TPI缺乏症斑马鱼模型的构建及分析.pdf

Hereditas(Beijing)2024 年 3 月,46(3):232241 收稿日期:20231222;修回日期:20240205;网络发布日期:20240222 基金项目:国家自然科学基金项目(编号：32222027,32170838)和天津市杰出青年项目(编号：21JCJQJC00120)资助Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.32222027,32170838)and the Science Fund for Distinguished Young Scholars of Tianjin Municipality(No.21JCJQJC00120)作者简介:孙飘，硕士研究生，专业方向：干细胞与再生医学。E-mail: 李颖，博士，研究方向：干细胞与再生医学。E-mail: 孙飘和李颖同为第一作者。通讯作者:王璐，博士，研究员，研究方向：发育生物学，干细胞与再生医学。E-mail: DOI:10.16288/j.yczz.23-316 研究报告TPI 缺乏症斑马鱼模型的构建及分析 孙飘1，李颖1，刘帆1，王璐1,2 1.中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所)，实验血液学国家重点实验室，国家血液系统疾病临床医学研究中心，细胞生态海河实验室，天津 300020 2.天津医学健康研究院，天津 301600 摘要:磷酸丙糖异构酶缺乏症(triosephosphate isomerase deficiency，TPI DF)是一种严重的多系统退行性疾病，通常表现为溶血性贫血、神经肌肉功能障碍和易感染，患者多于起病 5 年内死亡。目前尚不清楚 TPI DF 的具体发病机制，缺乏有效的临床治疗方法。本研究选取 TPI DF 患者中最常见的突变位点 TPI1E105D，构建了表达人源性 TPI1E105D(hTPI1E105D)的转基因斑马鱼(Danio rerio)模型Tg(Ubi:TPI1E105D-eGFP)。功能分析表明，过表达 TPI1E105D影响红系及髓系细胞发育、导致神经以及肌肉发育异常。综上所述，本研究构建了磷酸丙糖异构酶缺乏症的斑马鱼疾病模型，并能够复现 TPI DF 患者的大部分临床表型，该模型为后续研究 TPI DF 的发病机制及药物筛选提供了新的实验动物模型。关键词:磷酸丙糖异构酶缺乏症；TPI1E105D；斑马鱼；疾病模型 Generation and analysis of TPI deficiency zebrafish model Piao Sun1,Ying Li1,Fan Liu1,Lu Wang1,2 1.State Key Laboratory of Experimental Hematology,National Clinical Research Center for Blood Diseases,Haihe Laboratory of Cell Ecosystem,Institute of Hematology&Blood Diseases Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin 300020,China 2.Tianjin Institutes of Health Science,Tianjin 301600,China Abstract:Triosephosphate isomerase deficiency(TPI DF)is a severe multisystem degenerative disease,manifested clinically as hemolytic anemia,neuromuscular abnormalities,and susceptibility to infection,frequently leading to death within 5 years of onset.There is a lack of effective clinical treatment as the pathogenesis underlying TPI DF remains largely unknown.In this study,we generate a transgenic