LRRC15影响A549细胞自噬的作用研究.pdf

Hereditas(Beijing)2024 年 5 月,46(5):398407 收稿日期:20240107;修回日期:20240304;网络发布日期:20240312 基金项目:河南省高等学校重点科研项目计划(编号：22A180018)，河南省科技攻关项目(编号：232102310067)和国家肺纤维化生物学学科创新引智基地(“111”计划)项目资助Supported by the Key Scientific Research Projects of Henan Higher Education(No.22A180018),Henan Project of Science and Technology(No.232102310067),and the State Innovation Base for Pulmonary Fibrosis(111 Project)作者简介:王棋文，博士，讲师，研究方向：分子生物学。E-mail: 通讯作者:余国营，教授，研究方向：分子生物学。E-mail: DOI:10.16288/j.yczz.23-299 研究报告LRRC15 影响 A549 细胞自噬的作用研究 王棋文，贾燕玲，李盼，余国营 河南师范大学生命科学学院，省部共建细胞分化调控国家重点实验室培育基地，河南肺纤维化国际联合实验室，河南省器官纤维化杰出外籍科学家工作室，新乡 453007 摘要:特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种致病原因不明、进行性、慢性不可逆的间质性肺疾病。为探讨富含亮氨酸重复蛋白 15(leucine-rich repeat-containing protein 15，LRRC15)在 IPF 的作用及调节机制，本研究构建了博来霉素(bleomycin，BLM)诱导的小鼠肺纤维化和 A549 细胞损伤模型，检测了 LRRC15的表达变化。转染 siLRRC15 后分别采用 MTT、GFP-RFP-LC3 双荧光标记系统和免疫印迹等方法检测了细胞活性和自噬的变化。结果表明：BLM 处理后，小鼠肺组织和 A549 细胞中 LRRC15 表达显著上调；将设计和合成的 siLRRC15 转入 A549 细胞，LRRC15 的表达极显著降低，可以部分恢复 BLM 引起的细胞损伤；BLM 处理 A549 细胞后，LC3-II 和 P62 蛋白呈现上升的趋势；GFP-RFP-LC3 双荧光标记检测发现，BLM 处理后自噬体数量明显增多；进一步用 siLRRC15 处理 A549 细胞后发现，自噬关键蛋白 LC3-II、ATG5、ATG7 的表达增加，P62 蛋白表达下调，自噬流的强度增加。以上研究结果说明 LRRC15 是 IPF 中上皮细胞损伤的指示剂，可能通过调节自噬参与纤维化过程中的调节，本研究为进一步阐明 IPF 的机制提供了必要的理论依据。关键词:LRRC15；特发性肺纤维化；博来霉素；A549 细胞；自噬 Effect of LRRC15 on autophagy in A549 cells Qiwen Wang,Yanling Jia,Pan Li,Guoying Yu College of Life Science,Henan Normal University,State Key Laboratory of Cell Differentiation and Regulation,Henan International Joint Laboratory of Pulmonary Fibrosis,Henan Center for Outstanding Overseas Scientists of Organ Fibrosis,Xinxiang 453007,China Abstract:Idiopathic pulmonary fibrosis(IPF)is a progressive,chronic,and irreversible interstitial lung disease with unknown cause.To explore the role and regulatory mechanism of leucine-rich repeat-containing protein 15(LRRC15)in IPF,bleomycin(BLM)-induced