神经胶质瘤U251细胞中TRIM21和TRIM8之间相互作用研究.pdf

医学分子生物学杂志,2024,21(3):187-195 J Med Mol Biol,2024,21(3):187-195DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.03.001论 著:并列第一作者资助项目:国家自然科学基金(No.3120566,No.31370794)通讯作者:高波(电话:[phone],E-mail:),邵宁生(电话:[phone],E-mail:)These authors contributed equally to this work:WANG Lin,LIU XuemeiThis work was supported by grants from the National Natural Science Foundation of China(No.3120566,No.31370794)Corresponding author:GAO Bo(Tel:[phone],E-mail:gb5029 ),SHAO Ningsheng(Tel:[phone],E-mail:sha-oningsheng )神经胶质瘤 U251 细胞中 TRIM21 和 TRIM8 之间相互作用研究王琳,刘雪梅,李慧,黄皑雪,赵越超,肖参,高波,邵宁生军事科学院军事医学研究院军事认知与脑科学研究所 北京市,100850【摘要】目的 探讨 TRIM21 和 TRIM8 在神经胶质瘤 U251 细胞中的相互作用机制及其生物学效应。方法 在 U251 细胞中分别过表达和敲低 TRIM21 或 TRIM8,通过蛋白质印迹和 RT-PCR 法检测两者的蛋白和mRNA 表达水平。利用免疫荧光实验分析 TRIM21 和 TRIM8 的亚细胞定位。通过免疫共沉淀实验验证TRIM21 和 TRIM8 之间的相互作用。应用胞内泛素化实验检测 TRIM21 和 TRIM8 的泛素化修饰。蛋白酶体抑制剂 MG-132 用于抑制蛋白酶体活性。利用流式细胞术检测 U251 细胞凋亡。结果在 U251 细胞中,TRIM21 负向调控 TRIM8 蛋白水平,反之,TRIM8 也可以负向调控 TRIM21 蛋白水平,并且都能抑制细胞凋亡。机制研究显示,U251 细胞中 TRIM21 和 TRIM8 之间存在相互结合,两者相互调控是通过催化泛素化介导的泛素-蛋白酶体依赖性降解途径实现的。结论 U251 细胞中 TRIM21 与 TRIM8 可以通过泛素化修饰促进泛素-蛋白酶体依赖性的蛋白质降解相互负向调控,提示体内细胞正常生长分化需要 TRIM21-TRIM8 之间蛋白质水平的相对稳态,也即可能存在 E3 泛素连接酶蛋白稳态,稳态失衡可能与肿瘤的发生发展密切相关。【关键词】TRIM21;TRIM8;相互调控;泛素化;E3 稳态;胶质瘤【中图分类号】Q51,R753Study of Mutual Regulation between TRIM21 and TRIM8 in GliomaU251 CellsWANG Lin,LIU Xuemei,LI Hui,HUANG Aixue,ZHAO Yuechao,XIAO Can,GAO Bo,SHAO NingshengInstitute of Military Cognition and Brain Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Academyof Military Sciences,Beijing,100850,China【Abstract】ObjectiveTo explore the mutual regulation between TRIM21 and TRIM8 in gliomaU251 cells.Methods TRIM21 and TRIM8 were overexpressed or knocked down respectively in U251cells,and their protein and mRNA expression levels were detected by Western blotting and RT-PCR re-spectively.Immunofluorescence experiment was used to analyze the subcellular localization