实验十-血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的测定.doc

实验十、血液转氨酶（谷丙转氨酶）活力的测定（实验：肝脏谷丙转氨酶活力测定）（本实验分2个实验完成：一、制作标准曲线 二、测酶活力和总结。或就做二就可以）【目的和要求】1、 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，2、 学习转氨酶活力测定的原理和方法。3、 熟悉分光光度计的使用。【原理】生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化-氨基酸的-氨基与-酮基酸的-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。它们催化的反应如下。正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，其吸收光谱的峰为439530nm，因此在波长520nm处吸光度度增加的程度与反应体系中丙酮酸与-酮戊二酸的摩尔比基本呈线性关系，故可藉可用分光光度法测定。从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。【试剂和器材】一、试剂1.试管及试管架2.吸管3.恒温水浴4.分光光度计5、移液管6、电子天平7、研钵8、容量瓶9、冰箱二、器材1、标准丙酮酸溶液标准丙酮酸（500g/ml）：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于pH7.4 0.1M 的PBS中，定容到100ml。现用现配。2、谷丙转氨酶底物：0.90g L-丙氨酸，29.2mg -酮戊二酸，先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。然后用1 M NaOH调节pH到7.4，再用pH7.4 0.1mol/L的PBS定容到100ml，贮存于冰箱中，可使用1周。3、0.1mol/L pH7.4 PBS：称取13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于蒸馏水中，定容到1000ml。4、0.02% 2.4-二硝基苯肼溶液：称取20mg 2.4-二硝基苯肼溶于少量的1mol/L HCl中。把锥形瓶放在暗处并不时摇动（或加热溶解），待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，用1mol/L HCl定容到100ml。滤入棕色玻璃瓶内置 冰箱内保存。5、0.4mol/L NaOH ：称取16g NaOH定容到1000ml。6、0.9%生理盐水：称取0.9gNaCl，定容到100ml。【操作方法】一、标准曲线的给制：取6支试管，分别标上0，1，2，3，4，5六个号。按下表所列的次序添加各试剂。2,4-硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的-酮戊二酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成-酮戊二酸苯腙。因此，在制作标准曲线时，须加入一定量的底物，（内含-酮戊二酸）以抵消由-酮戊二酸产生的消光影响。先将试管置于37恒温水浴中保温10min以平衡内外温度。向各管内加入0.5ml2，4-二硝基苯肼溶液后再保温20min，最后，分别向各管内加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min，以0号管作空白，测定520nm的光吸收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。（总图如下）二、谷丙转氨酶活力的测定（学生只做这个）1、样品的制备（集体制备）将鸡处死，取肝脏后用生理盐水冲洗，滤纸吸干后，称取0.5g 肝脏，剪成小块，加入预冷（冰水或冰箱中）的pH7.4的PBS 4.5ml，在冰水浴中制成10%的匀浆， 4000rpm冷冻离心10分钟后保存在冰水中备用。（一组按10ml算：10ml*N）2、酶活力的测定：取6支试管，按下表操作：测定管（A）标准管（S）对照管（B）空白管谷丙转氨酶底物（ml）0.50.537水浴5min肝匀浆（或血清）（ml）0.1丙酮酸0.1ml0.1水0.1ml混匀后，37水浴准确保温30min2,4-二硝基苯肼（ml）0.50.50.50.5谷丙转氨酶底物（ml）0.50.5混匀后，37水浴准确保温20minNaOH（ml）5.05.05.05.0混匀后，静置10minA5203、计算：每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位： D=(A-B) 500/S2.5=(A-B) 200/S D:每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位(U/ml) 式中 A:样品管吸光度值 B:对照管吸光度值 S:标准管吸光度值 500:标准丙酮酸溶液 2.5浓度谷丙转氨酶的换算单位系数【注意事项】1. 在测定SGPT时，应事先将底物、血清在37水浴中保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。2. 标准曲线上数值在20500U是准确可靠的，超过500U时，需将样品稀释。3. 转氨酶只能作用于L氨基酸，对D氨基酸无作用。实验室多用DL氨基酸（较L氨基酸价廉），若用L氨基酸，则用量减半。4. 溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高，会影响测定效果。5. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。6 酶在37下与底物作用30min后，以能产生2.5g的丙酮酸为一个活力单位。7 -酮戊二酸也能产生苯腙，但在520nm下远较丙酮酸的低。8 -酮戊二酸和2,4-二硝基苯肼对显色有一定干扰，注意添加量琼州学院实验项目卡生命科学 系 生化 实验室 开设日期_年_月_日实验项目血液转氨酶（谷丙转氨酶）活力的测定面向专业课程性质1、必修2、选修实验类型1、还未开设的新实验2、手段更新的实验3、已开设过的实验本实验学时数4实验分组概况所用主要仪器名 称型号规格数量名 称型号规格数量试管及试管架若干冰箱1移液管各规格若干恒温水浴箱1分光光度计6所用主要药品名 称纯度级别数量名 称纯度级别数量0.1mol/L磷酸缓冲液pH7.4磷酸氢二钾30ml*N氯化钠0.9%500ml磷酸二氢钾2，4-二硝基苯肼0.02%20ml*N丙酮酸钠2.0mol/ml200ml盐酸1mol/L25ml*N谷丙转氨酶底物-酮戊二酸20ml*NDL-丙氨酸氢氧化钠1 mol/L 30ml*N0.4 mol/L40ml*N其他血清或肝脏（兔子、当节课提取）实验情况记录实验教师签名_实验员（管理员）签名_