pulmonary fibrosis in mouse and A549 cells were constructed,and the expression of LRRC15 were detected.Then,MTT,GFP-RFP-LC3 dual fluorescent labeling system and Western blotting were used to investigate the effects of LRRC15 on cell activity and autophagy after transfection of siLRRC15,respectively.The results indicated that the expression of LRRC15 was significantly increased after the BLM treatment in mouse lung tissue and A549 cells.The designed and synthesized siLRRC15 followed by transfection into A549 cells resulted in a dramatic 第5期 王棋文等:LRRC15 影响 A549 细胞自噬的作用研究 399 reduction in LRRC15 expression and partially restored the cell damage induced by BLM.Moreover,the expression of LC3-II and P62 were up-regulated,the amount of autophagosome were increased by GFP-RFP-LC3 dual fluorescent labeling assay after BLM treatment.Meanwhile,this study also showed that the key autophagy proteins LC3-II,ATG5 and ATG7 were up-regulated,P62 was down-regulated and autophagic flux were enhanced after further treatment of A549 cells with siLRRC15.The above findings suggest that LRRC15 is an indicator of epithelial cell damage and may participate in the regulation of fibrosis through autophagy mechanism in IPF.This study provides necessary theoretical basis for further elucidating the mechanism of IPF.Keywords:LRRC15;idiopathic pulmonary fibrosis;bleomycin;A549 cells;autophagy 特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种慢性、不可逆的纤维化性间质性肺疾病，多预后不良，生存期仅为 35 年。据统计，北美洲和欧洲 IPF 发病率为 2.89.3 例/10 万人/年，南美洲和亚洲发病率低于 4 例/10 万人/年1。2018 年 5 月11 日，国家卫生健康委员会等五部门联合制定了 第一批罕见病目录，IPF 被收录其中2。其主要发病机制受遗传和环境风险之间相互作用的影响，烟雾、灰尘等环境暴露和胃食管反流疾病继发的慢性微吸入性疾病等使肺泡上皮细胞完整性丧失，随之出现肺内损伤区域肺泡上皮细胞凋亡，上皮-间充质转化，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积和肺实质异常重塑。进而导致肺顺应性不足，气体交换发生障碍，甚至危及生命3。自噬是一种维持细胞内正常生理活动的高度保守的机制，能将细胞内的组分(包括长寿命蛋白质、折叠错误的蛋白、受损的细胞器)以及各种病原体递送到溶酶体中进行降解的过程。但是自噬发生紊乱则会涉及到多种疾病，其中就包括IPF的疾病发生。