manman1，SHANG Wenyu1，HAO Ruixia2（1.National Research Center for Geoanal