zebrafish line Tg(Ubi:TPI1E105D-eGFP)with the human TPI1E105D(hTPI1E105D)mutation,which is the most recurrent mutation in TPI DF patients.Overexpression of hTPI1E105D affects the development of erythroid and myeloid cells and leads to impaired neural and muscular development.In conclusion,we 第3期 孙飘等:TPI 缺乏症斑马鱼模型的构建及分析 233 create a TPI DF zebrafish model to recapitulate the majority clinical features of TPI DF patients,providing a new animal model for pathogenesis study and drug screening of TPI DF.Keywords:triosephosphate isomerase deficiency(TPI DF);TPI1E105D;zebrafish;disease model 磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase，TPI)是由位于染色体 12p13 的 TPI1 基因编码的糖酵解酶1，在所有组织细胞中均有表达。两个 TPI 单亚基形成同型二聚体，发挥催化酶活性，负责磷酸二羟丙酮(DHAP)和 3-磷酸-甘油醛(G3P)之间的相互转化2。糖酵解途径、磷酸戊糖途径、糖异生和脂代谢等过程可以通过 DHAP 或 G3P 相互连接3。因此，TPI 可以通过调节 DHAP 和 G3P 之间的相互转化从而调节代谢走向2,3。磷酸丙糖异构酶缺乏症(TPI deficiency，TPI DF)是一种罕见的常染色体隐性遗传病，于 1965 年首次发现4。TPI DF 属于最严重的糖酵解酶病，常发病于幼儿期5。该病的典型临床特征为溶血性贫血、免疫功能下降，伴随神经系统损伤、进行性肌肉功能障碍等症状，大部分患者会在幼儿期死亡6。遗传学证据表明 TPI1 基因突变会导致 TPI DF7，目前约有 19 种突变位点被鉴定报道，主要包括错义突变、无义突变和移码突变等。其中，TPI1E105D是发病率最高的一种变异8，研究表明 TPI1E105D会抑制 TPI二聚体形成，降低蛋白的稳定性，从而致病9,10。由于 TPI DF 的具体发病机制尚不清楚，目前临床上缺乏有效的治疗方法。斑马鱼(Danio rerio)是一种小型脊椎动物，具有独特的生物学优势：繁殖发育快、体型小、实验周期短，适合大规模药物筛选；体外受精且胚胎透明，操作、观察方便，适用于活体成像等。此外，斑马鱼的发育过程与哺乳动物相似，基因组和信号通路与人类高度保守。因此，斑马鱼已成为研究神经、心血管、血液、骨骼肌肉和代谢等相关疾病的重要模式动物。构建稳定遗传的疾病模型，不仅可以研究相关基因的功能，而且有助于探索相关疾病的发病机制，以及用于筛选新的药物治疗靶点。本研究利用 Tol2转座子系统将人源性 TPI1E105D基因序列整合到斑马鱼基因组中，构建了能够稳定表达人源性 TPI1E105D的转基因斑马鱼品系Tg(Ubi:TPI1E105D-eGFP)，该转 基因品系具有贫血、免疫功能低下、神经肌肉发育异常等类似于人类 TPI DF 的表型，这为后续的分子机制研究和药物筛选提供了动物模型。1 材料与方法 1.1 材料 pGEM-hTPI1 质粒(HG16150-G)购自北京义翘神州公司。Tol2-Ubi promoter-eGFP 质粒为中国科学院动物研究所刘峰研究员团队惠赠。实验所使用的斑马鱼为 Tbingen 品系，成年斑马鱼用新鲜丰年虾喂养，饲养在上海海圣斑马鱼养殖系统中，水温 28，pH 值为 77.5，电导率约为 550 S/cm。1.2 质粒构建 利用 NEB 官网中的 NEBuilder Assembly Tool，设计hTPI1片段和Tol2-Ubi promoter-eGFP载体的引物，分别记为 F insert和R insert、F vector和R vector。