of TRIM21and TRIM8.The interaction between TRIM21 and TRIM8 was verified by immunoprecipitation experi-ment.The ubiquitination modification of TRIM21 or TRIM8 was analyzed by intracellular ubiquitinationexperiment.Protease inhibitor MG-132 was used to inhibit protease activity.U251 cell apoptosis was de-tected by flow cytometry assay.Results TRIM21 and TRIM8 could negatively regulate each other on theprotein level in U251 cells which resulted in cell apoptosis inhibition.Mechanism study showed that therewas an interaction between TRIM21 and TRIM8 in U251 cells,that interaction furtherly activated ubiq-uitin-proteasome-dependent degradation pathway through ubiquitination.Conclusion Negatively mutualregulation between TRIM21 and TRIM8 is achieved through ubiquitination modification,following ubiq-uitin-proteasome-dependent degradation.Our results suggested that it is important to maintain a balancebetween TRIM21 and TRIM8 on protein level,that is,three might exist an E3 ubiquitin ligase proteinhomeostasis.The homeostasis disorder will be highly related to the tumorigenesis.【Key words】TRIM21;TRIM8;mutual regulation;ubiquitination;E3 homeostasis;glioma 神经胶质瘤是颅内肿瘤中最常见的原发性恶性肿瘤,生长迅速,侵袭性强,患者的预后差。神经胶质瘤的基础研究及其治疗手段的探索一直是国内外学者研究的热点和难点问题。含有 3 部分基序(tripartite motif,TRIM)蛋白家族成员的特征是具有 3 元结构域结构,包括 N 端的 1 个 RING 锌指结构域、1 个或 2 个 B-box 结构域和 1 个卷曲螺旋结构域,以及可变的 C 端结构域。RING 结构域赋予E3 泛素连接酶活性,可变 C 端区域介导底物识别1,使 TRIM 蛋白能够泛素化底物。许多 TRIM家族 蛋 白 是 癌 症 发 生 发 展 的 重 要 调 节 因 子。TRIM21 和 TRIM8 在不同类型肿瘤中作用报道不一,参与调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等过程。有研究表明,TRIM21 的表达水平在脑胶质瘤组织中上调,通过调节细胞增殖、迁移和衰老促进肿瘤进展。TRIM8 在脑胶质瘤中下调参与细胞增殖并与患者生存有关。本实验室前期研究发现TRIM21-TRIM8 在肺细胞和肾细胞中存在相互调控并且共同影响细胞的干性,与非小细胞肺癌和肾细胞癌发生密切相关6,但是 TRIM21-TRIM8 之间的调控影响肿瘤的发生是否具有普遍性尚不清楚。本文选择神经胶质瘤 U251 细胞作为研究重点,进一步探讨 TRIM21-TRIM8 在神经胶质瘤细胞中的相互作用机制及其对细胞凋亡的影响,为阐明脑胶质瘤发生发展机制提供一定的理论依据。1 材料和方法1.1 细胞与细胞培养人神经胶质瘤细胞株 U251 购自武汉普诺赛生命科技有限公司,在 5%CO2,37 恒温培养箱(Thermo)中用含有 10%胎牛血清(Gibco)的MEM/EBSS 培养基(Hyclone)进行培养,待细胞密度达到 85%汇合度处于对数生长期后进行常规传代、冻存及后续实验,每 2 3 天换液。