研究表明，自噬不足是 IPF 发生的机制之一，当自噬发生功能障碍时会引发肺泡上皮细胞衰老和损伤，上皮-间质转化和促进成纤维细胞增殖并分化为肌成纤维细胞，异常的 ECM 沉积，进而形成肺纤维化4,5。但目前关于自噬在 IPF 中的具体调节机制仍不清楚。LRRC15(leucine rich repeat containing 15)，是 I型单通道跨膜蛋白，LRRC 超家族的成员之一，具有保守亮氨酸重复序列，能与胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白相结合，同时能够正调控细胞的迁移，调控受体介导的病毒粒子与宿主细胞的附着6,7。目前关于 LRRC15 的研究主要集中于其在癌症中的作用，研究已经证明 LRRC15 在多种癌症中异常表达。对 2000 多例不同适应症的癌症患者样本和 350 例正常人体组织进行 RNA 表达分析，发现 LRRC15 在多个实体瘤(如乳腺癌、胰腺癌、头颈癌、恶性胶质瘤、肺癌、肉瘤等)中高表达，但在大多数正常组织中低表达8。另外有研究发现阻断 LRRC15 的表达可能会降低肿瘤的转移性传播，抑制肿瘤的发生9。但是目前还没有文献报道 LRRC15 在 IPF 中的表达变化和作用机制。博来霉素(bleomycin，BLM)是由轮枝链霉菌产生的多组份复合抗生素，由于 BLM 诱导的动物肺纤维化在病理组织学的变化和人 IPF 最为接近，所以用博来霉素诱导的动物肺纤维化模型是目前最为经典的模型之一。本研究构建了 BLM 损伤的小鼠肺组织和 A549 肺泡上皮细胞模型，研究了LRRC15 在其中的作用，为后续阐明 LRRC15 调节IPF 的发生机制提供了必要的理论依据。1 材料与方法 1.1 细胞系 人 II型肺泡上皮细胞 A549细胞株购买自 ATCC。1.2 主要试剂 实验小鼠：C57BL/6 小鼠，78 周龄，体重约1820 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司；DMEM/F12(11)培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清(FBS)购自美国 Gibco 公司；双抗(含青霉素、链霉素)购自北京索莱宝科技有限公司；siLRRC15购自广州锐博生物科技有限公司；LC3、P62、ATG5、ATG7 抗体购自美国 CST 公司；Lipofectamine 3000 400 Hereditas(Beijing)2024 第 46 卷 转染试剂购自美国 Invitrogen 公司；Hoechst 染色液购自上海碧云天生物技术有限公司；自噬双荧光质粒(GFP-RFP-LC3)由扬州大学兽医学院刘宗平课题组惠赠。1.3 构建小鼠肺纤维化模型 随机选取 20 只 C57BL/6 雌性小鼠，分为生理盐水和 BLM 模型组两组，每组 10 只小鼠。异氟醚麻醉后，1.5 U/kg 剂量气道灌注 BLM。给药 21 天后取左肺进行后续处理。实验过程严格遵循河南师范大学学术委员会的指导原则进行(IACUC，SMKX-2118BS1018)。1.4 细胞培养 从液氮中取出 A549 细胞，置于 37水浴锅中快速融化，300 g 转速离心 5 min，弃上清；用含10%胎牛血清、青链霉素混合液(100)的 DMEM/F12培养基重悬细胞，置于 37、5%CO2细胞培养箱中继续培养。待 A549 细胞生长密度达 80%时，将细胞按 13 的比例传代。1.5 细胞转染 用 Free-RNase 的枪头吸取 250 L 无菌水溶解siRNA，配制浓度为 20 mol/L 的储存液；转染时，在 Free-RNase 的 EP 管中用 120 L 的 1ribo FECTTMCP Buffer 稀释 3.75 L 的 siRNA 母液，轻轻混匀，将 12 L 的转染试剂加入已稀释好的 siRNA中，轻轻吹打混匀，室温孵育 15 min；在混合物静止孵育期间将孔中的完全培养基置换成 Opti-MEM，然后将孵育好的混合物加入到细胞中充分混匀；置于 37培养箱中培养 46 h 后，将无血清培养基换成完全培养基，继续培养 2448 h，收集检测。GFP-RFP-LC3 质粒转染时提前一天取对数生长期的 A549 细胞，用胰酶消化并接种至细胞爬片，待细胞贴壁后，将双荧光质粒使用按照 Lipofectamine 3000 说明方法转染 A549 细胞。