以 pGEM-hTPI1 质粒为模板，用 F insert+R insert 引物进行 PCR，扩增得到含有同源臂的 hTPI1 片段。设计两条包含 hTPI1E105D点突变的反向互补配对引物，记为 G315C F 和 G315C R。以 pGEM-hTPI1 质粒为模板，分别用 F insert+G315C R 和 G315C F+R insert 这两对引物进行第一轮 PCR，将扩增得到的产物按照 11 混合作为模板，利用 F insert+R insert进行第二轮 PCR，扩增得到含有同源臂的 hTPI1E105D片段。同时以带有 Tol2-Ubi promoter-eGFP 序列的载体为模板，用 F vector+R vector 引物进行 PCR 扩增得到带有同源臂的 Tol2-Ubi promoter-eGFP 载体片段。最后利用 DNA 重组试剂盒(E2621L，美国 New England Biolabs 公司)将含有同源臂的 hTPI1 和hTPI1E105D片段分别与载体片段进行同源重组，得到Tol2-Ubi:hTPI1-eGFP和Tol2-Ubi:hTPI1E105D-eGFP质粒。引物序列见附表 1。234 Hereditas(Beijing)2024 第 46 卷 1.3 整胚原位杂交 整胚原位杂交步骤按照参考文献11进行。不同时期的斑马鱼胚胎，经 4%多聚甲醛固定过夜，于20甲醇脱水至少 2 h 后梯度复水。根据不同的发育时期，用蛋白酶 K(39450-01-6，美国 Sigma-Aldrich公司)进行适度通透。清洗与预杂交后加入探针，于分子杂交炉 65杂交过夜，用 SSCT(3 mol/L NaCl、0.34 mol/L C6H5Na3O72H2O、0.1%Tween-20)，MABT(0.1 mol/L 马来酸、0.15 mol/L NaCl、0.1%Tween-20)依次漂洗，后加入封闭液孵育 1 h，加入抗地高辛抗体(11093274910，美国 Roche 公司)，4过 夜 孵 育。次 日 用 MABT 和 BCL(0.1 mol/L Tris-HCl(pH 9.5)、0.1 mol/L NaCl、0.05 mol/L MgCl2、0.1%Tween-20)漂 洗，最 后 加 入BM Purple(11442074001，美国 Roche 公司)染色。特异性信号显示后终止染色，固定后加入甘油于 4保存。原位杂交实验结果使用 ImageJ 软件分析12。本研究检测基因所需探针的引物序列见附表 2。1.4 蛋白免疫印迹 取约 50 枚受精后 24 小时(hours post fertilization，hpf)的斑马鱼胚胎，吸干水分后加入蛋白裂解液，研磨器研磨提取蛋白，离心后取上清，BCA 法对蛋白进行定量。取 40 g 变性后的蛋白在浓度为 12%SDS-PAGE 凝胶中电泳分离蛋白，然后湿转至 PVDF膜上。5%BSA 孵育 1 h 后，加入 TPI1 抗体(AF8214，11000，上海碧云天生物技术有限公司)，4孵育过夜。次日 TBST 清洗 3 次后，加入兔源二抗(111-035-003，110000，美国 Jackson 公司)孵育 2 h，TBST 清洗 3 次后加入显影液，放入化学发光成像仪中进行显影。1.5 鬼笔环肽染色 收集所需斑马鱼胚胎后，4%多聚甲醛固定过夜，次日用乙醇脱水 2 h 后进行梯度复水，蛋白酶 K 通透后固定，PBST 清洗 4 遍后加入鬼笔环肽染液(A12379，1400，美国 Thermo Fisher Scientific 公司)，室温孵育 1 h 后终止染色，使用共聚焦显微镜拍照。1.6 邻联茴香胺染色 收取斑马鱼胚胎，加入由 2.7 mmol/L 邻联茴香胺溶液(BNN2362，美国 Sigma-Aldrich 公司)、0.01 mol/L 醋酸钠溶液(pH4.5)和 0.7%过氧化氢溶液混合而成的染液，室温避光染色 20 min。染色充分后，将染液吸出，双蒸水清洗胚胎，用 4%多聚甲醛固定后拍照。1.7 吉姆萨染色 取 20 枚受精后 2 天(days post fertilization，dpf)斑马鱼胚胎，剪尾后收集外周血至 PBS 溶液中，并转移适量混合液至载玻片上，离心后使用甲醇固定2 min，随后加入吉姆萨染液(G1010，北京索莱宝生物科技有限公司)，室温染色 20 min。待染色结束，冲洗晾干后拍照。