1.2 细胞转染使用 Lipofectamine 3000(Invitrogen)并按照其说明转染质粒,使用 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)并按照其说明转染 siRNA。TRIM21 和TRIM8 质粒均购自于北京义翘神州科技股份有限公司。TRIM21 表达敲低 siRNA 由苏州贝信生物技术有限公司合成,TRIM21 敲低靶序列:#1 是 5-GAGAAGTTGGAAGTGGAAATTGCAA-3;#2 是 5-GCGCTTTCTGCTCAAGAAT-3;#3 是 5-AAGTGG-AAATTGCAATAAA-3。TRIM8 表达敲低 siRNA 由广州锐博生物科技有限公司合成,TRIM8 敲低靶序列:#1 是 5-CCGCAAGATTCTCGTCTGT-3;#2是 5-GTGGACAACTGTTACTGTT-3;#3 是 5-TGA-ACGAAGTGGCCAAGAA-3。1.3 蛋白质提取细胞转染 48 h 后收取总蛋白。弃去原有培养基,PBS 清洗 2 遍。加入适量含有蛋白酶抑制剂Cocktail(Selleck)的冷裂解缓冲液(pH 7.5,50mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,5 mmol/LEDTA-2 Na,5 mmol/L 脱氧胆酸,1%TritonX-100)在冰上裂解细胞 30 min。在 4 下以 13 000r/min 离心 15 min,将上清液转移到另一个新 EP管中。1.4 蛋白质印迹(Western blotting)使用 BCA 试剂盒(康为世纪)对细胞总蛋白浓度进行定量,加入 5 蕈上样缓冲液,98 水浴加热10 min。进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 30 50 g/泳道的蛋白质,通过 eBlotTML1 快速湿转仪(金斯瑞)转膜,在室温下用含有 5%脱脂奶粉的0.1%TBS-T 封闭 1 h 后,条带置于相应的一抗中,于水平摇床 4 孵育过夜。次日用 0.1%TBS-T 洗涤 3 次,每次 10 min 后,将条带与相应二抗在室温下孵育 40 min,再次洗涤3 次,每次10 min。配置 ECL 显影液(Thermo)显影,化学发光成像系统(Clinx ChemiScope2850)扫描条带并储存分析。抗体信息如下:-actin(Abclonal,1 50 000),TRIM21(Proteintech,12 000),TRIM8(Proteintech,12 000),Ubiquitin(Proteintech,12 000)。1.5实时荧光定量 PCR(real time quantitative PCR,RT-PCR)使用 TRIzol 试剂(Life Technologies)提取细胞总 RNA。使用 ReverTra-Ace qPCR RT 试剂盒(TOYOBO)进行逆转录后,将得到的 cDNA 样品进行 RT-PCR。-actin 作为内参比较细胞中目的基因的 表 达。TRIM21 引 物:正 向 为 5-CAGCAG-CACGCTTGACAATGATG-3,反 向 为 5-GATGCT-CACAGGCTCCACGAAG-3;TRIM8 引物:正向为5-CGTGGAGATCCGAAGGAATGA-3,反 向 为 5-CAGGCGCTTGTCTGACTCG-3;-actin 引物:正向为 5-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3,反向为 5-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3。881王琳,等.神经胶质瘤 U251 细胞中 TRIM21 和 TRIM8 之间相互作用研究1.6 免疫共沉淀用适量含有蛋白酶抑制剂 Cocktail 的冷裂解缓冲液(pH 7.5,50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/LNaCl,1%TritonX-100)在冰上裂解细胞 30 min。