处理 24 h 后，多聚甲醛室温固定 10 min，Hoechst 染液避光在摇床上染色4 min，抗荧光淬灭剂封片，随机选取至少 5 个视野，用激光共聚焦显微镜观察荧光表达并拍照，计数每个细胞合并图像中的黄色点数目(自噬体)和红色点数目(自噬溶酶体)，分析其表达变化，进行统计分析。1.6 qRT-PCR 本实验中所用到的基因引物序列，参考文献及查阅 GenBank 序列，用 Premier5.0 软件设计，由锐博生物公司合成，并利用普通 PCR 摸索引物的最佳退火温度(表1)。提取细胞总RNA，反转录为cDNA，采用 qRT-PCR 法检测 LRRC15 基因表达水平，所用引物序列如表 1 所示，以 GAPDH 为内参基因，每个样品做 3 个复孔，运用 2CT法计算出不同组别中相关基因的表达。同时，对产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。1.7 Western blot 收集处理好的肺组织和细胞，加入适量细胞裂解液，冰上裂解 30 min，随后 4、13000 g、离心10 min，收集上清液，用 BCA 法测定蛋白含量。将样品进行 SDS-PAGE 电泳并将蛋白转至 PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭 1 h 后孵育一抗，4冰箱过夜；第二天 TBST 洗涤，加二抗室温孵育 60 min，TBST 洗涤后采用超敏 ECL 化学发光液显色，荧光成像仪内成像检测，拍照，用 Image Quant TMTL 图像分析软件进行灰度扫描和蛋白含量分析。1.8 MTT 检测细胞活性 取对数生长期的细胞，胰酶消化后以 2.5103/孔接种于 96 孔板中，待细胞贴壁后，进行 siRNA干涉处理，转染 6 h 后将无血清培养基更换为新鲜的完全培养基，同时进行 BLM 药物处理。于培养箱中继续培养 24 h 和 48 h 后，每孔加入 MTT 溶液10 L(5 mg/mL)，“8”字混匀；并于培养箱中继续孵育 4 h 后，吸弃培养液，每孔加入 100 L DMSO；在多功能酶标仪中室温震荡 10 min，使得蓝紫色结晶充分溶解，490 nm 处测量各孔细胞吸光度值(OD值)，绘制细胞生长曲线。表 1 相关基因的引物序列 Table 1 Primers sequence of related genes 基因名称引物序列 最佳退火温度LRRC15 5-ACTGATGACCGCAGCGTTTGG-3 5-CAGGACAGCTTGGCTCCTCTTCTT-360 GAPDH 5-CCACCCATGGCAAATTCC-3 5-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3 60 第5期 王棋文等:LRRC15 影响 A549 细胞自噬的作用研究 401 2 结果与分析 2.1 蛋白水平检测LRRC15在IPF的表达变化 本研究首先在组织水平上检测了 LRRC15 的表达变化。结果显示，BLM 处理后，可以促进小鼠肺组织中 LRRC15 表达上调(P0.01)(图 1A)。细胞水平同样可以看出，用 BLM 处理 A549 细胞 24 h和 48 h 模拟肺泡上皮细胞损伤10,11，提取蛋白进行 Western blot，结果如图 1B 所示。与对照组相比，BLM 处理 A549 细胞 24 h 后，LRRC15 的表达水平显著增加(P0.05)，处理 48 h 后，LRRC15 表达水平极显著增加(P0.01)，具有明显的时间-效应关系。2.2 LRRC15 siRNA 转染 A549 细胞后 LRRC15的表达情况 为了进一步探究 LRRC15 在 IPF中的作用机制，由锐博生物科技有限公司设计合成 3 条 LRRC15 干涉片段及 NC 片段，转入 A549 细胞中，收集细胞进行 qRT-PCR 和 Western blot 实验检测。结果显示，无论从基因水平还是蛋白水平，干涉后 LRRC15 表达水平显著降低(图 2，A 和 B)。其中，si-3 干涉片段干涉效率最好，干涉效率达到了 80%以上，具有极显著差异(P0.0001)，因此选取 si-3 干涉片段进行下一步研究。