基于网络药理学探讨雷公藤红素改善奥沙利铂引起的外周神经病变的作用机制.pdf

基金项目:广东省自然科学基金面上项目(.)作者简介:许嘉越女硕士生研究方向:药理与毒理学:.通信作者:金晶女博士副教授研究方向:药理与毒理学:.基于网络药理学探讨雷公藤红素改善奥沙利铂引起的外周神经病变的作用机制许嘉越张庚弋江诗琴秦之焱黄民金晶(中山大学药学院广东 广州)摘要:目的 结合实验与网络药理学探讨雷公藤红素改善奥沙利铂引起的外周神经病变()的作用与机制 方法 对大鼠进行奥沙利铂与雷公藤红素的合用给药考察雷公藤红素对 的改善作用 使用中药系统药理学数据库与分析平台()、和 数据库收集雷公藤红素靶点并从 和 数据库中获取奥沙利铂引起的外周神经病变的靶点取两者交集利用 软件构建“雷公藤红素靶点”网络图采用 数据库构建雷公藤红素改善 靶点的蛋白蛋白相互作用()网络图应用 数据库对交集靶点进行 功能富集分析和 通路富集分析以及运用 软件对核心靶点进行分子对接验证 结果 雷公藤红素能明显改善奥沙利铂引起的大鼠机械和冷刺激痛敏症状减轻背根神经节神经元和坐骨神经的病理损伤且在体外水平上不影响奥沙利铂对结肠癌细胞的杀伤作用 网络药理学分析获得雷公藤红素靶点 个 疾病靶点 个两者交集靶点 个 相互作用网络分析得到、等核心靶点 富集分析得到 个条目 结果表明雷公藤红素可能作用于白细胞介素()信号通路和/信号通路起到对 的改善作用分子对接结果进一步表明雷公藤红素与核心靶点、的结合能力良好 结论 雷公藤红素具有改善奥沙利铂引起的外周神经病变的作用网络药理学揭示该机制可能涉及多靶点、多通路的调节关键词:雷公藤红素奥沙利铂外周神经病变网络药理学分子对接作用机制中图分类号:文献标志码:文章编号:():./.():().().药学研究 ./.:奥沙利铂引起的外周神经病变()是奥沙利铂化疗中常见的副作用发生率可达 其主要表现为感觉功能异常和精细运动协调障碍严重影响患者生活质量导致用药依从性降低甚至治疗计划的提前终止 尽管研究发现一些抗炎和抗抑郁类药物展现出一定的改善作用截止目前仍未有药物获批应用于 的临床治疗寻找针对 有良好防治效果的药物和治疗靶点具有十分重要的意义雷公藤红素()是中药雷公藤的重要活性成分之一属木栓烷型五环三帖类化合物具有良好的抗肿瘤、抗炎、抗肥胖、免疫抑制、神经保护等药理活性 研究发现在 脊神经结扎的神经病理性疼痛模型小鼠模型中雷公藤红素灌胃给药能明显改善小鼠的机械痛敏行为在完全性弗氏佐剂诱导的炎性疼痛大鼠模型中给予腹腔注射雷公藤红素治疗发现抑制了背根神经节高迁移率族蛋白()、核转录因子()和白细胞介素()及蛋白的表达减轻了完全性弗氏佐剂诱发的热痛敏 这些结果表明雷公藤红素具有减轻神经炎症和神经疼痛的作用但关于雷公藤红素能否能够改善化疗药物引起的外周神经病变及其潜在机制的研究尚未得到报道网络药理学以系统生物学、基因组学、蛋白质组学等学科理论为基础通过组学、网络可视化和网络分析等技术解析药物、靶点和疾病间的相互关系由此预测药物潜在作用机制 网络药理学突破了“一药一靶”的限制在以中药为代表的复杂体系的药理研究中有着不可替代的优势并在中药活性化合物、中药药理学等研究领域得到了广泛应用 基于此本文采用实验与网络药理学分析相结合的方法拟通过体内外实验初步确证雷公藤红素是否具有改善 的作用进而分析预测药物的作用靶点和潜在作用机制旨在为 治疗提供新的理论依据 材料与方法.实验动物与细胞 级雄性 大鼠 只 周龄体重 购于广东省医学实验动物中心使用许可证号:(粤)饲养于中山大学实验动物中心(大学城)级屏障环境温度 相对湿度 交替光照饮用水和灭菌饲料自由摄取动物实验经中山大学动物伦理与福利委员会批准(批准编号:)细胞和 细胞源自中山大学药学院微生物与生化药学实验室的馈赠.