在 4 下以 13 000 r/min 离心 15 min 后,取 1/10上清留作 input,其余与 TRIM21 或 TRIM8 抗体以及对应种属的对照 IgG 抗体混合,4 旋转孵育3 h后,加入适量 Protein A/G 磁珠(Bimake),4 旋转孵育过夜。次日用冷裂解缓冲液洗涤磁珠 4 次,每次 10 min。弃去洗涤液,加入 2 蕈上样缓冲液,98 水浴加热 10 min。取上清进行免疫印迹检测目的蛋白质。抗体信息如下:TRIM21(Proteintech,1200),TRIM8(Proteintech,1 200)和兔 IgG(Proteintech,1200)。1.7 免疫荧光为了检测 TRIM21 和 TRIM8 的亚细胞定位,将生长在爬片上的细胞在-20 下用甲醇固定 30min 后,在室温下用含有1%BSA 的0.1%TBS-T封闭 1 h。将细胞爬片与 TRIM21 和 TRIM8 抗体在4 下共同孵育过夜。次日用 0.1%TBS-T 洗涤 3次,每次10 min 后,将爬片与 Alexa Fluor 488 标记和 Alexa Fluor 594 标记的二抗在室温下共同孵育1 h,再次洗涤 3 次,每次 10 min。用 DAPI(So-larbio)对细胞核进行染色,0.1%TBS-T 洗涤后,封片。用蔡司 LSM880 激光共聚焦显微镜拍摄免疫荧光图像并储存分析。抗 体 信 息 如 下:TRIM21(Proteintech,1200),TRIM8(Proteintech,1200),Alexa Fluor488 标记二抗(ZSGB-Bio,1 200)和 Alexa Fluor594 标记二抗(ZSGB-Bio,1200)。1.8 胞内泛素化分析用适量含有蛋白酶抑制剂 Cocktail 的冷裂解缓冲液(pH 7.5,50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/LNaCl,5 mmol/L EDTA-2Na,5 mmol/L 脱氧胆酸钠,1%TritonX-100,0.2%SDS)在冰上裂解细胞 30 min。在 4 下以 13 000 r/min 离心 15 min后,取 1/10 上清留作 input,其余与对照 IgG 抗体混合,4 旋转结合1 h 后加入适量 Protein A/G 磁珠,4 旋转结合 2 h。弃去磁珠,上清液与TRIM21 或 TRIM8 抗体混合,4 旋转孵育 3 h 后,加入适量 Protein A/G 磁珠,4 旋转孵育过夜。次日用冷清洗液(pH 7.5,50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,1%TritonX-100)洗涤磁珠 4次,每次 10 min。弃去洗涤液,加入 2 蕈上样缓冲液,98 水浴加热 10 min。取上清进行免疫印迹检测目的蛋白质。1.9 流式细胞仪检测细胞凋亡U251 细胞转染质粒或 siRNAs 24 h 后,按照细胞凋亡检测试剂盒(DOJINDO)说明书进行流式细胞术实验。用凋亡标记物 Annexin V/PI 对单细胞悬液进行染色,并通过流式细胞仪(ACEA Bio-sciences)进行分析。Annexin V 单阳性细胞为早期凋亡细胞。PI/Annexin V 双阳性细胞为晚期凋亡细胞。凋亡细胞包括两种类型的染色细胞。1.10 统计学分析所有实验均重复 3 次以上,使用 GraphPad 8软件进行统计分析。两组比较采用独立样本非配对t 检验。多组间比较采用 One-way ANOVA 或 Two-way ANOVA 分析。数据采用平均数 标准差表示。P0.05 认为差异具有统计学意义。使用 Image J分析免疫印迹的条带图像。2 结 果2.1 U251 细胞中 TRIM21 在蛋白水平上负调节 TRIM8 表达在 U251 细胞中过表达 TRIM21(pL-TRIM21)后,通过蛋白质印迹检测 TRIM8 的蛋白水平,结果显示,过表达 TRIM21 显著降低了内源性 TRIM8蛋白水平(图 1A、B)。随后,转染 TRIM21-siR-NAs(siTRIM21s)进 U251 细胞,蛋白质印迹检测结果显示,3 条 siTRIM21s 敲低 TRIM21 表达后内源性 TRIM8 蛋白水平都显著提高(图 1C、D),选取 siTRIM21#1 进行后续实验。我们还通过 RT-PCR实验检测发现,过表达或敲低 TRIM21 都没有改变TRIM8 的 mRNA 水平(图 1E、F)。