实验十-血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的测定.doc

实验十、血液转氨酶（谷丙转氨酶）活力的测定
（实验：肝脏谷丙转氨酶活力测定）
（本实验分2个实验完成：一、制作标准曲线 二、测酶活力和总结。或就做二就可以）
【目的和要求】
1、 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，
2、 学习转氨酶活力测定的原理和方法。
3、 熟悉分光光度计的使用。
【原理】
生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。它们催化的反应如下。
正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。
测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。
丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，其吸收光谱的峰为439—530nm，因此在波长520nm处吸光度度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的摩尔比基本呈线性关系，故可藉可用分光光度法测定。从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。
【试剂和器材】

一、试剂
1.试管及试管架
2.吸管
3.恒温水浴
4.分光光度计
5、移液管
6、电子天平
7、研钵
8、容量瓶
9、冰箱
二、器材
1、标准丙酮酸溶液[标准丙酮酸（500μg/ml）]：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于pH7.4 0.1M 的PBS中，定容到100ml。现用现配。
2、谷丙转氨酶底物：0.90g L-丙氨酸，29.2mg α-酮戊二酸，先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。然后用1 M NaOH调节pH到7.4，再用pH7.4 0.1mol/L的PBS定容到100ml，贮存于冰箱中，可使用1周。
3、0.1mol/L pH7.4 PBS：称取13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于蒸馏水中，定容到1000ml。
4、0.02% 2.4-二硝基苯肼溶液：称取20mg 2.4-二硝基苯肼溶于少量的1mol/L HCl中。把锥形瓶放在暗处并不时摇动（或加热溶解），待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，用1mol/L HCl定容到100ml。滤入棕色玻璃瓶内置 [冰箱内保存]。
5、0.4mol/L NaOH ：称取16g NaOH定容到1000ml。
6、0.9%生理盐水：称取0.9gNaCl，定容到100ml。
【操作方法】
一、标准曲线的给制：取6支试管，分别标上0，1，2，3，4，5六个号。按下表所列的次序添加各试剂。

2,4-硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的α-酮戊二酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成α-酮戊二酸苯腙。因此，在制作标准曲线时，须加入一定量的底物，（内含α-酮戊二酸）以抵消由α-酮戊二酸产生的消光影响。
先将试管置于37℃恒温水浴中保温10min以平衡内外温度。向各管内加入0.5ml2，4-二硝基苯肼溶液后再保温20min，最后，分别向各管内加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min，以0号管作空白，测定520nm的光吸收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。（总图如下）

二、谷丙转氨酶活力的测定（学生只做这个）
1、样品的制备（集体制备）
将鸡处死，取肝脏后用生理盐水冲洗，滤纸吸干后，称取0.5g 肝脏，剪成小块，加入预冷（冰水或冰箱中）的pH7.4的PBS 4.5ml，在冰水浴中制成10%的匀浆， 4000rpm冷冻离心10分钟后保存在冰水中备用。（一组按10ml算：10ml*N）
2、酶活力的测定：
取6支试管，按下表操作：

测定管（A）
标准管（S）
对照管（B）
空白管
谷丙转氨酶底物（ml）
0.5
0.5

37℃水浴5min
肝匀浆（或血清）（ml）
0.1
丙酮酸0.1ml
0.1
水0.1ml

混匀后，37℃水浴准确保温30min
2,4-二硝基苯肼（ml）
0.5
0.5
0.5
0.5
谷丙转氨酶底物（ml）

0.5
0.5

混匀后，37℃水浴准确保温20min
NaOH（ml）
5.0
5.0
5.0
5.0

混匀后，静置10min
A520

3、计算：每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位：
D=(A-B) ×500/S×2.5=(A-B) ×200/S
D:每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位(U/ml)
式中 A:样品管吸光度值
B:对照管吸光度值
S:标准管吸光度值
500:标准丙酮酸溶液
2.5浓度谷丙转氨酶的换算单位系数
【注意事项】
1. 在测定SGPT时，应事先将底物、血清在37℃水浴中保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。
2. 标准曲线上数值在20~500U是准确可靠的，超过500U时，需将样品稀释。
3. 转氨酶只能作用于α－L－氨基酸，对D－氨基酸无作用。实验室多用α－DL－氨基酸（较L－氨基酸价廉），若用L－氨基酸，则用量减半。
4. 溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高，会影响测定效果。
5. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。
6．  酶在37℃下与底物作用30min后，以能产生2.5μg的丙酮酸为一个活力单位。
7．  α-酮戊二酸也能产生苯腙，但在520nm下远较丙酮酸的低。
8．  α-酮戊二酸和2,4-二硝基苯肼对显色有一定干扰，注意添加量
琼州学院实验项目卡
生命科学 系 生化 实验室 开设日期____年___月___日
实验项目
血液转氨酶（谷丙转氨酶）活力的测定
面向专业

课程性质
1、必修
2、选修
实验类型
1、还未开设的新实验
2、手段更新的实验
3、已开设过的实验
本实验学时数
4
实验分组概况

所用主要仪器
名 称
型号规格
数量
名 称
型号规格
数量
试管及试管架

若干
冰箱

1
移液管
各规格
若干

恒温水浴箱

1

分光光度计

6

所用主要药品
名 称
纯度级别
数量
名 称
纯度级别
数量
0.1mol/L磷酸缓冲液pH7.4
磷酸氢二钾
30ml*N
氯化钠
0.9%
500ml
磷酸二氢钾
2，4-二硝基苯肼
0.02%
20ml*N
丙酮酸钠
2.0μmol/ml
200ml
盐酸
1mol/L
25ml*N
谷丙转氨酶底物
α-酮戊二酸

20ml*N

DL-丙氨酸

氢氧化钠
1 mol/L
30ml*N

0.4 mol/L
40ml*N

其他
血清或肝脏（兔子、当节课提取）
实验情况记录

实验教师签名______________________
实验员（管理员）签名______________