药物试剂与仪器奥沙利铂和雷公藤红素购于上海源叶生物科技有限公司 购自北京索莱宝科技有限公司多聚甲醛通用型组织固定液购于北京兰杰柯科技有限公司胎牛血清(美国 公司)培养基(美国 公司)试剂盒(日本同仁化学研究所)针刺痛觉测试套件(美国 公司)研究级生物显微镜(日本 公司)水套式培养箱(美国 公司)多功能酶标仪(美国 公司).动物实验.动物分组及给药 将 只雄性大鼠随机分为 组每组 只 奥沙利铂溶解于 葡萄糖溶液雷公藤红素溶解于载体溶液(乙醇)中 根据是否进行 造模和雷公藤红素给药治疗分为以下几组:空白对照组()模型对照组:雷公藤红素低剂量组:雷公藤红素高剂量组:参照文献中的方法对大鼠进行每周两次的奥沙利铂腹腔注射给药造模持续 周给药的时间定在实验总日程周期的第、药学研究 .天 雷公藤红素则从第 天开始进行灌胃给药每天 次持续 .大鼠机械刺激痛敏测定 试验 于实验前()、实验第、天采用 试验纤维针刺激的方法对大鼠的机械刺激痛觉敏感性进行测试 将大鼠置于安静房间中的有机玻璃箱内使之适应测试环境 待其安静 采 用 文 献 中的“上 下 法()”的刺激模式进行测试使用规格为.、.、.、.、.、.、.、.的纤维针作用于大鼠左侧掌跖部无毛处作用时间 视抬足、抖动足或舔舐被刺激侧为阳性反应记录下刺激的响应模式计算出每只足底的 刺激响应阈值对于每只大鼠取计算出的左右两足响应阈值的平均值作为该个体的机械刺激痛觉敏感结果.大鼠冷刺激痛敏测定 冷板法参照文献中的方法于实验前()实验第、天采用冷板法评估大鼠对冷刺激的痛觉敏感性 将金属薄板置于冰上外罩透明有机塑料罩待板表面温度稳定在 以下后将大鼠放入罩中的金属板上持续 记录下 内出现的所有冷刺激表现(身体颤抖、抬足、快速走动、跳跃等)对每只大鼠重复测定 次每次间隔 以上 将记录到的冷刺激反应按表 换算成反应得分每只大鼠的冷刺激痛敏结果为 次测定的得分取平均值表 大鼠冷刺激痛敏反应评分冷刺激反应得分无反应.轻蜷前爪身体轻颤.前爪蜷缩身体颤抖.持续紧握前爪身体抖动.前爪轻抖后爪轻抬、轻跺.前爪持续抖动抬动后爪、跺脚.舔舐前后爪跳动.大鼠背根神经节、坐骨神经 染色切片观察与病理学评价 于实验第 天收集各组大鼠背根神经节()与坐骨神经浸泡于 多聚甲醛室温避光固定 然后将组织样本送至武汉塞维尔生物科技有限公司进行脱水、石蜡包埋、切片和苏木精与伊红()染色 染色后的组织切片于光学显微镜下观察、拍照和定量分析 对于背根神经节每组选取 只大鼠每只量化 个随机视野中核仁偏移和多核仁神经元的数量对于坐骨神经每组选取 只大鼠每只量化 个随机视野中免疫细胞浸润情况以、的分数分别表示、和大于 的浸润.细胞实验.细胞培养及分组 和 细胞接种于含有 胎牛血清和 双抗的 培养基中置于含 的 培养箱中培养设置对照组()、单给奥沙利铂组(和 )、奥沙利铂合用低剂量雷 公 藤 红 素 组(.和 .)、奥沙利 铂 合 用 高 剂 量 雷 公 藤 红 素 组(和 ).检测结肠癌细胞存活率 取 和 细胞按照 个/孔的密度接种于 孔板贴壁生长过夜后于次日取出进行细胞给药再继续培养 于避光条件下用无血清培养基配制浓度 的 溶液将 孔板从培养箱中取出吸弃孔中培养基每孔加入 溶液置于 培养箱中孵育 使用酶标仪测定 波长处各孔吸光度值计算各组细胞存活率.网络药理学分析.雷公藤红素与 靶点的预测 以“”为关键词在中药系统药理学数据库与分析平台(:/./.)检索获得雷公藤红素靶点通过 数据库(:/./)转化为对应基因名称从 数据库获取雷公藤红素的 结构文件导入 数据库(:/./)和 数据库(:/./)进行靶点预测 对以上获得的靶点进行整合和去重 以“”为关键词在 数据库(:/./)和 数据库(:/./)中检索收集 相关靶点并进行去重 将雷公藤红素靶点与 靶点取交集获得雷公藤红素改善 作用的潜在靶点.