以上结果表明,TRIM21 只在蛋白水平上负向调控 TRIM8。2.2 U251 细胞中 TRIM8 在蛋白质水平上负调节 TRIM21表达 为了探究 TRIM8 的变化对 TRIM21 的表达是否有影响,我们将 TRIM8 的质粒(pL-TRIM8)和 TRIM8-siRNAs(siTRIM8s)转 染 进 U251 细胞。蛋白质印迹实验检测结果显示,TRIM8 过表达后内源性 TRIM21 蛋白水平显著降低(图 2A、B),敲低 TRIM8 表达后 siTRIM8#2 和 siTRIM8#3组细胞中内源性 TRIM21 蛋白水平均显著增加(图 2C、D),选取 siTRIM8#3 进行后续实验。进一步的 RT-PCR 实验检测结果显示,TRIM8 不能改变 TRIM21 的 mRNA 水平(图 2E、F)。以上结果 表 明,TRIM8 只 在 蛋 白 水 平 上 负 向 调 控TRIM21。981医学分子生物学杂志,2024,21(3):187-195 J Med Mol Biol,2024,21(3):187-195A:TRIM21 过表达和对照组 U251 细胞中 TRIM21 和 TRIM8 蛋白的蛋白质印迹条带;B:根据-actin 对 TRIM21和 TRIM8 的蛋白质印迹条带进行灰度值定量分析;C:TRIM21 敲低和对照组 U251 细胞中 TRIM21 和 TRIM8 蛋白的蛋白质印迹条带;D:根据-actin 对 TRIM21 和 TRIM8 的蛋白质印迹条带进行灰度值定量分析;E:TRIM21 过表达和对照组 U251 细胞中 TRIM21 和 TRIM8 基因表达水平的 RT-PCR 结果;F:TRIM21 敲低和对照组 U251 细胞中 TRIM21 和 TRIM8 基因表达水平的 RT-PCR 结果。vector:TRIM21 过表达对照组;siNC:TRIM21 表达敲低对照组。与过表达或敲低对照组比较,P0.05,P0.01,P0.001,ns 为无显著性。图 1 U251 细胞中 TRIM21 负调控 TRIM8 蛋白水平A:TRIM8 过表达和对照组 U251 细胞中 TRIM8 和 TRIM21 蛋白的蛋白质印迹条带;B:根据-actin 对 TRIM8 和TRIM21 的蛋白质印迹条带进行灰度值定量分析;C:TRIM8 敲低和对照组 U251 细胞中 TRIM8 和 TRIM21 蛋白的蛋白质印迹条带;D:根据-actin 对 TRIM8 和 TRIM21 的蛋白质印迹条带进行灰度值定量分析;E:TRIM8 过表达和对照组 U251 细胞中 TRIM8 和 TRIM21 基因表达水平的 RT-PCR 结果;F:TRIM8 敲低和对照组 U251 细胞中TRIM8 和 TRIM21 基因表达水平的 RT-PCR 结果。vector:TRIM8 过表达对照组;siNC:TRIM8 表达敲低对照组。与过表达或敲低对照组比较,P0.05,P0.01,P0.001,ns 为无显著性。图 2 U251 细胞中 TRIM8 负调控 TRIM21 蛋白水平091王琳,等.神经胶质瘤 U251 细胞中 TRIM21 和 TRIM8 之间相互作用研究2.3 TRIM21 与 TRIM8 存在相互作用为了进一步了解 TRIM21 和 TRIM8 之间的调节机制,我们首先进行了免疫荧光实验,结果发现TRIM21 与 TRIM8 在 U251 细胞的细胞质中共定位(图 3A)。接下来,我们进行免疫共沉淀实验分析TRIM21 和 TRIM8 之间的相互作用,结果发现U251 细 胞 中 过 表 达 的 TRIM21 可 以 与 内 源 性TRIM8 互作(图 3B)。同样,内源性 TRIM21 也能被过表达的 TRIM8 免疫沉淀(图 3C)。以上结果证明 TRIM21 与 TRIM8 存在相互作用。A:U251 细胞中 TRIM21 与 TRIM8 的免疫荧光共定位分析(50);B:使用 TRIM21 抗体免疫共沉淀后进行蛋白质印迹分析 TRIM21 过表达 U251 细胞中 TRIM21 和 TRIM8 之间的相互作用,兔 IgG 作为对照;C:使用 TRIM8 抗体免疫共沉淀后进行蛋白质印迹分析 TRIM8 过表达 U251 细胞中 TRIM21 和 TRIM8 之间的相互作用,兔 IgG 作为对照。图 3 U251 细胞中 TRIM21 和 TRIM8 相互作用2.4 TRIM21 可以催化 TRIM8 的泛素化修饰由于 TRIM21 具有 E3 泛素连接酶的活性7,我们进一步探讨 TRIM21 是否影响 TRIM8 的泛素化水平。