2.3 MTT 检测 siLRRC15 对 A549 细胞活性的影响 利用 MTT 方法检测 LRRC15 对 A549 细胞活性的影响，由图 3 可以看出，BLM 处理后细胞活性极显著降低(P0.0001)；siLRRC15 转染 A549 细胞后，与 NC 组相比，细胞活性显著升高，有显著性差异(P0.05)；同时发现，与 NC+BLM 组比较，处理 24 h和 48 h 后，siLRRC15+BLM 组的细胞活性极显著增加(P0.01)，说明 siLRRC15 可以部分恢复由于 BLM引起的细胞损伤。2.4 自噬关键蛋白在BLM诱导A549细胞损伤中的表达变化 为了探究自噬在 BLM 诱导 A549 细胞损伤中的表达变化，本研究从蛋白水平利用蛋白印迹检测LC3 和 P62 自噬相关蛋白的表达变化。实验结果显示，与对照组相比较，BLM 处理 A549 细胞 24 h 和48 h 后，LC3-II 和 P62 蛋白表达增加，且具有显著差异(P0.05)(图 4)。图 1 LRRC15 蛋白在 BLM 诱导小鼠肺纤维化和 A549 细胞损伤中的表达变化 Fig.1 Changes in LRRC15 protein expression in BLM-induced lung fibrosis and A549 cell injury in mice A：LRRC15 蛋白在小鼠 BLM 诱导肺纤维化模型中的表达变化；Saline：生理盐水组；BLM：博来霉素处理组。B：LRRC15 蛋白在BLM 诱导 A549 细胞后的表达变化；CON：对照组；BLM 24 h：博来霉素处理 24 h；BLM 48 h：博来霉素处理 48 h；以 GAPDH 为内参；与对照组相比较，*代表 P0.05；*代表 P0.01。402 Hereditas(Beijing)2024 第 46 卷 图 2 LRRC15 siRNA 转染 A549 细胞后 LRRC15 的表达情况 Fig.2 LRRC15 expression after LRRC15 siRNA transfection in A549 cells A：qRT-PCR 检测 LRRC15 siRNA 转染 A549 细胞后 LRRC15 mRNA 的表达变化；B：Western blot 检测 LRRC15 siRNA 转染 A549 细胞后 LRRC15 蛋白的表达变化。NC 代表阴性对照，si-1、si-2、si-3 表示 LRRC15 的 3 个 siRNA 片段。与 NC 组比较，*代表 P0.01，*代表 P0.001，*代表 P0.0001。图 3 siLRRC15 对 A549 细胞活性的影响 Fig.3 Effect of siLRRC15 on A549 cell activity NC 代表阴性对照，siLRRC15 表示 LRRC15 的第 3 个 siRNA 片段。*代表 P0.05，*代表 P0.01，*代表 P0.0001。2.5 双荧光法检测BLM诱导A549细胞损伤中自噬流的变化 为了进一步明确自噬在 BLM 诱导的 A549 中的表达变化，将自噬双荧光质粒用 Lipofectamine 3000 转染试剂盒瞬时转染至上皮细胞 A549 中，然后用BLM 处理 24 h，在激光共聚焦显微镜下拍照。结果显示，BLM 处理后自噬体和自噬溶酶体数量增加(P0.01，P0.05)(图 5)。氯喹(chloroquine，CQ)是一种自噬抑制剂，能够抑制溶酶体的功能，进而抑制自噬溶酶体的降解发生。在加入 CQ 预处理后，再加入 BLM，自噬体的累积增加(P0.01)，但自噬 图 4 自噬在 BLM 诱导 A549 细胞损伤后的表达变化 Fig.4 Changes in autophagy expression after BLM-induced injury in A549 cells CON：对照组；BLM 24 h：博来霉素处理 24 h；BLM 48 h：博来霉素处理 48 h；以 GAPDH 为内参，与对照组相比较，*表示 P0.05。第5期 王棋文等:LRRC15 影响 A549 细胞自噬的作用研究 403 图 5 双荧光(GFP-RFP-LC3)法检测 BLM 损伤 A549 细胞后自噬流的变化 Fig.5 Changes in autophagic flow after BLM damage to A549 cells detected by dual fluorescence(GFP-RFP-LC3)assay CON：对照组；BLM：博来霉素处理组；CQ(氯喹)：氯喹处理组；BLM+CQ：博来霉素和氯喹处理；随机选择 5 个高倍视野，计数每个细胞合并图像中的黄色点数目(自噬体)和红色点数目(自噬溶酶体)，分析其表达变化；*代表 P0.05，*代表 P0.01。