“雷公藤红素”靶点网络构建筛选出的“雷 公 藤 红 素 ”交 集 靶 点 导 入 到.软件生成雷公藤红素与 的“药物靶点疾病”可视化网络图 将共有靶点输入到 数据库在线分析平台(:/.药学研究 ./)设置物种为“”进行蛋白质蛋白质相互作用()网 络 构 建 再 将 该 网 络 导 入通过 计算度值分析关键靶点信息.雷公藤红素改善 的 功能和 通路富集分析采用 平台(:/./.)对雷公藤红素改善 的潜在靶点进行基因本体论()功能 和 京 都 基 因 与 基 因 组 百 科 全 书()通路富集分析设定显著性.筛选出靶点富集的生物过程和代谢通路 通过微生信分析平台以条形图形式输出 功能富集分析结果以气泡图形式输出 通路富集分析结果.分子对接验证采用 ()软件进行对雷公藤红素和潜在关键靶点蛋白进行分子对接验证 从 数据库(:/./)下载人源、分辨率较高(.)、具有配体的靶点蛋白复合物晶体结构导入 软件通过去除水分子和杂原子并添加电荷和氢原子的方式进行预处理 导入雷公藤红素的 文件与靶点蛋白进行对接选择亲和力高、结合能低的构象作为最终对接结果.统计分析 使用 .软件进行数据统计分析和实验结果图标绘制两组比较采用 检验和 检验多组比较采用单因素方差分析和 检验.认为差异有统计学意义 结果.雷公藤红素改善大鼠奥沙利铂引起的外周神经病变症状 在 测试中与空白对照组相比 模型对照组 爪缩阈值明显降低(见图.)与 模型对照组比较给予雷公藤红素治疗后从第 天后的行为学测试均观察到爪缩阈值的明显升高(.)冷板测试中 组与空白对照组比较冷刺激反应评分也从第 天后表现出明显的增高(见图.)而雷公藤红素合用治疗则明显减轻了 注射造模导致的冷刺激反应评分增高的现象(.)且高剂量组的效果更稳定 综上可见雷公藤红素具有缓解奥沙利铂诱导的大鼠机械痛敏和冷痛敏的作用.测试结果.冷板法测试结果图 雷公藤红素对 大鼠行为学表现的影响()注:与空白对照组相比.与模型对照组对比.雷公藤红素减轻 大鼠神经病理损伤如图 空白对照组 神经元形态正常坐骨神经未见炎性细胞浸润 与空白对照组相比 组 神经元细胞质空泡化出现了明显的核仁偏移和多核仁现象(见图 中红色三角形标注)坐骨神经中可见炎性细胞浸润(深色颗粒)且以上异常细胞数目均体现出明显提升(见图.)合用雷公藤红素治疗组相比 模型对照组 神经元中偏核和多核的数目明显降低(.)外观趋于正常坐骨神经中炎性浸润程度减轻 上述结果表明雷公藤红素在组织病理学水平上对大鼠 关键组织起到改善保护作用.背根神经节神经元和坐骨神经 染色结果.神经元、坐骨神经中损伤统计分析图 雷公藤红素对 大鼠神经病理的影响()注:与空白对照组相比.与模型对照组对比.雷公藤红素不影响奥沙利铂对癌细胞的杀伤作用 分别对小鼠结肠癌细胞 和人结肠癌细胞 进行奥沙利铂与雷公藤红素的合用药试验考察合用药相比单给奥沙利铂对细胞存活率的影响 结果如图 显示单给不同浓度的奥沙利铂相较于对照组癌细胞存活率明显降低(.药学研究 .)而合用高、低剂量的雷公藤红素相比于 组癌细胞存活率进一步下降(.)或无明显差异 这表明体外水平上雷公藤红素与奥沙利铂合用不会削弱奥沙利铂对癌细胞的杀伤作用.检测小鼠结肠癌细胞 合用药存活率的结果.人结肠癌细胞 合用药存活率的结果图 雷公藤红素合用奥沙利铂对结肠癌细胞存活率的影响()注:与对照组相比.与单给奥沙利空白组对比.雷公藤红素治疗 的潜在靶点预测检索、和 数据库经去重后获得雷公藤红素靶点 个对 和 数据库进行检索去重后得到 疾病靶点 个 将获取到的雷公藤红素及 疾病靶点导入微生信在线作图平台构建 图(见图)预测“雷公藤红素”共同靶点取交集得到潜在靶基因 个图 “雷公藤红素”交集靶点 图.雷公藤红素 靶点网络分析将“.”项下获得的交集基因导入 .软件绘制出“雷公藤红素靶点”的可视化网络图(见图)其中包括了 个节点 条相互作用的连接边连线表示靶点与雷公藤红素、之间的相互作用.