在 U251 细胞中,转染 TRIM21 质粒及共转染 TRIM21 质粒和 siTRIM21#1 48 h 后,进行胞内泛素化实验。结果显示,TRIM21 过表达细胞中TRIM8 泛素化水平显著升高;在 TRIM21 过表达细胞中同时敲低 TRIM21 表达后,TRIM8 泛素化下降至正常水平(图 4A、B)。相反,在 U251 细胞中敲低 TRIM21 表达后,TRIM8 泛素化水平显著降低,而当与 TRIM21 质粒共表达时 TRIM8 泛素化回升至正常水平(图 4C、D)。以上结果证明,TRIM21 能够催化 TRIM8 的泛素化修饰。A:U251 细胞转染所示 TRIM21 质粒和 siRNA 后用 TRIM8 抗体进行免疫沉淀反应,然后利用蛋白质印迹检测细胞裂解物(Input)和免疫沉淀物(IP);B:根据 IP-TRIM8 对 IP-TRIM8-(Ub)n 的蛋白质印迹条带灰度值进行定量分析;C:U251 细胞转染所示 TRIM21 siRNA 和质粒后用 TRIM8 抗体进行免疫沉淀反应,然后利用蛋白质印迹检测细胞裂解物(Input)和免疫沉淀物(IP);D:根据 IP-TRIM8 对 IP-TRIM8-(Ub)n 的蛋白质印迹条带灰度值进行定量分析。VC:TRIM21 过表达对照组;siNC:TRIM21 表达敲低对照组。与 VC+siNC 组比较,P0.05,ns 为无显著性;与 pL-TRIM21+siNC 或 siTRIM21#1+VC 组比较,#P0.05,#P0.01。图 4 U251 细胞中 TRIM21 催化 TRIM8 泛素化191医学分子生物学杂志,2024,21(3):187-195 J Med Mol Biol,2024,21(3):187-1952.5 TRIM8 可以催化 TRIM21 的泛素化修饰TRIM8 被证明也是一种 E3 泛素连接酶,参与多种生物学途径。为进一步探究 TRIM8 对 TRIM21泛素化修饰的影响,我们检测了 TRIM8 过表达及TRIM8 质粒和 siTRIM8#3 共转染 U251 细胞中TRIM21 的泛素化水平。实验结果显示,TRIM8 过表达显著增加了 TRIM21 泛素化;共转染 TRIM8 质粒和 siTRIM8 时 TRIM21 泛素化较单独过表达TRIM8 时显著减少,且较对照组细胞无显著差异(图 5A、B)。相反,敲低 TRIM8 表达显著减少了TRIM21 泛素化,在敲低 TRIM8 表达的细胞中回转TRIM8 质粒后,TRIM21 泛素化明显增多且恢复正常水平(图 5C、D)。以上结果表明,TRIM8 靶向TRIM21 催化其泛素化修饰。A:U251 细胞转染所示 TRIM8 质粒和 siRNA 后用 TRIM21 抗体进行免疫沉淀反应,然后利用蛋白质印迹检测细胞裂解物(Input)和免疫沉淀物(IP);B:根据 IP-TRIM21 对 IP-TRIM21-(Ub)n 的蛋白质印迹条带灰度值进行定量分析;C:U251 细胞转染所示 TRIM8 siRNA 和质粒后用 TRIM21 抗体进行免疫沉淀反应,然后利用蛋白质印迹检测细胞裂解物(Input)和免疫沉淀物(IP);D:根据 IP-TRIM21 对 IP-TRIM21-(Ub)n 的蛋白质印迹条带灰度值进行定量分析。VC:TRIM8 过表达对照组;siNC:TRIM8 表达敲低对照组。与 VC+siNC 组比较,P0.05,ns 为无显著性;与 pL-TRIM8+siNC 组或 siTRIM8#3+VC 比较,#P0.05,#P0.01。图 5 U251 细胞中 TRIM8 催化 TRIM21 泛素化2.6 泛素化修饰的 TRIM21 和 TRIM8 通过泛素-蛋白酶体途径降解 MG-132 是一种有效的,可逆的蛋白酶体抑制剂,能够有效地阻断 26S 蛋白酶体复合物的蛋白水解活性,从而减少泛素标记蛋白的降解。为了确定TRIM21 和 TRIM8 介导的泛素化修饰是否激活泛素-蛋白酶体降解途径,我们在获取细胞总蛋白前 8 h用 MG-132 处理细胞。蛋白质印迹检测结果发现,MG-132 显著抑制了 U251 细胞中 TRIM21 过表达引起的 TRIM8 蛋白水平降低(图 6A)。同样的,MG-132 逆转了 TRIM8 过表达 U251 细胞中 TRIM21蛋白 水 平 的 降 低(图 6B)。