溶酶体的数量没有明显变化。因此结果表明，在应激条件下，BLM能够阻断A549细胞自噬流的发生。2.6 siLRRC15 处理 A549 细胞后对自噬的影响 LRRC15 干涉片段转乳 A549 细胞 48 h 后，利用免疫印迹实验方法检测 LC3、ATG5、ATG7、P62等自噬相关蛋白的表达变化，结果显示，与 NC 阴性对照组相比较，在 siLRRC15 处理组中 LC3、ATG5和 ATG7 均发生明显的表达上调，P62 蛋白表达下调(P0.05)(图6A)。同时用siLRRC15处理A549细胞后，转染 GFP-RFP-LC3 双荧光，激光共聚焦显微镜进一步检测自噬流的变化情况，结果显示，干涉 LRRC15 之后，自噬小体和自噬溶酶体数量增加(图 6B)。以上结果说明了干涉 LRRC15 能促进自噬过程的顺利进行。404 Hereditas(Beijing)2024 第 46 卷 图 6 LRRC15 siRNA 对 A549 细胞自噬的影响 Fig.6 Effects of LRRC15 siRNA on autophagy in A549 cells A：Western blot 检测自噬相关蛋白 LC3、ATG5、ATG7、P62 的表达变化及 LC3、ATG5、ATG7、P62 的相对定量分析，GAPDH 为内参，*表示 P0.05，*表示 P0.01。B：GFP-RFP-LC3 双荧光法检测自噬的变化。NC 代表阴性对照，siLRRC15 表示 LRRC15 的第 3 个 siRNA 片段。随机选择 5 个高倍视野，计数每个细胞合并图像中的黄色点数目(自噬体)和红色点数目(自噬溶酶体)，分析其表达变化；NC 代表阴性对照，siLRRC15 表示 LRRC15 的第 3 个 siRNA 片段；*代表 P0.05，*代表 P0.01。3 讨论 近年来随着人们生活水平的提高，衰老相关的疾病研究越来越引起人们的重视。IPF 是一种与年龄相关的间质性肺疾病，病因不明，死亡率高，多预后不良，迄今为止，其发病机制仍不清楚。最近的研究发现 IPF 是由于肺泡上皮再生失败和伤口愈合反应异常而引起的。在正常的肺损伤修复中，活化的基质成纤维细胞或肌成纤维细胞在由纤维状胶原和纤连蛋白组成的 ECM 中，可以促进肺泡上皮 II型细胞(AEC II)祖细胞的增殖和分化，进而修复受损和脱落的上皮细胞；相反，在遗传、环境等因素持续的作用下，慢性损伤和/或衰老会使破坏正常的上皮再生的机制，从而导致异常的间充质活化，产生 第5期 王棋文等:LRRC15 影响 A549 细胞自噬的作用研究 405 过量的 ECM，最终导致肺实质的异常重塑等12,13，这些研究为人们更好理解 IPF 的机制提供有意义的线索。本研究发现 LRRC15 在 BLM 损伤的小鼠肺组织和以 A549 细胞中表达上调，siLRRC15 后促使自噬过程的顺利进行。研究结果将为后续的研究提供技术支持和实验材料，同时也可为治疗 IPF 靶向药物的研发提供重要的理论依据。LRRC15 是 LRRC 超家族的成员之一，是 I 型跨膜蛋白，能与胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白相结合6。越来越多的研究证明 LRRC15 在多种类型肿瘤中高表达，特别是在乳腺癌和胰腺导管腺癌14,15。进一步研究发现在 OVCAR5 异种移植瘤的裸鼠中，阻断 LRRC15 的表达可能会降低致瘤性和肿瘤的转移性传播，抑制肿瘤的发生，说明 LRRC15 可能是潜在的候选抗肿瘤靶标9。在本研究同样发现，LRRC15 在 BLM 肺组织和 A549 中表达升高，表明LRRC15 可能是 IPF 中肺组织损伤的重要标记分子。并且结果还发现，在 A549 细胞中干涉 LRRC15 的表达，可以有效的促进 A549 细胞活性的增加，同时也可以部分恢复由 BLM 引起的 A549 细胞活性的降低。因此本研究进一步探究了 LRRC15 调节肺泡上细胞活性的机制。自噬是进化上保守的一种选择性和适应性反应，通过溶酶体途径降解受损细胞器，病原体等，在调控细胞损伤、老化和维护细胞内环境稳态中有重要作用。LC3 和 P62 是自噬标志蛋白。LC3 一般以LC3-I 和 LC3-II 两种形式存在，LC3-II 定位于自噬体膜。