1.8 流式分析 取 Tg(gata1:dsRed)斑马鱼胚胎放入培养皿中，加入 0.5%胰酶消化至单细胞状态，终止反应后离心并使用 PBS 重悬，经 300 目细胞滤网过滤得到单细胞悬液，用流式细胞仪(FACS canto II，美国 BD Biosciences 公司)进行分析。记录红细胞数目，根据使用的胚胎总数获得每个胚胎的红细胞数量。1.9 TPI 酶活性测定 TPI 酶活性采用磷酸丙糖异构酶试剂盒(G0824W，苏州格锐思生物科技有限公司)进行测定。取斑马鱼胚胎，加入 TPI 提取液进行冰浴匀浆，离心后取上清液 10 L 加入 96 孔板中，依据说明书加入相应试剂，随后使用酶标仪检测 450 nm 处光吸收增加量，即可得到 TPI 酶活性大小。1.10 统计方法 应用 GraphPad Prism8 软件进行数据分析。统计显著性分析根据数据类型选择检验方法：计数资料以百分率(%)表示，两组之间比较采用卡方检验；计量资料数据结果以平均值标准差表示，比较采用t 检验。P0.05 时认为差异显著。星号用来表示差异的显著性，具体为：*P0.05，*P0.01，*P0.001，*PC)(图 1D)。2.1.3 Tg(Ubi:hTPI1-eGFP)和 Tg(Ubi:hTPI1E105D-eGFP)品系的建立及验证 将上述构建的 Tol2-Ubi:hTPI1-eGFP 质粒和Tol2-Ubi:hTPI1E105D-eGFP 质粒分别与体外合成的Tol2 mRNA 混合后注射至 1-细胞期的斑马鱼胚胎中。在荧光显微镜下挑选带有绿色荧光的 F0斑马鱼胚胎培养至性成熟。将 F0嵌合体斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，所得胚胎中选取有绿色荧光的 F1代斑马鱼进行培养，得到稳定遗传的 Tg(Ubi:hTPI1-eGFP)和Tg(Ubi:hTPI1E105D-eGFP)转基因斑马鱼后代(图 2，A和 B)。为 了 进 一 步 确 定 人 源 性 基 因hTPI1和hTPI1E105D的表达，本研究提取转基因斑马鱼子代胚胎蛋白进行免疫印迹实验。结果表明，与野生型相比，转基因胚胎中TPI1蛋白表达量明显增加(图2C)，说明 Tg(Ubi:hTPI1-eGFP)和 Tg(Ubi:hTPI1E105D-eGFP)转基因斑马鱼胚胎可以实现 TPI1 蛋白过表达。TPI酶活性测定结果表明，Tg(Ubi:hTPI1-eGFP)转基因斑 马 鱼 胚 胎 中TPI酶 活 性 显 著 增 强，而Tg(Ubi:hTPI1E105D-eGFP)转基因胚胎中 TPI 酶活性则显著降低，说明 TPI1E105D过表达可能降低斑马鱼体内 TPI 酶活性(图 2D)。236 Hereditas(Beijing)2024 第 46 卷 图 1 Tol2-Ubi:hTPI1-eGFP 和 Tol2-Ubi:hTPI1E105D-eGFP 质粒构建 Fig.1 Genaration of Tol2-Ubi:hTPI1-eGFP and Tol2-Ubi:hTPI1E105D-eGFP plasmids A：TPI1 基因示意图（图中标出了已报道的突变位点）；B：TPI1 E105 在 TPI1 二聚体中所处位置；C：Tol2-Ubi:hTPI1E105D-eGFP 质粒构建流程；D：Tol2-Ubi:hTPI1-eGFP 和 Tol2-Ubi:hTPI1E105D-eGFP 质粒的测序鉴定结果。其中上图为对照组野生型 TPI1 基因序列，下图为带有 E105D 突变位点的序列，红色箭头代表突变位点。图 2 Tg(Ubi:hTPI1-eGFP)和 Tg(Ubi:hTPI1E105D-eGFP)转基因品系的构建 Fig.2 Generation of Tg(Ubi:hTPI1-eGFP)and Tg(Ubi:hTPI1E105D-eGFP)transgenic lines A：Tg(Ubi:hTPI1-eGFP)和 Tg(Ubi:hTPI1E105D-eGFP)转基因品系的构建流程。F0代表注射质粒和 Tol2 转座子 mRNA 后有绿色荧光的嵌合体，F1代表能够稳定遗传的带有绿色荧光的子代；B：24hpf 转基因斑马鱼胚胎荧光图片。比例尺为 100 m；C：野生型、Tg(Ubi:hTPI1-eGFP)和 Tg(Ubi:hTPI1E105D-eGFP)转基因斑马鱼胚胎中 TPI1 蛋白表达情况；D：野生型组和转基因组 TPI 酶活。