以 上 结 果 表 明,TRIM21 和 TRIM8 都介导彼此通过泛素-蛋白酶体途径的降解。A:TRIM21 过表达的 U251 细胞用 MG-132(20 mol/L)处理 8 h 后的蛋白质印迹分析及 TRIM8 蛋白条带的灰度值分析结果。B:TRIM8 过表达的 U251 细胞用 MG-132(20 mol/L)处理 8 h 后的蛋白质印迹分析及 TRIM21 蛋白条带的灰度值分析结果。与 TRIM21 或 TRIM8 过表达组比较,P0.01,P0.001;与 TRIM21 过表达+MG-132 组或 TRIM8 过表达+MG-132 组比较,#P0.01,#P0.001。图 6 U251 细胞中 TRIM21 和 TRIM8 都介导通过泛素-蛋白酶体途径的降解291王琳,等.神经胶质瘤 U251 细胞中 TRIM21 和 TRIM8 之间相互作用研究2.7 TRIM21 和 TRIM8 相互调控的变化能够抑制神经胶质瘤 U251 细胞凋亡 我们前期研究结果发现 TRIM21 和 TRIM8 的相互调控会影响肺和肾肿瘤的发生6。为了进一步探究 TRIM21 和 TRIM8 相互作用对 U251 细胞的生物学影响,我们在 U251 细胞中分别敲低和过表达TRIM21 或 TRIM8 后,对细胞凋亡情况进行流式细胞术检测。实验结果发现,敲低 TRIM21 或 TRIM8 后U251 细胞的凋亡率显著降低(图 7A、B)。同样,过表达 TRIM21 或 TRIM8 后 U251 细胞的凋亡率也显著降低(图 7C)。A:TRIM21 敲低组 U251 细胞和对照组细胞凋亡的流式细胞术分析及细胞凋亡率的定量分析;B:TRIM8 敲低组U251 细胞和对照组细胞凋亡的流式细胞术分析及细胞凋亡率的定量分析;C:TRIM21 或 TRIM8 过表达组 U251细胞与对照组细胞凋亡的流式细胞术分析及细胞凋亡率的定量。siNC:表达敲低对照组;vector:过表达对照组。与过表达或敲低对照组比较,P0.05,P0.001。图 7 TRIM21 和 TRIM8 相互调控的变化抑制 U251 细胞凋亡3 讨论TRIM 蛋白家族,是 RING 型 E3 泛素连接酶的一个亚家族,介导众多蛋白质底物的泛素化并进而参与多种生物学过程,包括细胞内信号传导、凋亡、自噬和免疫等10。在酵母双杂交系统中描述了多种同源和异源 E3-RING 复合物的形成11。有证据表明,TRIM 蛋白之间能形成同源寡聚体或者异源寡聚体,这可能与泛素连接酶活性有关。我们前期研究首次发现肺细胞和肾细胞中 TRIM21 和TRIM8 存在相互调控6。本研究进一步发现,神经胶质瘤细胞中 TRIM21 和 TRIM8 也存在相互调节,通过催化泛素化修饰促进泛素-蛋白酶体依赖的蛋白质降解,二者失衡将抑制胶质瘤细胞的凋亡。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome sys-tem,UPS)通过改变 E3 泛素连接酶的稳定性调节许多癌蛋白和肿瘤抑制因子的行为。在癌症中,许多 TRIMs 转录和蛋白水平发生显著变化。目前的研究,大多仅关注单个 TRIM 蛋白在脑胶质瘤中的391医学分子生物学杂志,2024,21(3):187-195 J Med Mol Biol,2024,21(3):187-195表达及其潜在作用19。TRIM21 的表达水平在脑胶质瘤组织中上调并可调节鼠颅内 U87-MG 细胞异种移植瘤的生长。TRIM21 可泛素化介导 P21 蛋白质降解促进神经母细胞瘤细胞增殖21。TRIM8 在高级别脑胶质瘤中低表达,与患者不良预后相关。我们通过分析人类蛋白质图谱(the human protein at-las,HPA)数据库中脑胶质瘤的免疫组化染色数据,结果发现,与正常脑组织相比,TRIM21 在神经胶质瘤组织中高表达,而 TRIM8 低表达6,与本研究结论一致。本研究发现在神经胶质瘤 U251 细胞中 TRIM21和 TRIM8 存在相互调控,并且调控变化抑制细胞凋亡,提示 TRIM21-TRIM8 动态平衡异常可能与胶质瘤的发生发展密切相关。在真核细胞中,特定蛋白质的丰度是一个严格控制的过程,不同蛋白质质量控制途径用于维持蛋白质稳态22。UPS 是真核细胞中蛋白质降解的主要途径,广泛用于维持细胞稳态,控制特定调节蛋白的水平。相反,损害 UPS将引起蛋白质异常积累并破坏蛋白质胞内平衡。