“雷公藤红素”交集靶点的 网络分析将获得的交集基因导入 在线分析平台得到 网络(见图)利用 对交集基因进行网络参数拓扑分析其中包含 个相互关联的节点 条边平均局部聚类系数.平均节点度值.度值排名前 的靶点的具体信息见表 图 “雷公藤红素共有靶点”网络图 “雷公藤红素”交集靶点 网络表 网络靶点信息靶点名称度值中间中心性.雷公藤红素改善 靶点的 分析和 富集分析为了进一步探究雷公藤红素改善 靶点的生物过程和信号通路利用 数据库对 个靶基因进行 功能富集分析根据药学研究 .共筛选出 个条目其中包括生物学过程()个条目细胞组成()个条目分子功能()个条目 选取基因数量 的条目绘制 功能分析图(见图)结果表明雷公藤红素主要作用于胞液()、细胞质()、细胞核()、核 浆()、外 泌 体()、线粒体()、胞外区域()等涉及分子功能包括蛋白质结合()、相同蛋白质结合()、结合()、蛋白 丝 氨 酸/苏 氨 酸/酪 氨 酸 激 酶 活 性(/)、蛋白质同源二聚化活性()、蛋白激酶活性()、酶结合()、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性(/)等主要参与的生物过程包括凋亡过程的负调控()、凋亡过程()、信号转导()、对外源刺激的反应()、聚合酶启动子的转录正调控()、蛋 白 质 磷 酸 化()、神经元凋亡过程负调控()等图 雷公藤红素改善 靶点的 富集结果 同样地采用 对 个靶基因进行 富集分析根据.筛选并获得 条可能与雷公藤红素改善 相关的通路 选取其中前 条进行可视化分析(见图)结果显示雷公藤红素改善 靶点涉及的通路包括 信号通路()、信号通路()、信号通路()、癌症通路()、酪氨酸激酶抑制剂耐药性信号通路()等 其中有 个靶点落在 信号通路上包括糖原合酶激酶()、热休克蛋白 家族 类成员()、相关受体酪氨酸激酶()、热休克蛋白 家族 类成员()、内皮型一氧化氮合成酶()、磷酸肌醇 激酶调节亚基()、胰岛素样生长因子()、表皮生长因子受体()、白细胞介素()、胎盘生长因子()、磷脂酰肌醇二磷酸 激酶催化亚基()、胰岛素样生长因子 受体()、血管内皮生长因子()、细胞周期蛋白()、原癌基因()、细胞周期蛋白依赖性激酶()、原癌基因()、激酶插入域受体()、凋亡调节蛋白()、丝裂原活化蛋白激酶()、酪氨酸蛋白激酶()、成纤维细胞生长因子受体()、样蛋白 蛋白()个靶点落在 信号通路上 包括、丝 裂 原 激 活 蛋 白 酶 ()、胱天蛋白酶()、人脂质运载蛋白 ()、丝裂原活化蛋白激酶()、前列腺素内过氧化物合酶()、钙结合蛋白()、基质金属蛋白酶()以及 个靶点落在 信号通路:、蛋白()、超氧化物歧化酶()、综上可见雷公藤红素可能通过作用于不同通路信号起到改善 的作用图 “雷公藤红素”共有靶点的 富集分析结果 注:轴为信号通路名称 轴为该通路上含有的靶基因数占总靶基因数的比率气泡大小为该通路基因数量气泡颜色为该通路基因富集的显著性药学研究 .分子对接分析 以雷公藤红素作为配体结合相关研究文献选择 网络中度值较高参与 信号通路较多的 个靶蛋白作为受体(见表)导入雷公藤红素的 和靶点的 文件运用 软件进行分子对接以虚拟评价的方式预测结果 如表 显示雷公藤红素与靶蛋白的结合能均小于 说明雷公藤红素与靶蛋白均具有较好的结合活性其中 和 与雷公藤红素的结合能的分别约为.和.结合作用如图 提示雷公藤红素可能通过作用于 和 起到改善 的作用表 分子对接靶点信息与结合能靶点名称 结合能/.雷公藤红素与.