数据展示为平均值标准差，*表示差异的显著性(*P0.001，*P0.0001)。P 值由双尾 t 检验计算得出。TPI1WT为 Tg(Ubi:hTPI1-eGFP)简写，TPI1E105D为 Tg(Ubi:hTPI1E105D-eGFP)简写。第3期 孙飘等:TPI 缺乏症斑马鱼模型的构建及分析 237 2.2 过表达人源 TPI1E105D导致神经以及肌肉发育异常 TPI DF 是一种进行性多系统退行性疾病，最终导致溶血性贫血、神经肌肉功能障碍、感染易感性增加和死亡。为了研究过表达人源 TPI1E105D的表型，本研究首先观察了胚胎发育状态，发现和野生型相比，hTPI1 或 hTPI1E105D过表达并没有导致明显的发育异常(图 3A)。然后，通过整胚原位杂交实验检测神经、肌肉特异性标记物，观察 hTPI1E105D对神经、肌肉发育的影响。结果表明，与野生型和过表达hTPI1 的胚胎相比，hTPI1E105D过表达胚胎中神经特异性标记基因的表达明显减少，表现为抑制性神经元标记基因 gad1b、兴奋性神经元标记基因 slc17a6b以及泛神经元标记基因 elavl3 的表达明显降低(图3B)，说明 hTPI1E105D影响神经发生。同时，本研究 发现过表达 hTPI1E105D导致肌肉特异性标记基因myod1、mylpfa以及smyhc1的表达明显降低(图3C)。鬼笔环肽染色结果显示，hTPI1E105D过表达后导致胚胎肌丝宽度明显减小(图 3D)，进一步说明 hTPI1E105D导致肌肉发育异常。2.3 过表达人源 TPI1E105D影响红系及髓系细胞发育 贫血是 TPI DF 的早期症状之一。为了检测本研究所构建的转基因品系是否影响红系发育，通过整胚原位杂交检测了红细胞相关标记基因的表达。结果显示，相比于野生型组和 hTPI1WT过表达组，过表达 hTPI1E105D导致 24 hpf 胚胎中原始红细胞生成关键因子 gata1a、scl 和 gata2a 的表达显著性减弱(图4A)；而在 2 dpf 时，gata1a、scl 以及胚胎期珠蛋白基因 hbbe3 的表达水平则明显增强(图 4B)。临床研 图 3 过表达人源 TPI1E105D导致神经以及肌肉发育异常 Fig.3 Overexpression of hTPI1E105D resulted in impaired neural and muscular development A：转基因组斑马鱼明场下无明显发育异常。比例尺为 100 m；B：36 hpf 时野生型组和转基因组神经相关标记基因的整胚原位杂交结果。其中 gad1b是抑制性神经元的标记基因，slc17a6b是兴奋性神经元的标记基因，elavl3是泛神经元的标记基因，比例尺为 100 m；右侧为原位杂交胚胎数目统计结果，星号表示差异的显著性(*P0.0001，n.s.表示无显著性差异)，P 值由卡方检验计算得出；C：36 hpf 时野生型组和转基因组肌肉相关标记基因的整胚原位杂交结果。其中 myod1 为体节发育相关的标记基因，mylpfa 为快肌纤维标记基因，smyhc1 为慢肌纤维标记基因，比例尺为 100 m；右侧为原位杂交胚胎数目的统计结果，星号表示差异的显著性(*P0.0001，n.s.表示无显著性差异)，P 值由卡方检验计算得出；D：2 dpf 时野生型组和转基因组鬼笔环肽染色。白色大方框放大自白色小方框，比例尺为 20 m；右侧为肌丝宽度统计结果，数据展示为平均值标准差，星号表示差异的显著性(*P0.0001，n.s.表示无显著性差异)，P 值由双尾 t 检验计算得出。238 Hereditas(Beijing)2024 第 46 卷 究报道，红细胞减少会使氧张力下降、红细胞生成素增加，进而促使红系造血代偿增加，并诱导未成熟的红细胞提前从骨髓释放15。因此，本研究推测2 dpf时红系相关基因的表达升高可能是由于早期红细胞减少后导致的红系代偿性增生。为了验证这一推测，通过吉姆萨染色(Giemsa staining)检测红系的发育状态，结果显示过表达 hTPI1E105D导致红细胞的核质比明显增加(图 4C)，提示未成熟的红细胞增多。这些结果说明过表达 hTPI1E105D初期会导致原始红细胞减少，随后引起红系代偿性增生。在人体中，当红细胞减少速度超过红系代偿性增生速度时，就会发生贫血16。