P62 是选择性自噬最重要的货车蛋白，它是连接 LC3-II 与待降解泛素化底物的桥梁，进入到自噬体后最终与溶酶体融合形成自噬溶酶体从而得到清除16,17。研究发现，自噬参与多种疾病的致病过程，自噬的环节异常都可导致纤维化疾病的发生，如肝纤维化、肾纤维化、心肌纤维化、肺纤维化等1820。在 IPF 中，自噬不足会加速上皮细胞的细胞衰老和增强成纤维细胞的分化21。Cabrera 等22发现，在Atg4b 自噬缺陷小鼠中，BLM 处理后引起了 II 型肺泡上皮细胞和细支气管上皮细胞大量的凋亡，小鼠肺组织表现出更广泛和严重的纤维化，胶原蛋白积累增加。作为机体的一种适应性反应，自噬对于维持成肺纤维细胞正常功能至关重要，在肺纤维化的条件下，抑制自噬会促进 ECM 的大量沉积，增加ROS 的产生，激活血小板来源的生长因子受体(PDGFR)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化23。有意思的是增强自噬和抗氧化剂处理可减少成纤维细胞的分化、增殖和纤维化形成23,24。本实验室余国营教授最近研究结果也表明，另一种潜在的自噬激活因子 T4在维持肺泡上皮细胞线粒体生物功能方面发挥着重要功能25。T4是一种 AMPK 的激活因子和mTOR 的抑制剂，研究发现碘代碘酮酶-2(DIO2)(促使 T4转化为 T3的一种酶)在 IPF 患者肺中的表达升高。在 BLM 和 TGF-诱导的两个肺纤维化模型中，Dio2 敲除小鼠的肺泡上皮细胞中线粒体凋亡明显增加，同时线粒体自噬水平降低，雾化 T3对小鼠 IPF具有明显的治疗作用25。上述研究说明了自噬在抑制 IPF 中发挥着重要作用。本研究发现 BLM 处理，促进了肺泡上皮细胞 A549 中的 LC3-II 表达增加，但有意思的是泛素化蛋白 P62 同时呈现表达增强的趋势。在加入 CQ 预处理后，自噬体的累积增加，但自噬溶酶体的数量没有明显变化。上述结果说明在 BLM 损伤的早期，细胞通过激活自噬发挥保护作用，但长时间的损伤会造成自噬溶酶体的降解受阻，反而会抑制自噬过程的顺利进行，最终导致细胞活性下降。相似的结果已有不少研究报道，Gui 等26对 IPF 患者组织切片进行了 P62 免疫组化反应，发现在 IPF 肺泡上皮细胞中 SQSTM1/P62 表达明显增加。在百草枯诱导的 IPF 患者肺组织中，Xu 等27发现自噬相关蛋白 Beclin 1、LC3 和 P62 都显著高表达，提示可能是自噬功能障碍引起。另外在体外研究中，赵新元等也发现，二氧化硅纳米颗粒诱导A549细胞损伤时，LC3-II和P62蛋白表达也增加28。上述研究为进一步阐明自噬调控 IPF 的机制提供了一定的理论依据。LRRC15 蛋白是 I 型单通道跨膜蛋白，能与胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白相结合。在成骨分化过程中，LRRC15 可以通过调节 p65 细胞质/核易位，促进间充质干细胞向成骨细胞分化29。本研究证实了 LRRC15 是细胞损伤的指示剂，在损伤过程中表达上调，会导致 A549 细胞活性下降。siLRRC15 后，从源头上促使自噬过程能顺利进行，更好的发挥了 406 Hereditas(Beijing)2024 第 46 卷 自噬的保护作用。以上结果说明 LRRC15 可能是自噬发挥作用的重要调节因子。下一步将深入研究LRRC15 引起的自噬和 BLM 诱导的自噬的关系，明确 BLM 处理 A549 细胞之后引起的 LRRC15 上调是直接参与此刻损伤的自噬调控还是通过旁路效应来发挥调节机制，并从体内水平进行验证，为阐明 IPF的机制提供必要的理论基础。参考文献(References):1 Lederer DJ,Martinez FJ.Idiopathic pulmonary fibrosis.N Engl J Med,2018,378(19):18111823.2 Miao Y,Li XH,Zhan YQ,Bai JK,Ma XY,Xi BR,Zhang JW,Zhou HG,Yang C.Research and development progress of antibody drugs for idiopathic pulmonary fibrosis.Acta Pharm 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