雷公藤红素与 图 雷公藤红素与 和 分子对接可视化图 讨论奥沙利铂引起的外周神经病变是奥沙利铂化疗中的一项重要临床问题能够导致患者减药甚至停药对患者癌症治疗造成不良影响 迄今为止还未有药物被批准用于 的预防和治疗根据临床指南只有度洛西汀可用于神经性疼痛的治疗雷公藤红素作为雷公藤的关键活性成分其改善神经性病理痛、神经炎症、抗神经细胞凋亡的作用得到了广泛研究探索然而关于雷公藤红素是否可对奥沙利铂引起的外周神经病变起到改善作用尚未得到报道 因此本研究以雷公藤红素单体为研究对象先从动物水平上直接考察雷公藤红素是否对 起到保护和改善作用再结合体外水平探究雷公藤红素对奥沙利铂的抗肿瘤作用的影响 结果显示行为学方面雷公藤红素对奥沙利铂所致外周神经毒性症状具有较好的保护作用能够明显改善奥沙利铂导致的大鼠对冷刺激和机械刺激的过度敏感组织病理学方面雷公藤红素减轻了奥沙利铂所致的背根神经节神经元损伤降低了坐骨神经的炎性浸润程度 体外水平上雷公藤红素与奥沙利铂合用不会削弱奥沙利铂对结肠癌细胞的杀伤作用这些结果表明雷公藤红素对奥沙利铂引起的外周神经病变具有保护和改善的作用奥沙利铂引起的外周神经病变可能涉及奥沙利铂与神经元、神经胶质、传感与效应细胞、免疫系统等之间复杂的相互作用鉴于雷公藤红素已报道的抗炎、抗氧化、免疫调节、神经保护等多种药理活性采取多靶点角度研究雷公藤红素改善 的作用具有重要的意义 因此本研究运用网络药理学的方法检索收集和预测了雷公藤红素改善 的多个潜在靶点经过 网络和 分析筛选出度值较高的靶点 和 被认为能够通过裂解 酪氨酸激酶受体参与神经节交感神经元细胞的黏附的调节 则在炎症反应中起到重要作用可参与疼痛反应的调节神经炎症中神经元调节吞噬性小胶质细胞的介质的分泌过程免疫细胞的激活等 分子对接验证的结果表明雷公藤红素与 和 均表现出良好的结合性进一步提示雷公藤红素可能通过调节神经炎症和免疫过程作用于神经元起到 的改善作用 通路富集分析结果表明雷公藤红素改善 的作用可能与 信号通路、信号通路、信号通路、酪氨酸激酶抑制剂耐药性信号通路等有关 研究发现/介导神经元胶质细胞相互作用调节脊髓和背根神经节中的神经元的突触传递和兴奋性从而驱动化疗诱导的神经性疼痛/则显示参与了 病理过程中巨噬细胞与神经元之间的相互作用 而作为/信号通路中关键组成的、和 信号通路中的、均显示在与雷公藤红素的分子对接药学研究 .中显示出良好的结合 对核心靶点的 功能富集分析表明雷公藤红素改善 作用过程中涉及神经元凋亡的负调控 以上结果提示雷公藤红素可能通过调控 信号通路和 信号通路参与神经元与免疫细胞、其他神经细胞之间的相互作用起到改善和减轻 的作用综上所述本研究发现了雷公藤红素对奥沙利铂引起的外周神经病变的改善作用并通过网络药理学的方法初步预测了该作用的潜在靶点和作用通路为进一步实验确证成分与靶点及通路的调控关系阐明雷公藤红素改善 的具体机制提供了理论基础参考文献:.:.():.马凯丽程志祥.化学治疗导致周围神经病变的发生机制及防治进展.中国疼痛医学杂志():.():.():.赵丽玲黄彦珊王利等.类药物应用于神经病理性疼痛的临床应用进展.医药导报():.张丽心胡晓龙汪豪.雷公藤红素的结构修饰及药理活性研究进展.西北药学杂志():.:.():.吴红艳师钰琪李佳豪等.雷公藤红素对神经病理性疼痛模型小鼠的干预作用.中国实验方剂学杂志():./.():.毛丽斯朱晓红.网络药理学在中药领域的应用进展.中医药管理杂志():.王凤雪高宇刘海波.中药网络药理学研究流程及代表性数据库工具.中国现代中药():.():./.():./.():.():.():.():./.():.:.():.:.():.:.():.(下转第 页)药学研究 .():.:.():.():.():.():.():.()().():.:.():.():.():.(收稿日期:)(上接第 页).:.():.:().():.:.():.:.():.():.:.():.():.():.():.():.():.(收稿日期:)药学研究 .