为了验证过表达hTPI1E105D是否最终会导致贫血表型，通过邻联茴香胺染色(O-Dianisidine)检测野生型组及转基因品系胚胎中的血红蛋白水平，结果显示过表达 hTPI1E105D胚胎中血红蛋白的含量明显减少(图 4D)；同时，通过流式细胞分析技术检测了红细胞数量，发现在hTPI1E105D过表达组中，gata1:dsRed+红细胞数量显著减少(图 4E)。这些结果说明在 3 dpf 时，过表达hTPI1E105D组中红细胞减少的速度已超过红系代偿性增生的速度，最终导致贫血。综上，过表达hTPI1E105D可导致血红蛋白含量减少和红系细胞数量减少，类似于临床上的贫血表型。除了贫血外，TPI DF 患者还存在免疫功能低下 第3期 孙飘等:TPI 缺乏症斑马鱼模型的构建及分析 239 图 4 过表达人源 TPI1E105D影响红系及髓系细胞发育 Fig.4 Overexpression of hTPI1E105D affected the development of erythroid and myeloid cells A：24 hpf 时野生型组和转基因组红系生成相关基因的整胚原位杂交结果。下方为原位杂交统计结果；B：2 dpf 时野生型组和转基因组红系相关基因的整胚原位杂交结果。下方为原位杂交统计结果。其中 A 和 B 小图中 gata1a、gata2a 为红系前体的标记基因，scl为造血前体的标记基因，hbbe3 为胚胎期珠蛋白的标记基因，比例尺为 100 m；C：2 dpf 时野生型组和转基因组吉姆萨染色结果。比例尺为 25 m；下方为红细胞核质比统计结果，每组纳入统计的红细胞数目均大于 150 个；D：3 dpf 时野生型组和转基因组邻联茴香胺染色结果。比例尺为 100 m；右侧为染色面积的统计结果；E：3 dpf 时野生型组和转基因组流式分析数据及统计图；F：2 dpf时野生型组和转基因组中髓系细胞相关基因的整胚原位杂交结果。其中 coro1a 为髓系淋系前体细胞的标记基因，mpeg1.1 为单核巨噬细胞的标记基因，lyz 为中性粒细胞的标记基因，比例尺为 100 m；下方为髓系细胞相关基因的整胚原位杂交统计结果；G：野生型组与转基因组中 rag1、ikaros 和 cmyb 的整胚原位杂交结果。其中 rag1、ikaros 为淋巴细胞的标记基因，cmyb 为造血干祖细胞的标记基因，比例尺为 100 m；下方为原位杂交统计结果。数据展示为平均值标准差，星号表示差异的显著性(*P0.05，*P0.01，*P0.001，*P0.0001，n.s.表示无显著性差异)，P 值由双尾 t 检验计算得出。和易感染的临床症状。白细胞具有抵御有害微生物入侵的功能，比如单核巨噬细胞可以抵抗感染、吞噬异物，以及调节身体免疫力17；中性粒细胞是抵御急性细菌感染的主要防线，其减少会增加感染风险18。为了初步了解 hTPI1E105D是否导致免疫功能低下，本研究检测了髓系相关标记基因的表达，并观察单核巨噬细胞、中性粒细胞等白细胞的数量是否发生改变。coro1a、mpeg1.1、lyz 分别是髓淋前体细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的标记基因。在hTPI1E105D过表达的斑马鱼胚胎中，髓淋前体细胞、巨噬细胞以及中性粒细胞的数量均有所下降(图 4F)，提示 hTPI1E105D过表达斑马鱼品系可能存在防御功 能减弱，易于感染的表型。本研究同时检测了淋巴细胞以及造血干祖细胞。rag1、ikaros 为淋巴细胞的标记基因，cmyb 为造血干祖细胞的标记基因。结果显示，与野生型和 hTPI1WT过表达组相比，hTPI1E105D异常表达并没有影响淋系以及造血干祖细胞的发育(图 4G)。3 讨论 TPI DF 是一种发生在儿童早期的罕见疾病，目前尚无有效的治疗方法。人类致病性 TPI1 突变可能通过影响 TPI 的功能域导致催化活性下降或蛋白稳定性降低，从而引起 TPI DF。但也有研究指出，在不影响 TPI 蛋白质稳定性的情况下，其催化活性下 240 Hereditas(Beijing)2024 第 46 卷 降不足以引起 TPI DF 症状19，因此该疾病的确切病因仍存在争议。通过对临床数据的分析发现，影响TPI 二聚体形成的突变可能会引起更严重的症状8，TPI1E105D可以影响 TPI 二聚体形成，除此之外它还是目前已报道病例中最常见的突变类型，这使得这一突变类型成为构建 TPI DF 疾病模型的首选位点。