人类基因组编码大约 600 种不同的 E3 泛素连接酶24,它们构成 UPS 的一部分,决定了数千种底物的命运,我们推测众多 E3 蛋白之间也存在可能的稳态平衡,也即 E3 泛素连接酶蛋白稳态,E3 泛素连接酶蛋白稳态失衡与肿瘤发生发展密切相关。我们前期研究结果表明正常肺细胞和肾细胞中仅敲低 TRIM21 或 TRIM8 能增强细胞的干性6。本研究发现,敲低 TRIM21 或 TRIM8 都能抑制胶质瘤U251 细胞凋亡,或可能引起细胞干性增加。文献报道,TRIM21 是结直肠癌细胞干性的负调节因子。TRIM8 可以作为细胞干性的正调节或负调节因子。TRIM8 在绝大多数胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)中半合子缺失。因此,我们推断 TRIM21 和TRIM8 可能具有类似抑癌基因的功能维持细胞的干性,并且 TRIM21 与 TRIM8 之间存在蛋白质水平的稳态,TRIM21 或 TRIM8 的下调或功能性缺失可能是触发二者稳态失衡的主要原因,从而导致细胞干性增加,促进肿瘤发生,但具体机制还需要进一步研究。参考文献1 ESPOSITO D,KOLIOPOULOS M G,RITTINGER K.Struc-tural determinants of TRIM proteinfunctionJ.BiochemSoc Trans,2017,45(1):183-191.2 ALOMARI M.TRIM21-A potential novel therapeutic tar-get incancerJ.Pharmacol Res,2021,165:105443.3 HOSSEINALIZADEH H,MOHAMADZADEH O,KAHRI-ZI M S,et al.TRIM8:a double-edged sword in glioblasto-ma with the power to heal orhurtJ.Cell Mol Biol Lett,2023,28(1):6.4ZHAO Z,WANG Y,YUN D,et al.TRIM21 overexpres-sion promotes tumor progression by regulating cell prolif-eration,cell migration and cell senescence in human glio-maJ.Am J Cancer Res,2020,10(1):114-130.5 MICALE L,FUSCO C,FONTANA A,et al.TRIM8 down-regulation in glioma affects cell proliferation and it is as-sociated with patients survivalJ.BMC Cancer,2015,15:470.6WANG L,LI H,HUANG A,et al.Mutual regulation be-tween TRIM21 and TRIM8 via K48-linked ubiquitinationJ.Oncogene,2023,42(50):3708-3718.7 WADA K,KAMITANI T.Autoantigen Ro52 is an E3 ub-iquitinligaseJ.Biochem Biophys Res Commun,2006,339(1):415-421.8BHADURI U,MERLA G.Rise of TRIM8:Amolecule ofdualityJ.Mol Ther Nucleic Acids,2020,22:434-444.9 HUANG Y,YU Y,YANG Y,et al.Fish TRIM8 exerts an-tiviral roles through regulation of the proinflammatory fac-tors and interferonsignalingJ.Fish Shellfish Immunol,2016,54:435-444.10 HATAKEYAMA S.TRIM family proteins:Roles in auto-phagy,immunity,and carcinogenesisJ.Trends BiochemSci,2017,42(4):297-311.11 WOODSMITH J,JENN R C,SANDERSON C M.System-atic analysis of dimeric E3-RING interact