有关 TPI DF 的动物模型已在小鼠(Mus musculus)和果蝇(Drosophila)中建立，Tpi1E105D/null小鼠存在神经肌肉功能障碍、溶血性贫血和寿命显著缩短的严重表型，是第一个具有神经肌肉表型的 TPI DF 小鼠模型20。TPIsugarkill果蝇表现出进行性运动障碍、神经肌肉损伤和寿命缩短，研究人员通过 TPIsugarkill果蝇模型筛选鉴定了 25 种对 TPI 稳定性至关重要的蛋白质，这对于开发稳定 TPI 蛋白的药物用于治疗 TPI DF 具有参考意义21。斑马鱼作为一种脊椎模式动物，相比于无脊椎动物果蝇，在基因组和发育模式上都与人类有更高的相似性；相较于小鼠，斑马鱼具有发育繁殖能力强、饲养成本低、能进行高通量药物筛选的优势。因此，本研究构建的过表达 hTPI1E105D转基因斑马鱼可以成为机制研究和药物筛选的新的模型，丰富研究者对于动物疾病模型的选择。本研究借助 Tol2 转座子系统构建了稳定表达人源性 TPI1E105D的 Tg(Ubi:hTPI1E105D-eGFP)转基因斑马鱼，该转基因品系呈现出人类 TPI DF 相似的表型，主要表现为神经肌肉发育异常，伴有贫血、白细胞减少的血液系统表型，但是具体的发病机制尚不清楚。检测野生型组和转基因组中的 TPI 酶活性发现，过表达人源性 TPI1E105D会导致斑马鱼整体的 TPI 酶活性降低(图2D)，这可能是Tg(Ubi:hTPI1E105D-eGFP)转基因斑马鱼存在 TPI DF 的原因之一。除此之外，TPI 的异常二聚化被认为在 TPI DF 中起关键作用，有研究认为 TPI DF 可能是蛋白构象疾病5。TPI1E105D突变靠近 TPI 二聚化结合位点，该突变会导致 TPI 活性二聚体形成障碍，而未形成二聚体的不稳定 TPI 单体具有高凝聚力，过多的 TPI 单体错误折叠形成有毒蛋白聚集体，从而引发神经功能障碍5,6,22，我们推测这可能是人源性 TPI1E105D能在斑马鱼体内存在磷酸丙糖异构酶的前提下仍能引起神经系统异常的可能原因。在检测人源性 TPI1E105D异常表达的血液表型时，本研究发现红细胞以及髓系细胞均减少，而淋巴细胞的数量以及造血干祖细胞的产生并未明显改变(图 4G)，广泛表达的 TPI1 为何特异性的影响部分细胞类型？这可能是由于在不同细胞类型中，TPI 的活性也存在差异5，如在红细胞中，TPI 突变蛋白可能与红细胞膜有更强的相互作用，导致 TPI 的微区室化，这会进一步降低 TPI 缺陷细胞的 TPI 活性23。总 之，这 些 数 据 表 明，本 研 究 所 构 建 的Tg(Ubi:hTPI1E105D-eGFP)转基因品系具有与人类 TPI DF 类似的表型，包括神经、肌肉、血液系统在内的多方面表型，因此该转基因品系可以用于对 TPI DF 进行多系统的机制研究，也为高通量药物筛选提供了一种合适的动物模型。附录：附加材料见文章电子版 。参考文献(References)：1 Schneider AS.Triosephosphate isomerase deficiency:historical perspectives and molecular aspects.Baillieres Best Pract Res Clin Haematol,2000,13(1):119140.2 Rieder SV,Rose IA.The mechanism of the triosepho-sphate isomerase reaction.J Biol Chem,1959,234(5):10071010.3 Wierenga RK,Kapetaniou EG,Venkatesan R.Triosephosphate isomerase:a highly evolved biocatalyst.Cell Mol Life Sci,2010,67(23):39613982.4 Schneider AS,Valentine WN,Hattori M,Heins HL.Hereditary hemolytic anemia with triosephosphate isomerase deficiency.N Engl J Med,1965,272:229235.5 Orosz F,Olh J,Ovdi J.Triosephosphate isomerase deficiency:new insights into an enigmatic disease.Biochim Biophys Acta,2009,1792(12):11681174.6 Orosz F,Olh J,Ovdi J.Triosephosphate isomerase deficiency:facts and doubts.IUBMB Life,2006,58(12):703715.7 Daar IO,Artymiuk PJ,Phillips DC,Maquat LE.Human triose-phosphate isomerase deficiency:a single amino acid substitution results in a thermolabile enzyme.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83(20):79037907.8 Schneider A,Cohen-Solal M.Hematologically important mutations:triosephosphate isomerase.Blood Cells Mol Dis,1996,22(1):8284.第3期 孙飘等:TPI 缺乏症斑马鱼模型的构建及分析 241 9 Oliver C,Timson DJ.In silico prediction of the effects of mutations in the human triose phosphate isomerase gene:towards a predictive framework for TPI deficiency.Eur J Med Genet,2017,60(6):289298.10 Ralser M,Heeren G,Breitenbach M,Lehrach H,Krobitsch S.Triose phosphate isomerase deficiency is caused by altered dimerization-not catalytic inactivity-of the mutant enzymes.PLoS One,2006,1(1):e30.11 Zhang CX,Liu F.A brief protocol for high-resolution whole mount in situ hybridization in zebrafish.Hereditas(Beijing),2013,35(4):522528.张春霞,刘峰.斑马鱼高分辨率整胚原位杂交实验方法与流程.遗传,2013,35(4):522528.12 Schindelin J,Arganda-Carreras I,Frise E,Kaynig V,Longair M,Pietzsch T,Preibisch S,Rueden C,Saalfeld S,Schmid B,Tinevez JY,White DJ,Hartenstein V,Eliceiri K,Tomancak P,Cardona A.Fiji:an open-source platform for biological-image analysis.Nat Methods,2012,9(7):676682.13 Roland BP,Zeccola AM,Larsen SB,Amrich CG,Talsma AD,Stuchul KA,Heroux A,Levitan ES,Vandemark AP,Palladino MJ.Structural and genetic studies demonstrate neurologic dysfunction in triosephosphate isomerase deficiency is associated with impaired synaptic vesicle dynamics.PLoS Genet,2016,12(3):e1005941.14 Selamiolu A,Karaca M,Balc MC,Krbeyli HK,Durmu A,Yldz EP,Karaman S,Gkay GF.Triosephosphate isomerase deficiency:E105D mutation in unrelated patients and review of the literature.Mol Syndromol,2023,14(3):231238.15 Li XX